生物控制组合物的制作方法
本发明涉及新颖的桃色欧文氏菌(erwiniapersicina)菌株及含有它的组合物。还提供了使用所述新颖菌株和组合物对植物病原体进行生物控制的方法。
背景技术：
植物疾病代表了现代农业的重大经济成本。目前的农业系统通常需要大面积种植一种或几种作物或植物类型。这种生态不平衡的系统易患疾病。
传统上，通过使用化学农药来控制植物病原体。然而，消费者越来越关注化学残留物及其对动物和植物健康和环境的影响。此外，许多植物病原体变得对可用的农药具有抗性。
生物控制代表控制植物疾病的一种替代方法，其减少对化学品的依赖。这类“自然”方法享有更大的公众接受度，并且可能比化学控制方法更加有效和可持续。
虽然已经研究了包括细菌、酵母和真菌的多种生物控制剂用于控制植物疾病，但必须仔细筛选与其建议用途相关的一系列性状。这些性状包括植物致病性、拮抗活性和特异性、在递送系统和制剂中的操作的适应性，以及在目标植物的波动的田间条件下的表现。在田间的建立和表现通常是最难克服的难题。
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xanthomonascampestrispv.campestris)(xcc)是芸苔中黑腐病的致病因子。黑腐病是一种种子传播的疾病，并且在凉爽潮湿的条件下，xcc可通过种子作物无症状地传播以感染种子(rimmer等人，2007)。种子被认为是病原体接种物的主要来源。种子感染水平低至0.05％即可导致黑腐病的田间流行(schaad等人，1980)。
因此，本发明的一个目的是提供可用作十字花科(brassicaceae)的生物控制剂和/或生长促进剂的新颖的桃色欧文氏菌菌株。另一个目的是提供一种组合物，其包含至少一种本发明的新颖的桃色欧文氏菌菌株；和/或至少为公众提供有用的选择。
技术实现要素：
申请人的发明提供了许多新的桃色欧文氏菌菌株，其在十字花科中作为生物控制剂和/或生长促进剂是高效的。
据申请人所知，这些是被分离出具有抗十字花科物种的任何病原体活性的最早的桃色欧文氏菌菌株，也是被分离出具有抗任何黄单胞菌属(xanthomonas)物种活性的最早的桃色欧文氏菌菌株。令人惊讶的是，桃色欧文氏菌菌株具有针对多种植物病原体的生物控制活性。
产品
菌株
在一个方面，本发明提供了一种分离的桃色欧文氏菌菌株，其具有针对以下至少一种的活性：
a)至少一种黄单胞菌属物种，和
b)至少一种十字花科病原体。
在一个实施方案中，所述至少一种十字花科病原体是黄单胞菌属物种。
在一个实施方案中，所述至少一种黄单胞菌属物种在植物物种中引起黑腐病。
在一个实施方案中，所述至少一种黄单胞菌属物种在十字花科植物物种中引起黑腐病。
在一个实施方案中，所述至少一种黄单胞菌属物种是野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)。
在另一个实施方案中，所述至少一种黄单胞菌属物种是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种。
在一个实施方案中，所述十字花科来自芸苔(brassica)属。优选的芸苔属物种包括甘蓝(b.oleracea)和芜菁(b.rapa)。
在一个实施方案中，桃色欧文氏菌菌株为生物学纯培养物的形式。
分离的桃色欧文氏菌菌株或生物学纯培养物可选自如下保藏的菌株中的任何一种：
a)dsm32302，
b)dsm32304，
c)dsm32305，和
d)dsm32303。
在另一方面，本发明提供了一种作为dsm32302保藏的桃色欧文氏菌菌株的生物学纯培养物。
在另一方面，本发明提供了一种作为dsm32304保藏的桃色欧文氏菌菌株的生物学纯培养物。
在另一方面，本发明提供了一种作为dsm32305保藏的桃色欧文氏菌菌株的生物学纯培养物。
在另一方面，本发明提供了一种作为dsm32303保藏的桃色欧文氏菌菌株的生物学纯培养物。
组合物
在另一方面，本发明提供了一种包含至少一种本发明的桃色欧文氏菌菌株的组合物。
在一个实施方案中，所述组合物包含所述所述菌株和以下至少一种：
a)载体，
b)稀释剂，和
c)佐剂。
在一个实施方案中，载体是农业上可接受的载体。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含选自保藏为以下的那些的一种或多种桃色欧文氏菌菌株：
a)dsm32302，
b)dsm32304，
c)dsm32305，和
d)dsm32303，
和以下至少一种：
i)载体，
ii)稀释剂，和
iii)佐剂。
在一个实施方案中，载体是农业上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种本发明的桃色欧文氏菌菌株。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少三种本发明的桃色欧文氏菌菌株。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少四种本发明的桃色欧文氏菌菌株。
在一个实施方案中，所述组合物是杀菌组合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物被配制成种子包衣。
在另一个实施方案中，所述组合物为丸粒或颗粒的形式。
在一个实施方案中，所述组合物是以下至少一种：
(a)生物控制组合物，和
(b)植物生长促进组合物。
在一个实施方案中，组合物中的菌株是活的或有活力的。
在另一个实施方案中，组合物中的菌株是冷冻干燥的或冻干的。
在另一个实施方案中，组合物中的菌株是死的或无活力的。
植物/植物部分与组合物组合
在另一方面，本发明提供了一种与本发明组合物相连的植物或其部分。
在一个实施方案中，作为用所述组合物来施用、喷雾、生物引发(bio-priming)或涂覆植物或其部分的结果，所述植物或其部分与所述组合物相连。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用本发明组合物涂覆的种子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用本发明菌株涂覆的种子。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用本发明的组合物生物引发的种子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用本发明的菌株生物引发的种子。
方法
在另一方面，本发明提供了一种用于控制以下至少一种的方法：
a)至少一种十字花科病原体，和
b)至少一种黄单胞菌属物种，
所述方法包括使所述至少一种十字花科病原体或所述至少一种黄单胞菌属物种与本发明的菌株或组合物接触。
在另一方面，本发明提供了一种用于以下至少一种的方法：
a)在植物、植物部分、种子或土壤上或在植物、植物部分、种子或土壤中控制至少一种十字花科病原体；
b)在植物、植物部分、种子或土壤上或在植物、植物部分、种子或土壤中控制至少一种黄单胞菌属物种；和
c)促进十字花科植物的生长；
所述方法包括将所述至少一种菌株或组合物施用至所述植物、植物部分、种子或土壤。
在一个实施方案中，所述菌株或组合物具有控制所述至少一种十字花科病原体或至少一种黄单胞菌属物种的直接作用。
在另一个实施方案中，所述菌株或组合物影响植物、植物部分或种子中诱导的系统抗性，以控制所述至少一种十字花科病原体或至少一种黄单胞菌属物种。
优选地，所述至少一种植物病原体选自黄单胞菌属物种。更优选地，所述黄单胞菌属物种是野油菜黄单胞菌。最优选地，所述黄单胞菌属物种引起黑腐病(野油菜黄单胞菌野油菜致病变种)。
优选地，所述植物、植物部分或种子来自十字花科植物。
在一个实施方案中，所述十字花科植物来自芸苔属。优选的芸苔属物种包括甘蓝和芜菁。
在一个实施方案中，在种植种子之前将所述至少一种菌株或组合物施用于种孔。然后当种子种植在种孔中时，种子接触所述至少一种菌株或组合物。
在一个优选的实施方案中，在种植之前将所述至少一种菌株或组合物施用至植物的种子。
在一个更优选的实施方案中，将所述至少一种菌株或组合物以种子包衣的形式施用至种子。
在另一个优选的实施方案中，通过生物引发将所述至少一种菌株或组合物施用至种子。
在另一方面，本发明提供了一种用至少一种本发明的菌株或组合物接种植物或植物部分的方法，所述方法包括使所述植物或植物部分与至少一种本发明的菌株或组合物接触。
在一个实施方案中，所述植物部分是种子。
在另一个实施方案中，所述种子用所述至少一种本发明的菌株或组合物涂覆。
在另一个实施方案中，所述种子用所述至少一种本发明的菌株或组合物进行生物引发。
在另一个实施方案中，通过使所述种子与液体形式的本发明组合物接触来对所述种子进行生物引发。
在另一个实施方案中，所述植物或植物部分通过从另一植物水平传播至少一种本发明的菌株来接种，所述另一植物先前已用至少一种本发明的菌株或组合物接种。
在另一方面，本发明提供了一种用于产生接种有至少一种本发明的菌株或组合物的植物或植物部分的方法，所述方法包括使所述植物或植物部分与至少一种本发明的菌株或组合物接触。
在一个实施方案中，所述植物部分是种子。
在另一个实施方案中，通过用至少一种本发明的菌株或组合物涂覆种子来产生被接种的种子。
在另一个实施方案中，通过用至少一种本发明的菌株或组合物生物引发种子来产生被接种的种子。
在另一个实施方案中，通过使种子与液体形式的至少一种本发明的组合物接触来生物引发被接种的种子。
在另一个实施方案中，被接种的植物或植物部分通过从另一植物水平传播至少一种本发明的菌株来接种，所述另一植物先前已用至少一种本发明的菌株或组合物接种。
在另一个实施方案中，被接种的植物或植物部分作为另一植物的繁殖体或后代来产生，所述另一植物先前已用至少一种本发明的菌株或组合物接种。在此实施方案中，由于至少一种本发明的菌株从所述另一植物垂直传播到所述繁殖体或后代，从而所述繁殖体或后代植物被接种。在一个优选的实施方案中，被接种的繁殖体是被接种的种子。
优选地，被接种的植物或植物部分比未接种的植物或植物部分对以下更具抗性：
a)至少一种十字花科病原体，和
b)至少一种黄单胞菌属物种。
优选地，所述至少一种植物病原体选自黄单胞菌属物种。更优选地，所述黄单胞菌属物种是野油菜黄单胞菌。最优选地，所述黄单胞菌属物种引起黑腐病(野油菜黄单胞菌野油菜致病变种)。
优选地，所述植物、植物部分或种子来自十字花科植物。
在一个实施方案中，所述十字花科植物来自芸苔属。优选的芸苔属物种包括甘蓝和芜菁。
定义
如本文所用的术语“接触”是指以可用于影响植物病原体控制的方式向植物提供本发明的组合物或菌株。
术语“控制(control)”、“控制(controlling)”、“生物控制(biocontrol)”或“生物控制(biologicalcontrol)”在本文中可互换使用，是指使用本发明的菌株或组合物实现的病原体、特别是种子传播的病原体的数量减少。通常理解的是疾病发生率或严重程度的降低，或传播速率的抑制。传播包括垂直传播和水平传播。
术语“活性”或“生物活性”意指能够进行如上定义的“控制”。
术语“接种(inoculate)”或“接种(inoculating)”是指使植物或其部分与本发明的菌株或组合物接触。接种后，本发明的菌株或本发明的组合物可以保留在以下至少一种之上、生长在以下至少一种之上或定殖以下至少一种：
a)植物或植物部分的表面，
b)植物或植物部分的内部，
c)植物的根际，
d)从植物部分长出的植物的根际。
术语“植物部分”包括植物的任何部分。优选的植物部分包括繁殖体。
术语“繁殖体”是指可用于有性或无性生殖或繁殖的植物的任何部分，包括种子和插条。优选的繁殖体是种子。
术语“生物引发(bio-prime)”或“生物引发(bio-priming)”是本领域技术人员众所周知的。生物引发是一种生物种子处理的过程，其涉及种子水合(疾病控制的生理方面)与用有益生物体接种种子(疾病控制的生物学方面)的组合，以保护种子或由种子产生的植物(nayaka等人，2008；reddy2013)。实施例4中还举例说明了生物引发。
术语“水平传播”是指将生物体(例如本发明的菌株)从一个植物转移到另一个植物。
术语“垂直传播”是指将生物体(例如本发明的菌株)从一个植物转移至同一植物的繁殖体或后代。
术语“根际”是指植物根部附近的土壤区域，其中的化学和微生物学受植物根部的生长、呼吸和营养交换的影响。
本说明书中使用的术语“包含”是指“至少部分地由......组成”。当解释本说明书中包括术语“包含”的每个陈述时，也可以存在不同于以该术语为引言的一个或多个特征的特征。诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”的相关术语，以及术语“包括(including)”、“包括(include)”和“包括(includes)”将以相同的方式解释。
当在本说明书中使用时，术语“基本上由......组成”是指所说明的特征并且允许存在不会实质上改变所指定特征的基本特征的其他特征。
术语“农业上可接受的载体”涵盖本领域已知的所有液体和固体载体，例如水和油，以及通常已知用于制备控制组合物(包括杀菌组合物)的佐剂、分散剂、粘合剂、润湿剂、表面活性剂、保湿剂、增粘剂、填充剂、保护剂等。
本文所用的术语“有效量”是指可有效控制或根除根据本发明的植物病原体的量。
如本文所用的术语“生物学纯培养物”或“生物学纯分离物”是指本发明的桃色欧文氏菌菌株的培养物，其包含至少90％、优选95％、优选99％并且更优选至少99.5％的桃色欧文氏菌菌株的细胞。
如本文所用的术语“植物病原体”是指对植物造成麻烦的生物体。在一个实施方案中，该术语是指对植物造成损害的生物体。所述损害可能与植物健康、生长、产量、生殖或生存能力有关，并且可能是化妆品损害。优选地，所述损坏具有商业意义。优选地，所述植物是栽培植物。
如本文所用的术语“十字花科病原体”是指芸苔属植物物种的植物病原体。
具体实施方式
产品
菌株
桃色欧文氏菌(erwiniapersicina)是一种革兰氏阴性细菌，从各种水果和蔬菜中分离出来后由hao等人(1990)首次描述(以前的名称为桃色欧文氏菌(erwiniapersicinus))。桃色欧文氏菌(erwiniapersicinus)于1998年更名为桃色欧文氏菌(erwiniapersicina)。
令人惊讶的是，申请人现已鉴定出具有抗多种植物病原体活性的桃色欧文氏菌菌株。
据申请人所知，这些是被分离出具有抗十字花科物种的任何病原体活性的最早的桃色欧文氏菌菌株，也是被分离出具有抗任何黄单胞菌属物种活性的最早的桃色欧文氏菌菌株。
因此，在一个方面，本发明提供了一种具有抗至少一种黄单胞菌属物种的活性的分离的桃色欧文氏菌菌株。另一方面，本发明提供了一种具有抗至少一种十字花科病原体的活性的分离的桃色欧文氏菌菌株。
申请人的发明还提供了桃色欧文氏菌菌株促进十字花科植物的生长。
特别地，从在新西兰和英国生长的芸苔属作物中分离出细菌桃色欧文氏菌的四种菌株，其显示出抗(由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种引起的)黑腐病的活性。
根据用于专利程序的布达佩斯条约，这四种新的桃色欧文氏菌菌株已全部保藏在莱布尼茨研究所dsmz-德国微生物保藏中心(leibniz-institutdsmz-deutschsammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh),英豪丰大街7b，布伦瑞克38124，德国(inhoffenstraβe7b,38124braunschweig,germany)。如下表所示，分离株已获得保藏编号：
保藏受理通知和存活证明附于此处。
用于获得分离株的分离和选择方法及其生长特征的细节在实施例中列出。
申请人首次提供了以分离形式作为dsm32302、dsm32304、dsm32305和dsm32303保藏的桃色欧文氏菌菌株。
因此，在一个方面，本发明提供了作为dsm32302保藏的桃色欧文氏菌。
另一方面，本发明提供了作为dsm32304保藏的桃色欧文氏菌。
另一方面，本发明提供了作为dsm32305保藏的桃色欧文氏菌。
另一方面，本发明提供了作为dsm32303保藏的桃色欧文氏菌。
在一个实施方案中，分离本发明的桃色欧文氏菌菌株。优选地，所述菌株以生物学纯培养物的形式提供。
本发明的菌株已证明具有抗多种植物病原体(包括引起黑腐病的病原体)的活性。这四种菌株是所提供显示这种活性的最早的桃色欧文氏菌菌株。
黑腐病是一种特别成问题的病原体，其在新西兰和世界其他地区引起芸苔生产的一系列问题。
在一个实施方案中，本发明的分离的桃色欧文氏菌菌株具有抗至少一种黄单胞菌属物种的活性。
在一个实施方案中，本发明的分离的桃色欧文氏菌菌株具有抗至少一种十字花科病原体的活性。
如本文所用的术语“十字花科病原体”是指十字花科植物物种的病原体。
在一个实施方案中，所述十字花科病原体是黄单胞菌属物种。
优选的黄单胞菌属物种包括野油菜黄单胞菌畸变致病变种(xanthomonascampestrispathovar(pv.)aberrans)、野油菜黄单胞菌假辣根变种(xanthomonascampestrispv.armoraciae)、野油菜黄单胞菌山芥致病变种(xanthomonascampestrispv.barbareae)、野油菜黄单胞菌紫罗兰致病变种(xanthomonascampestrispv.incanae)和野油菜黄单胞菌萝卜致病变种(xanthomonascampestrispv.raphani)。
优选的黄单胞菌属物种还包括除芸苔属之外的物种的野油菜黄单胞菌致病变种。此类致病变种在万维网上描述(参见例如http://www[dot]cabi[dot]org/cpc/search/？q＝xanthomonas+campestris)。
更优选地，所述黄单胞菌属物种是引起黑腐病的物种。优选地，所述黄单胞菌属物种是野油菜黄单胞菌。最优选的致病变种是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种。
组合物
本发明还提供了包含至少一种本发明的桃色欧文氏菌菌株和农业上可接受的载体的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含至少一种选自保藏为以下的那些的桃色欧文氏菌菌株：
a)桃色欧文氏菌dsm32302，
b)桃色欧文氏菌dsm32304，
c)桃色欧文氏菌dsm32305和
d)桃色欧文氏菌dsm32303，
和至少一种农业上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
所述组合物可包括本发明的桃色欧文氏菌的任何两种或更多种菌株的组合。
本发明的菌株以有效控制目标病原体的量存在于组合物中。有效浓度可以根据以下因素变化：使用的桃色欧文氏菌的形式、组合物欲施用的环境、病原体感染的类型、浓度和程度；温度；季节；湿度；植物生长季节中的阶段；植物年龄；施用方法、施用比率和施用频率；施用的常规杀真菌剂、农药等的数量和类型，以及植物处理(例如修枝、放牧和灌溉)。在配制所述组合物时可以考虑所有因素。
本发明的组合物可以通过将一种或多种本发明的桃色欧文氏菌菌株与至少一种农业载体、稀释剂和/或佐剂混合来制备。
组合物中的桃色欧文氏菌可以被配制成细胞悬浮液。
可以使用本领域已知的标准技术制备用于组合物中的桃色欧文氏菌。生长通常在生物反应器中在有氧条件下在适合于生长的温度和ph下进行。典型的生长温度为15℃至37℃，通常为27℃至32℃。
生长培养基可以是适合于桃色欧文氏菌培养的任何已知技术的培养基。例如营养琼脂(na)或luria-bertani肉汤(lb)。
可以使用常规洗涤、过滤或沉淀技术(例如离心)收获菌株，或者可以使用旋风系统收获菌株。收获的细胞可以立即使用或在冷冻条件下储存(例如在-80℃下在25％(v/v)甘油中)或可以冷冻干燥。
本发明的组合物可包括保湿剂、铺展剂(spreader)、成膜剂(sticker)、稳定剂、渗透剂、乳化剂、分散剂、表面活性剂、缓冲剂、粘合剂、保护剂、填充剂和通常用于已知技术农业或控制组合物中的其他组分。
本发明的组合物可以是液体或固体形式。液体组合物通常包括水、盐水或油，例如植物油或矿物油。
组合物可以是喷雾剂、悬浮液、浓缩物、泡沫、浸液(drench)、浆液、注射剂、凝胶、浸渍剂(dip)、糊剂等形式。
液体组合物可以通过将农业上可接受的液体载体与桃色欧文氏菌细胞混合来制备。常规配制技术可用于生产液体组合物。
在一个实施方案中，组合物为固体形式。可以通过干燥本发明的液体组合物来生产组合物。或者，可以通过将本发明的桃色欧文氏菌细胞与多种无机或生物材料混合来制备可用于本发明的固体组合物。例如，固体无机农业载体可包括碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或硅酸盐、浮石、石灰、膨润土或其混合物。
组合物可以配制成粉剂、颗粒、丸剂、种子包衣、可湿性粉剂等。可在施用前配制组合物以提供液体组合物。
本发明的组合物可以是控释或持续释放制剂的形式。
本发明的组合物还可包括其他控制剂，例如农药、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀病毒剂、生长促进剂、营养素、发芽促进剂等。优选地，所述其他控制剂与本发明的桃色欧文氏菌菌株的功能是相容的。
在直接使用本发明的菌株的情况下，应用上文讨论的相同的菌株组合、制备和应用标准。
本发明的菌株/组合物可以有利地冷冻干燥。冷冻干燥细菌细胞的方法是本领域已知的。示例性方法包括leslie等人(1995)的方法。
申请人的数据表明，当冷冻干燥时，桃色欧文氏菌菌株和组合物更稳定。这在实施例14中得到证实。
申请人的数据表明，当用作种子包衣或通过生物引发时，桃色欧文氏菌菌株和组合物是最有效的。
种子涂覆组合物和方法是本领域技术人员众所周知的。根据本发明可以使用任何种子涂覆方法。通常，通过将已知量的生物活性化合物悬浮在水中来制备种子包衣组合物的溶液。
然后将其与成膜剂例如peridiam(拜耳)混合。如果需要，可以加入其他载体、稀释剂或佐剂以形成本发明的种子包衣组合物的溶液。在一个实施方案中，所述种子包衣组合物可包括染料。然后将种子与种子包衣组合物溶液混合以在种子上形成包衣。然后将种子干燥，从而形成组合物的固体包衣。
本领域技术人员将理解，所述过程可以是重复的，从而允许将多个包衣施用到种子上。类似地，应当理解，附加包衣不限于本发明的组合物，而是可以包括广泛用于种子包衣中的任何化合物，例如杀虫剂、肥料、杀真菌剂、杀霉剂、杀生物剂和用于种子鉴定的着色剂。同样地，本发明的包衣可以施用到已经带有另一种或其他包衣的种子上。
每种包衣可以使用根据本发明的不同涂覆组合物。
用于生产用本发明的菌株/组合物涂覆的种子的示例性方法包括us20100266560和wo2009061221a3中描述的那些。
方法
另一方面，本发明还提供了一种用于以下至少一种的方法：
a)控制种子上、植物上、植物部分上和/或土壤中的至少一种十字花科病原体；
b)控制种子上、植物上、植物部分上和/或土壤中的至少一种黄单胞菌属物种；和/或
c)促进十字花科植物生长；
所述方法包括使所述种子、植物、植物部分和/或土壤与根据本发明的组合物或一种或多种根据本发明的桃色欧文氏菌菌株接触。
喷雾、喷粉、浸土、种子涂覆、生物引发、叶面喷雾、雾化、成雾和熏蒸都是可能的施用技术。
在一个实施方案中，本发明的组合物或菌株施用于以下至少一种：
a)种子，
b)叶子，
c)花序，
d)生长介质，和
e)种植种子之前的播种孔。
生长介质可以是土壤或盆栽混合物(pottingmix)。
施用可能只是一次或根据需要重复。还考虑了在植物生命周期中的不同时间施用。例如，先对种子施用，然后在移植物培育(transplantraising)期间对叶面施用。
用本发明的菌株或组合物进行种子涂覆或生物引发可以与其他物理或化学种子处理组合。此类种子处理包括蒸汽处理、热水处理、引发、杀真菌剂种子处理和杀虫剂种子处理。
病原体
在一个实施方案中，至少一种植物病原体选自黄单胞菌属物种。优选的黄单胞菌属物种包括野油菜黄单胞菌。在一个实施方案中，所述黄单胞菌属物种是黑腐病野油菜黄单胞菌野油菜致病变种。
可以使用本发明的组合物处理多种植物。此类植物包括谷类、蔬菜和可耕作物、草、草坪、牧场、果树和观赏树木和植物。
优选的植物物种是来自十字花科的那些。
优选的十字花科的属包括：岩芥菜属(aethionema)、agallis、葱芥属(alliaria)、alyssoides、alyssopsis、庭荠属(alyssum)、ammosperma、含生草属(anastatica)、anchonium、andrzeiowskia、anelsonia、寒原荠属(aphragmus)、aplanodes、arabidella、鼠耳芥属(arabidopsis)、南芥属(arabis)、arcyosperma、辣根属(armoracia)、aschersoniodoxa、asperuginoides、asta、异药芥属(atelanthera)、athysanus、紫芥菜属(aubrieta)、aurinia、ballantinia、山芥属(barbarea)、beringia、团扇荠属(berteroa)、锥果芥属(berteroella)、biscutella、bivonaea、blennodia、boechera、boleum、boreava、bornmuellera、borodinia、botscantzevia、brachycarpaea、芸苔属(brassica)、肉叶荠属(braya)、brayopsis、brossardia、匙荠属(bunias)、cakile、calepina、calymmatium、亚麻荠属(camelina)、camelinopsis、capsella、碎米荠属(cardamine)、cardaminopsis、群心菜属(cardaria)、carinavalva、carrichtera、catadysia、catenulina、caulanthus、caulostramina、ceratocnemum、ceriosperma、chalcanthus、chamira、chartoloma、cheesemania、桂竹香属(cheiranthus)、chlorocrambe、离子芥属(chorispora)、高原芥属(christolea)、chrysobraya、chrysochamela、对枝芥属(cithareloma)、clastopus、香芥属(clausia)、clypeola、岩荠属(cochlearia)、穴丝荠属(coelonema)、coincya、coluteocarpus、肋果芥属(conringia)、cordylocarpus、臭荠属(coronopus)、两节荠属(crambe)、crambella、cremolobus、须弥芥属(crucihimalaya)、隐子芥属(cryptospora)、cuphonotus、cusickiella、cycloptychis、cymatocarpus、cyphocardamum、dactylocardamum、degenia、delpinophytum、播娘蒿属(descurainia)、diceratella、dichasianthus、dictyophragmus、didesmus、didymophysa、dielsiocharis、双脊荠属(dilophia)、dimorphocarpa、二行芥属(diplotaxis)、蛇头荠属(dipoma)、异果芥属(diptychocarpus)、dithyrea、dolichirhynchus、花旗杆属(dontostemon)、douepea、葶苈属(draba)、drabastrum、drabopsis、dryopetalon、eigia、elburzia、enarthrocarpus、englerocharis、eremobium、eremoblastus、eremodraba、eremophyton、ermania、ermaniopsis、erophila、芝麻菜属(eruca)、erucaria、erucastrum、糖芥属(erysimum)、乌头荠属(euclidium)、eudema、山萮菜属(eutrema)、euzomodendron、farsetia、fezia、菲比芥属(fibigia)、foleyola、fortuynia、翅籽荠属(galitzkya)、geococcus、glaribraya、glastaria、glaucocarpum、四棱芥属(goldbachia)、gorodkovia、graellsia、grammosperma、guillenia、guiraoa、gynophorea、halimolobos、harmsiodoxa、藏荠属(hedinia)、heldreichia、heliophila、hemicrambe、半脊荠属(hemilophia)、香花芥属(hesperis)、heterodraba、hirschfeldia、hollermayera、hormathophylla、薄果荠属(hornungia)、hornwoodia、hugueninia、薄果荠属(hymenolobus)、ianhedgea、屈曲花属(iberis)、idahoa、iodanthus、ionopsidium、irenepharsus、菘蓝属(isatis)、ischnocarpus、iskandera、iti、依瓦芥属(ivania)、jundzillia、kernera、kremeriella、lachnocapsa、绵果荠属(lachnoloma)、leavenworthia、独荇菜属(lepidium)、鳞蕊芥属(lepidostemon)、丝叶芥属(leptaleum)、弯梗芥属(lignariella)、lithodraba、香雪球属(lobularia)、lonchophora、弯蕊芥属(loxostemon)、缎花属(lunaria)、lyocarpus、lyrocarpa、长柄芥属(macropodium)、涩荠属(malcolmia)、mancoa、maresia、mathewsia、紫罗兰属(matthiola)、高河菜属(megacarpaea)、双果荠属(megadenia)、menkea、menonvillea、microlepidium、microsysymbrium、小柱芥属(microstigma)、morettia、moricandia、moriera、morisia、murbeckiella、muricaria、myagrum、nasturtiopsis、豆瓣菜属(nasturtium)、堇叶芥属(neomartinella)、neotchihatchewia、新念珠芥属(neotorularia)、nerisyrenia、球果荠属(neslia)、nesocrambe、neuontobotrys、notoceras、菥蓂属(notothlaspi)、ochthodium、octoceras、无苞芥属(olimarabidopsis)、onuris、爪花芥属(oreoloma)、oreophyton、ornithocarpa、诸葛菜属(orychophragmus)、otocarpus、oudneya、pachycladon、pachymitus、pachyphragma、厚壁荠属(pachypterygium)、parlatoria、parodiodoxa、parolinia、条果芥属(parrya)、腋花芥属(parryodes)、paysonia、单花荠属(pegaeophyton)、peltaria、peltariopsis、pennellia、petiniotia、petrocallis、petrocallis、petroravenia、phlebolobium、phlegmatospermum、phoenicaulis、physaria、physocardamum、physoptychis、physorrhynchus、宽框荠属(platycraspedum)、polyctenium、polypsecadium、pringlea、prionotrichon、pritzelago、pseuderucaria、假鼠耳芥属(pseudoarabidopsis)、假亚麻荠属(pseudocamelina)、假香芥属(pseudoclausia)、pseudofortuynia、pseudovesicaria、psychine、pterygiosperma、pterygostemon、沙芥属(pugionium)、假簇芥属(pycnoplinthopsis)、簇芥属(pycnoplinthus)、pyramidium、quezeliantha、quidproquo、raffenaldia、raphanorhyncha、萝卜属(raphanus)、匕果芥属(rapistrum)、reboudia、redowskia、rhammatophyllum、rhizobotrya、ricotia、robeschia、rollinsia、romanschulzia、roripella、蔊菜属(rorippa)、rytidocarpus、sameraria、sarcodraba、savignya、scambopus、schimpera、schivereckia、schizopetalon、schlechteria、schoenocrambe、schouwia、scoliaxon、selenia、sibara、sibaropsis、silicularia、sinapidendron、白芥属(sinapis)、sisymbrella、假蒜芥属(sisymbriopsis)、大蒜芥属(sisymbrium)、芹叶荠属(smelowskia)、sobolewskia、丛菔属(sohms-laubachia)、羽裂叶荠属(sophiopsis)、sphaerocardamum、螺喙荠属(spirorhynchus)、spryginia、无隔荠属(staintoniella)、stanfordia、鸡冠花属(stanleya)、stenopetalum、棒果芥属(sterigmostemum)、曙南芥属(stevenia)、straussiella、streptanthella、streptanthus、streptoloma、革叶荠属(stroganowia)、stubebdorffia、钻叶荠属(subularia)、succowia、连蕊芥属(synstemon)、synthlipsis、沟子荠属(taphrospermum)、舟果荠属(tauscheria)、teesdalia、teesdaliopsis、四齿芥属(tetracme)、盐芥属(thellungiella)、thelypodiopsis、thelypodium、thlaspeocarpa、菥蓂属(thlaspi)、风轮荠属(thysanocarpus)、trachystoma、trichotolinum、trochiscus、tropidocarpum、旗杆芥属(turritis)、vella、warea、weberbauera、werdermannia、winklera、xerodraba、阴山荠属(yinshania)、zerdana和zilla。
优选的十字花科的属是芸苔属。
优选的芸苔属物种包括：巴利阿里芸苔(b.balearica)(马洛卡卷心菜(mallorcacabbage))、伊索比亚芥(b.carinata)(阿比西尼亚芥(abyssinianmustard)或阿比西尼亚卷心菜(abyssiniancabbage))、长芥(b.elongata)(细长芥菜(elongatedmustard))、地中海包心菜(b.fruticulosa)(地中海卷心菜(mediterraneancabbage))、希拉里甘蓝(b.hilarionis)(圣希拉里昂卷心菜(sthilarioncabbage))、芥菜(b.juncea)(印度芥菜(indianmustard)、棕叶芥菜(brownandleafmustards)、萨雷普塔芥菜(sareptamustard))、欧洲油菜(b.napus)(牧草油菜(foragerape)、油菜籽、加拿大油菜(canola)、芜菁甘蓝(rutabaga)、瑞典甘蓝(swede)、瑞典芜菁(swedishturnip)、瑞典芜菁(swedeturnip))、塌棵菜(b.narinosa)(塌棵菜(broadbeakedmustard))、黑芥(b.nigra)(黑芥(blackmustard))、甘蓝(b.oleracea)(羽衣甘蓝(kale)、卷心菜(cabbage)、羽衣甘蓝叶(collard)、青菜(greens)、西兰花(broccoli)、花菜(cauliflower)、芥蓝(kai-lan)、抱子甘蓝(brusselssprouts)、大头菜(kohlrabi))、小松菜(b.perviridis)(嫩绿菜(tendergreen)、芥菜菠菜(mustardspinach))、油菜(b.rapa)(同义词油菜(b.campestris)、大白菜(chinesecabbage)、芜菁(turnip)、菜心(rapini)、小松菜(komatsuna)、白菜(bokchoy)或小白菜(pakchoi))、褐芥(b.rupestris)(黑芥(brownmustard))、b.septiceps(seventopturnip)和非洲芥末(b.tournefortii)(亚洲芥菜(asianmustard))。
优选的芸苔属物种包括甘蓝(b.oleracea)、欧洲油菜(b.napus)和油菜(b.rapa)。
优选的芸苔属植物包括：卷心菜、西兰花、花菜、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、牧草油菜、瑞典甘蓝、芜菁和大白菜。
本发明的组合物和方法中菌株的浓度
在本发明的组合物和方法中使用菌株的浓度将根据如何使用所述菌株/组合物而变化。
对于种子涂覆，菌株应以以下范围的浓度存在：3×102至3×1011菌落形成单位(cfu)/g种子，更优选3×103至3×1010cfu/g种子，更优选3×104至3×109cfu/g种子。
对于施用至播种孔，菌株应以以下范围的浓度存在：2×104至2×1010cfu/孔，2×105至2×109cfu/孔，更优选2×106至2×108cfu/孔，更优选2×107cfu/孔。
尽管不是优选的，但菌株也可以施用至生长培养基，作为浸液施用，作为叶面喷雾施用，或作为在开花时施用的喷雾施用，或作为结实时的喷雾施用。
对于盆栽混合物生长基质，菌株应以至少3×106cfu/l、更优选至少3×107cfu/l、更优选至少3×108cfu/l、更优选至少3×109cfu/l、更优选至少3×1010cfu/l、3×1011cfu/l、更优选至少3×1012cfu/l、更优选至少3×1013cfu/l施用。
对于播种时的浸液，菌株应以至少3×1011cfu/l，更优选至少3×1012cfu/l，更优选至少3×1013cfu/l施用。
作为叶面喷雾，菌株应以至少3×1013cfu/l，更优选至少3×1014cfu/l，更优选至少3×1015cfu/l施用。
对于在开花时施用的喷雾，菌株应以至少3×106cfu/l，更优选至少3×107cfu/l，更优选至少3×108cfu/l，更优选至少3×109cfu/l，更优选至少3×1010cfu/l、3×1011cfu/l，更优选至少3×1012cfu/l，更优选至少3×1013cfu/l施用。
附图说明
现在将参考附图中的图描述本发明，其中：
图1.用于欧文氏菌分离株的遗传分析的引物。指出了每种引物的seqidno。
图2.基于tamura三参数模型，通过最大似然法对来自芸苔属的桃色欧文氏菌分离株(75、76、90、152、235、376、599、1601、1657、1774、1859、1860、1953)中的16s核糖体rna区(16srrna；a)、热休克蛋白dnaj(dnaj；b)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh；c)和重组酶a(reca；d)基因进行分子系统发育分析(tamura,1992)。显示具有最高对数似然性的树。在分支旁边指示相关分离株聚集在一起的树的百分比。这些树根植于野油菜黄单胞菌野油菜致病变种上并按比例绘制，分支长度以每个位点的替换数量来衡量。分析中包括不同欧文氏菌物种的类型菌株(用't'表示)。在菌落之间显示遗传异质性的分离株用星号标记。从16srrna区域、dnaj、gapdh和reca基因分别分析了总共818、627、366和441个位置。
图3.来自桃色欧文氏菌分离株75(1＝seqidno：1)、76(5＝seqidno：5)、90(9＝seqidno：9)和1859(13＝seqidno：13)的16s核糖体rna区域的dna序列的比对。
图4.来自桃色欧文氏菌分离株75(2＝seqidno：2)、76(6＝seqidno：6)、90(10＝seqidno：10)和1859(14＝seqidno：14)的热休克蛋白dnaj基因的dna序列的比对。
图5.来自桃色欧文氏菌分离株75(3＝seqidno：3)、76(7＝seqidno：7)、90(11＝seqidno：11)和1859(15＝seqidno：15)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的dna序列的比对。
图6.来自桃色欧文氏菌分离株75(4＝seqidno：4)、76(8＝seqidno：8)、90(12＝seqidno：12)和1859(16＝seqidno:16)的重组酶a基因的dna序列的比对。
图7.在双重培养测定中，不同属中的具有抗野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)和/或核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)(ss)活性的细菌分离株的出现率。评估分离株抑制2-3种xcc分离株在ydca和/或pda上的生长的能力，以及抑制两种ss分离株在25℃下在pda上的生长的能力。在至少一种双重培养测定中具有≥1的平均生物活性评分的分离株被分类为生物活性的。在使用方差分析进行统计分析的那些测定中，该阈值与0的生物活性评分显著不同。
图8.包括桃色欧文氏菌分离株75、76、90和599在内的细菌分离株对在发芽吸水纸(germinationblotter)上播种8天后卷心菜和牧草油菜幼苗的黑腐病发生率百分比的影响。每种细菌分离株以6×107cfu/g种子的目标比率施用于接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp4013或icmp6497的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。将测定在30℃光照下保持8小时，然后在20℃黑暗下保持16小时。
图9.包括桃色欧文氏菌分离株75、76、90和599在内的细菌分离株对在发芽吸水纸上播种5天后卷心菜和牧草油菜种子的发芽百分比的影响。每种细菌分离株以6×107cfu/g种子的目标比率施用于接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp4013或icmp6497的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。将测定在30℃光照下保持8小时，然后在20℃黑暗下保持16小时。
图10.以两种比率施用于种子的、包括桃色欧文氏菌分离株76和90的真菌和细菌分离株对生长室中6周后的卷心菜的黑腐病发生率的影响。每种分离株分别以3×108和3×109cfu/g种子的低和高目标比率施用于人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp6497的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图11.包括桃色欧文氏菌分离株76在内的细菌分离株对生长室中6周后卷心菜的黑腐病发生率的影响。每种分离株以3×109cfu/g种子的目标比率施用于人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。误差棒表示用于比较分离株与阳性对照(a)或另一分离株(b)的lsd(5％)，和用于比较阴性对照与分离株(c)或阳性对照(d)的ls效应(lseffect)(5％)。
图12.以两种比率施用于种子的包括桃色欧文氏菌分离株76和90在内的真菌和细菌分离株对生长室中卷心菜的出苗率的影响。每种分离株分别以3×108和3×109cfu/g种子的低和高目标比率施用于人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp6497的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图13.包括桃色欧文氏菌分离株76在内的真菌和细菌分离株对生长室中卷心菜的出苗率的影响。每种分离株以3×109cfu/g种子的目标比率施用于人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图14.桃色欧文氏菌分离株和施用率对生长室中6周后的卷心菜的出苗率和黑腐病发生率的影响。每种分离株以六种不同的比率施用于人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图15.桃色欧文氏菌分离株和施用率对生长室条件下6周后的卷心菜的黑腐病症状发生率的影响。桃色欧文氏菌分离株76
图16.生物控制剂(bca)和施用率对在79％相对湿度和(a)20℃白天13小时/10℃夜晚11小时和(b)25℃白天13小时/15℃夜晚11小时的温度方案下6周后的卷心菜的黑腐病发生率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76
图17.生物控制剂(bca)和施用率对79％相对湿度和(a)20℃白天13小时/10℃夜晚11小时和(b)25℃白天13小时/15℃夜晚11小时的温度方案下的卷心菜出苗率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76
图18.盆栽混合物ph和生物控制剂(bca)对生长室中6周后卷心菜的黑腐病发生率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76
图19.盆栽混合物ph和生物控制剂(bca)对生长室中卷心菜的出苗率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76
图20.生物控制剂施用至种子对潮湿生长室条件下卷心菜的出苗率和黑腐病发生率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株75、76、90和1859在内的每种分离株施用至人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子(3×109cfu/g种子)。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图21.在温室和生长室条件下，生物控制剂施用至种子和/或盆栽混合物对卷心菜出苗率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76在内的每种分离株施用至人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子(3×109cfu/g种子)，和/或施用至播种孔的盆栽混合物(2×107cfu/孔)。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图22.生物控制剂施用至种子和/或盆栽混合物对温室中卷心菜的黑腐病发生率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76在内的每种分离株施用至人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子(3×109cfu/g种子)，和/或施用至播种孔的盆栽混合物(2×107cfu/孔)。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。
图23.生物控制剂施用至种子和/或盆栽混合物对生长室中卷心菜的黑腐病发生率的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76在内的每种分离株施用于人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子(3×109cfu/g种子)，和/或施用于播种孔的盆栽混合物(2×107cfu/孔)。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性对照和阴性对照(分别具有和不具有xcc)的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图24.在盆栽试验中遵循化学喷雾程序。
图25.化学喷雾剂和桃色欧文氏菌分离株76对温室条件下6周后的卷心菜的黑腐病发生率的影响。桃色欧文氏菌以3×109cfu/g的目标比率施用于人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080的种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阳性(xcc)对照的种子。如图24所示，在播种后(das)9天和第16天开始，每周对幼苗不喷雾化学品或喷雾化学品。误差棒表示lsd(5％)，用于比较未喷雾的幼苗(a)、未喷雾的和喷雾的幼苗(b)和喷雾的幼苗(c)。
图26.细菌分离株对温室中播种后(das)22和43天的卷心菜的出苗率和植株生长参数的影响。包括桃色欧文氏菌分离株76、90和599在内的每种分离株以3×109cfu/g种子的目标比率施用于种子。用细菌学蛋白胨水处理用于阴性对照的种子。
图27.生物控制剂(bca)制剂和比率对在生长室中6周后卷心菜的黑腐病发生率的影响。每种分离株作为种子包衣和标准种子处理(桃色欧文氏菌分离株76：分别为
图28.在施用于(a)裸种子和(b)人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种分离株icmp21080的种子之后，生物控制剂(bca)制剂和比率对生长室中卷心菜出苗率的影响。每种分离株作为种子包衣和标准种子处理(桃色欧文氏菌分离株76：分别为
图29.桃色欧文氏菌分离株76的颗粒、冷冻干燥和非配制的接种物对盆栽混合物、以及对于后两者而言作为浸液和叶面喷雾对种子的施用率。
图30.桃色欧文氏菌分离株76制剂和施用方法对生长室和玻璃暖房中6周后的卷心菜的出苗率和黑腐病发生率的主要影响。将桃色欧文氏菌的颗粒(gl)、冷冻干燥(fd)和非配制(nf)的接种物施用于盆栽混合物，以及对于后两者而言作为浸液和叶面喷雾施用于种子，如图29所概述。所有种子都人工接种有野油菜黄单胞菌野油菜致病变种分离株(xcc)icmp21080。分别用含有蔗糖和细菌蛋白胨的水处理用于冷冻干燥和未配制的阳性(xcc)对照的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图31.桃色欧文氏菌分离株76的种子接种剂与其他施用方法对生长室和玻璃暖房中6周后的卷心菜的黑腐病发生率的双向相互作用。将桃色欧文氏菌的颗粒(gl)、冷冻干燥(fd)和非配制(nf)的接种物施用于盆栽混合物，并且对于后两者而言作为浸液和叶面喷雾施用于种子，如图29所概述。所有种子都人工接种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)分离株icmp21080。分别用含有蔗糖和细菌学蛋白胨的水处理用于冷冻干燥和未配制的阳性(xcc)对照的种子。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图32.种子处理和生长培养基对苗圃中的卷心菜出苗率的影响。将桃色欧文氏菌分离株76(ep76)施用于具有成膜剂(peridiam)和染料(红色)的种子并播种在商业盆栽混合物中(方法a；深灰色条)，或者在没有成膜剂和染料的情况下施用，并播种在饱和的室内盆栽混合物中(方法b；浅灰色条)。用相似的方式处理用于阳性对照的种子，但没有ep76。除了当对于相同处理比较不同方法时(b)，误差棒指示用于比较不同处理和方法(a)的lsd(5％)。
图33.种子处理和位置对卷心菜出苗率的影响。未处理的种子(阳性对照)和用桃色欧文氏菌分离株76(ep76)处理的种子在生长室(深灰色条)和苗圃(浅灰色条)中生长。除了当比较相同地点的不同种子处理(b)时，误差棒指示用于比较不同种子处理和地点(a)的lsd(5％)。
图34.桃色欧文氏菌分离株76(ep76)对苗圃中的卷心菜的症状和潜伏的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)感染的影响。ep76以3×109cfu/g种子的目标比率施用于具有成膜剂(peridiam)和染料(红色)的天然侵染xcc的种子，并播种在商业盆栽混合物中(方法a)，或者在没有成膜剂和染料的情况下施用，并播种在饱和的内部盆栽混合物中(方法b)。用相似的方式处理用于阳性对照的种子，但没有ep76。
图35.在苗圃中6周后，卷心菜的维管流体中的欧文氏菌物种的发生率。将桃色欧文氏菌分离株76(ep76)以3×109cfu/g种子的目标比率施用于具有成膜剂(peridiam)和染料(红色)的天然被野油菜黄单胞菌野油菜致病变种侵染的种子，并播种于商业盆栽混合物中(方法a；深灰色条)，或者在没有成膜剂和染料的情况下施用，并播种于饱和的室内盆栽混合物中(方法b；淡灰色条)。用相似的方式处理用于阳性对照的种子，但没有ep76。除了当对于相同处理比较不同方法时(b)，误差棒指示用于比较不同处理和方法(a)的lsd(5％)。
图36.在生长室和苗圃中6周后，卷心菜的维管流体中的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc)和欧文氏菌物种的发生率。天然侵染xcc的种子未经处理(阳性对照)，或用桃色欧文氏菌分离株76(ep76)以3×109cfu/g种子的目标比率处理。生长室条件从25℃光照13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。
图37.在新西兰林肯的田间条件下，生物控制剂(bca)的种子施用对天然侵染的卷心菜中的黑腐病发生率的影响。在bca(桃色欧文氏菌分离株76：
图38.在新西兰林肯的田间条件下，生物控制剂(bca)的种子和叶面施用对天然侵染的卷心菜中的黑腐病发生率的影响。在bca(桃色欧文氏菌分离株76：
实施例
提供以下非限制性实施例以说明本发明，但决不限制其范围。
实施例1：分离桃色欧文氏菌的方法
作为调查芸苔属的害虫和疾病的新颖生物控制剂(bca)的一部分，从以下10种芸苔属植物类型的47个种子批次分离微生物；蔬菜：西兰花、卷心菜、花菜、萝卜、大头菜和小白菜，和饲料植物：羽衣甘蓝、芜菁、油菜和瑞典甘蓝。
将来自每个种子批次的种子(储存在4℃的防潮容器中)随机分成数量大致相等的两组。将这些组中的一组进一步细分为半数或三分之一，用于用1、2和/或3％naocl进行表面灭菌。将种子在70％(v/v)乙醇中表面灭菌30秒，然后在含有0.01％(v/v)tween20的1、2或3％naocl中以200rpm摇动2分钟。然后用无菌反渗透(ro)水冲洗它们三次并在无菌滤纸上干燥。将一半的种子在无菌研钵和研杵中轻度浸软，并与剩余的完整种子一起均匀地铺展在含有1.3％(w/v)营养琼脂(na)或2.4％(w/v)马铃薯葡萄糖琼脂(pda)的单独无菌培养皿中。第二组非表面灭菌的种子以相似的方式轻度浸软地或完整地铺展在na或pda上。
将培养皿在黑暗中于25℃(na)或20℃(pda)温育并定期检查约4周。一旦从种子中出现细菌或真菌，就将它们单独传代培养在无菌na(细菌)或pda(真菌)上，并如上所述进行温育以获得纯培养物。为了长期储存细菌，将单个菌落在无菌的2.5％(w/v)luria-bertanimiller肉汤(lb)中在摇床上以180rpm在25℃在黑暗中生长过夜。将培养物在-80℃下储存在无菌的25％(v/v)甘油中。
将总共1485个微生物分离到标准微生物培养基上并获得纯培养物。它们由以下组成：
·1101个细菌分离株
·384个真菌分离株。
基于其16s核糖体rna(16srrna，仅细菌)或内部转录间隔区(its，仅真菌)dna序列与eztaxon和/或genbank数据库中的那些dna序列的比较，将推定的分类学特征(如实施例2中所述)分配给731个细菌和234个真菌。芽孢杆菌(bacillus)是回收的主要细菌属。只有13个分离株属于欧文氏菌属(erwinia)。
从得自新西兰的pggwrightsonseedsltd的牧草油菜种子分离dsm32302。
从得自新西兰的pggwrightsonseedsltd的牧草油菜种子分离dsm32304。
从得自新西兰的pggwrightsonseedsltd的芜菁种子分离dsm32305。
从得自新西兰的南太平洋种子有限公司(southpacificseedsltd)的大头菜种子分离dsm32303。
实施例2：分子遗传鉴定
通过16srrna区域和针对热休克蛋白dnaj(dnaj)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)和重组酶a(reca)的基因的部分dna序列分析来鉴别欧文氏菌属的分离株。对于在25℃或28℃在黑暗中在na上生长过夜的单个菌落进行pcr扩增。对于16srrna区域，在含有1.25uaccusuredna聚合酶(bioline)、1×accubuffer(accu缓冲液)(bioline)、6.25nmol每种dntp(bioline)和5pmol引物对f8-27和r1510(invitrogen；lipson和schmidt2004)的25μl反应物中进行直接菌落pcr。将它们在热循环仪中在95℃下温育10分钟，然后经历在95℃下1分钟、在55℃下1分钟和在68℃下2.5分钟的30个循环，然后在68℃下温育10分钟。
对于其他基因，使用redextract-n-amp植物pcr试剂盒(sigma-aldrich)按照制造商的说明书从菌落中提取dna并随后用5pmol每种引物对dna进行pcr扩增(图1)。将反应物在热循环仪中在94℃下保持3分钟，然后经历在94℃下30秒、在65℃下30秒(每个循环-1℃)和在72℃下1分钟的10个循环，在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟的25个循环，然后在72℃下温育10分钟。
根据制造商的说明书，用agencourtampure或agencourtampurexp(beckmancoulter)纯化扩增产物。通过macrogeninc(韩国)或林肯大学测序设备(新西兰)对纯化产物进行正向测序。
还表征了桃色欧文氏菌分离株icmp8932和icmp12532以及大黄欧文氏菌(erwiniarhapontici)分离株icmp15975(landcareresearch)。使用gentrapuregene酵母/细菌试剂盒(qiagen)遵循制造商的说明书，从在25℃在黑暗中在180rpm的摇床上在lb中生长过夜的培养物中分离基因组dna。使用如上所述的redextract-n-amp植物pcr试剂盒进行dna(10ng)的pcr扩增，仅针对16srrna区域，将反应物在热循环仪中于94℃下温育3分钟，然后经历在94℃下1分钟、在55℃下1分钟和在72℃下2分钟的35个循环，然后在72℃下温育10分钟。
将来自欧文氏菌分离株的dna序列与来自桃色欧文氏菌(icmp8932和icmp12532)、大黄欧文氏菌(icmp15975)以及其他欧文氏菌分类群(erwiniataxa)和野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xcc；可从genbank,nationalcenterforbiotechnologyinformation,usa获得)的模式菌株的相应序列进行比较。这些在sequencher(genecodescorporation)中使用污染数据汇编算法，以及60％最小匹配的组装参数和50的最小重叠进行比对。对比对进行了一些手动调整以重新定位或消除空位。
基于tamura三参数模型(tamura1992)，使用最大似然法从mega6(tamura等人2013)中各基因的比对估计系统发生树。具有5个比率类别的离散伽玛分布用于对位点之间的进化比率差异建模。所有包含空位的位置都被消除。通过将邻接法(neighbor-joiningmethod)应用于使用最大复合似然法估计的成对距离矩阵来获得用于启发式搜索的初始树。通过bootstrap方法测量树的鲁棒性，重复1000次。70％或更高的bootstrap值被认为得到很好地支持。xcc型菌株icmp13用作使树生根的外群。
欧文氏菌75、76、90和1859分离株显示出与桃色欧文氏菌的模式菌株(icmp12532)100％的序列同一性。这些分离株聚类在具有这种模式菌株的系统发生树中以形成与大多数其他的欧文氏菌分类群分开的良好支持的群组(图2)。
seqidno.1至4用于表征dsm32302，seqidno.5至8用于表征dsm32304，seqidno.9至12用于表征dsm32305，并且seqidno.13至16用于表征dsm32303。
seqidno:1至16的序列的比对展示于图3-6中，并且显示每个菌株的特征。
实施例3：体外筛选
在针对xcc分离株xcc2(i.harvey,plantwise)、icmp2和/或icmp4013(landcareresearch)以及针对来自羽衣甘蓝的核盘菌(ss)分离株lu462和lu471(林肯大学培养物收藏中心(lincolnuniversityculturecollection))的双重培养测定中评估代表芸苔中存在的分类群范围的细菌分离株。
对于每种xcc分离株，将在25℃在黑暗中在酵母葡萄糖白垩琼脂(ydca)上生长3-5天的接种物再悬浮于0.1mmgso4中，并调节至600nm下0.80±0.01的光密度(2×108cfu/ml的估计浓度)。将该接种物(0.1ml)在含有ydca或pda的单独的无菌培养皿中铺展在琼脂表面上。不久之后引入测试细菌。
使用接种环将在25℃在黑暗中在na上生长1-5天的细菌细胞在距离边缘18mm的四个等距接种点处施用于接种有xcc的培养皿中。对于每种细菌分离株，针对每种xcc分离株制备两个培养皿(2×ydca，或在后来的实验中，1×ydca和1×pda)。将培养皿在25℃在黑暗中以随机顺序温育。
在使用ss的双重培养测定中，将含有pda的单独的无菌培养皿用如上所述的细菌分离株接种，并在引入病原体之前在黑暗中于25℃温育过夜。从在20℃下在黑暗中在pda上生长4-6天的培养物中移除ss的菌丝体盘(直径6mm)，并转移到具有测试细菌的培养皿的中心。对于每种细菌分离株，针对各ss分离株制备两个培养皿，并在20℃下在黑暗中以随机顺序温育。
在病原体接种后2-8天评估双重培养测定。在针对xcc的测定中对细菌分离株给出评分，0＝对xcc生长没有抑制作用，1＝作用小，2＝中等作用，或3＝作用大。针对ss，它们被评分为0＝对ss生长没有抑制作用，1＝ss和测试细菌相互接近并停止生长，或2＝ss生长以一定距离受到抑制从而留下明显的抑制区，或被测试细菌生长超过。
对于具有2(变异体分离株)×>1(测试分离株)的处理结构的完全随机化实验设计，使用方差分析(anova)对每个双重培养测定中的细菌分离株的生物活性评分进行统计分析。对于在两种不同培养基上进行的那些双重培养测定，将处理结构修改为2(培养基)+2(病原体分离株)×>1(测试分离株)。从anova中省略了被完全评分为零或相反地被评分为最大生物活性评分的测试分离株，以避免违反相等方差的假设。将这些与变量处理进行比较，使用最小显著效应(lseffect5％)，即最小显著性差异(lsd5％)除以2的平方根。
总共38种细菌分离株在体外显示出对两种病原体的生物活性(图7)。细菌分离株来自以下五个属：芽孢杆菌属(bacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、欧文氏菌属、类芽孢杆菌属(paenibacillus)或假单胞菌属(pseudomonas)。这些包括桃色欧文氏菌分离株75、76和90。未评估桃色欧文氏菌分离株1859。四种细菌分离株的分类学特征尚未知。
一些细菌分离株仅显示对一种病原体的拮抗作用，并且除了一些上述属之外，这些分离株还包括来自细菌属金黄杆菌属(chryseobacterium)、泛菌属(pantoea)和贪噬菌属(variovorax)的分离株(图7)。来自26个细菌属的分离株没有显示针对xcc或ss的体外生物活性。
实施例4：使用xcc的幼苗生物测定中的生物活性
除了许多其他细菌分离株之外，在卷心菜和牧草油菜幼苗生物测定中针对xcc分离株icmp4013和icmp6497(landcareresearch)评估桃色欧文氏菌分离株75、76、90和599的生物活性。
从在黑暗中于25℃生长3天的ydca培养物制备xcc接种物。将再悬浮于无菌0.1％(w/v)细菌学蛋白胨(bp)水中的接种物基于其在600nm下的光密度调节至1×107菌落形成单位(cfu)/ml的浓度。
将来自卷心菜和牧草油菜的种子在含有0.01％(v/v)tween20的1％naocl中进行表面灭菌。将xcc接种物(1×107cfu/ml)或无菌bp水(阴性对照)以3ml/g种子的比率在6.7kpa的真空下在连续混合5分钟下施用于表面灭菌的种子。将种子收集在无菌miracloth中，并在层流柜中在开放培养皿中干燥过夜。
将细菌分离株在180rpm的摇床上在30℃在黑暗中在100mllb中生长18小时。通过在3,220×g离心20分钟从培养物中收集细菌细胞，用无菌bp水洗涤，并再次离心，然后再悬浮于无菌bp水中。基于其在600nm下的光密度将接种物调节至1×108cfu/ml的浓度，并以0.6ml/g种子的比率施用于接种有xcc的种子。将无菌bp水施用于阴性对照和阳性对照。将种子与接种物手动混合，并在层流柜中在封闭但未密封的培养皿中温育过夜。
对于每次种子处理，将25粒种子均匀地分布在两层用10ml无菌ro水润湿的发芽吸水纸(60mm×90mm，anchorsteelblueblotter，anchorpapercompany)上。将吸水纸和种子转移到具有透明侧面的干净塑料容器中，并在密封容器之前添加另外3ml无菌ro水。
对于每种种子处理至少准备10张发芽吸水纸。在30℃光照(1000勒克斯)下8小时和20℃黑暗下16小时以随机化完全区组设计来安排测定。为了使对照和处理之间差异的方差最小化，每个区组中阳性对照和阴性对照的数量大约等于处理总数的平方根。
根据国际种子测试协会(ista)指南(don，2009)，在播种后(das)5天评估发芽。在播种后8天在正常幼苗中评估疾病症状的发生。症状通常表现为下胚轴上部的透明至浅褐色病变。
对于具有10个区组+>1(测试分离株)的随机化完全区组设计，使用anova对发芽百分比和疾病发生率进行统计分析。从分析中省略了始终具有接近0或100％的发芽或疾病水平的处理，以避免违反相等方差的假设。使用ls效应5％，将这些与变量处理进行统计学比较。
使用不平衡方差分析，在每个测定中对于每种分离株在数据均值上进行针对不同病原体分离株和总体的、不同芸苔属物种中的发芽和疾病发生率的组合分析。在同一测定中测试多个种子批次或病原体的情况下，使用分离株的主效应均值以便实现数据的独立性。所有统计分析均使用genstat进行。
桃色欧文氏菌分离株75、76和90使卷心菜和/或牧草油菜幼苗的黑腐病发生率平均降低了88-99％(图8)。用这些分离株处理的幼苗的疾病水平低于用桃色欧文氏菌分离株599处理的幼苗。没有来自其他细菌属的分离株显示比桃色欧文氏菌分离株75、76和90更高水平的抗xcc的生物活性。
用桃色欧文氏菌分离株75、76和90处理的种子的幼苗出苗率高(图9)。
实施例5：xcc在卷心菜中的生物控制
在其他细菌和真菌分离株中评估了桃色欧文氏菌分离株76和90在卷心菜中针对xcc分离株icmp6497和icmp21080(landcareresearch)的生物控制活性。
按照实施例4中描述的方法并进行一些修改，将病原体与桃色欧文氏菌分离株76和90以及其他细菌和真菌分离株一起施用于卷心菜种子。xcc的接种物增加至1×109cfu/ml的浓度，并且细菌和真菌分离株的浓度增加至5×108和/或5×109cfu/ml。
将处理过的种子播种在含有25ml/孔的饱和盆栽混合物(ph5.8)的2×2穴盘(celltray)中。将两粒种子播种在每个孔中，达到10mm的深度，并在1周后减少至每孔一个正常幼苗。将每个穴盘放在单独的碟子上。盆栽混合物由kiwipeat(600l/m3，newzealandgrowingmedia)、浮石(400l/m3，egmontcommercial)、osmocoteexactmini(精准奥绿肥迷你型)(1.5kg/m3，everrisinternational)、白云石石灰(5kg/m3，goldenbaydolomite)、细粉状农用石灰(2kg/m3，oxfordlimecompany)、过磷酸盐(1kg/m3，ravensdown)和hydraflo(1kg/m3，everrisinternational)构成。
在新西兰biotron(生物人工气候室)(林肯大学)的生长室(bdw120植物生长箱(plantgrowthcabinets)；conviron)中，遵照随机化完全区组设计安排盆栽试验。生长室中的条件从25℃光照(400μmol/m2/s)13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。为了使对照和处理之间差异的方差最小化，每个区组中阳性对照(有时是阴性对照)的数量大约等于处理总数的平方根。
在播种后1天用手持式浇水棒在高处轻轻地浇灌盆栽试验。此后，根据需要对它们浇水，以使盆栽混合物保持在潮湿状态。在播种后2-3周开始，以每周一次的间隔使用液体肥料(agrichemhighnk，pggwrightsonturf)。将1:200稀释的肥料以足够的水平施用于盆栽试验中以使盆栽混合物饱和，并随时间逐渐增加肥料以填充碟子。
在播种后7-8天评估幼苗出苗率，并遵照芸苔属幼苗的国际种子测试协会(ista)指南(don，2009)，根据其地上外观分类为正常或异常。从播种后14天开始，以每周一次的间隔评估正常幼苗的黑腐病症状。在子叶上直到播种后21天和在真叶上直到播种后42天记录特征性v形褪绿病变和黑化叶脉(rimmer等人2007)的存在。
如实施例4所述，使用anova对出苗率和疾病发生率百分比进行统计分析。疾病发生率是基于连续周中感染植物的累积总数。
在有利于疾病的温暖潮湿条件下，当以不同比率施用时，桃色欧文氏菌分离株76和90使黑腐病水平显著降低80-98％(图10和11)。
桃色欧文氏菌分离株76对出苗率没有负面影响(图12和13)。
实施例6：施用率对症状和潜伏xcc感染的影响
比较了当以不同比率施用于种子时桃色欧文氏菌分离株76、90、1774和1860控制卷心菜中的症状和潜伏xcc感染两者的能力。
如实施例5中所述进行盆栽试验，但进行了一些改动。用xcc分离株icmp21080(landcareresearch)人工接种卷心菜种子。将桃色欧文氏菌以如下六种不同浓度施用于该种子：5×104、5×105、5×106、5×107、5×108和5×109cfu/ml。
每周评估幼苗的子叶和真叶中的黑腐病症状，分别直至播种后28天和42天。在用浓度≥3×106cfu/g种子的桃色欧文氏菌处理的幼苗中和在对照中测试潜伏xcc感染的发生。从每个区组中随机选择在整个盆栽试验期间未显示疾病症状的一个幼苗(或两个阳性对照幼苗)。使用scholander压力室(plantwaterstatusconsole3000f01，ictinternational)从植物中提取维管流体。
将在盆栽混合物正上方的茎干的底部切割的植物安装在压力室内。将插入短长度无菌硅橡胶管中的茎干穿过样品架拧入无菌的1.7ml收集管中。向压力室施加总共2,760kpa，持续2分钟或如果需要更长时间，以收集>0.1ml的维管流体。将维管流体的适当的10倍连续稀释液铺展(0.1ml)在含有fs琼脂培养基的无菌培养皿的琼脂表面上。在28℃在黑暗中3天后测定xcc的出现。检查培养物中由淀粉水解区包围的小的苍白粘液样菌落。
对于具有15个区组和4(桃色欧文氏菌分离株)×6(比率)+1(阳性对照)+1(阴性对照)的因子处理结构的随机化完全区组设计，使用anova对出苗率百分比进行统计分析。桃色欧文氏菌分离株76、90、1774和1860以3×104、3×105、3×106、3×107、3×108和3×109cfu/g的六种目标比率施用于人工接种有xcc分离株icmp21080的种子。还包括仅用xcc(阳性对照)或bp水(阴性对照)处理的种子。对于比率因子，分析中包括线性和二次对比，以及用于检查桃色欧文氏菌分离株的影响的对比。所有统计分析均使用genstat进行。
从症状和潜伏感染的百分比以及总疾病发生率的anova中省略了阴性对照。由于没有感染，因此这是必要的，以避免违反相等方差的anova假设。将该处理与变量处理进行统计学比较，使用ls效应5％。症状感染的百分比是基于连续周中具有症状的植物的累积总数。基于具有症状和潜伏感染的植物总数计算总疾病发生率。对于各区组中的各处理，通过将无症状植物的数量乘以具有潜伏感染的植物的比例来估计后者。对于潜伏感染百分比和总疾病发生率的anova，因子处理结构中的比率因子降低至4。
桃色欧文氏菌分离株76和90抗xcc的生物控制活性与桃色欧文氏菌分离株1774和1860显著不同(p<0.001，图14)。在所有施用率下，分离株76和90都显著降低了症状感染(图15)。使用这些分离株的情况下的潜伏感染倾向于降低，这和症状感染减少一起促成总疾病发生率的显著降低(图14)。当以中等至高比率(3×106–3×109cfu/g种子)施用时，这两种分离株使总疾病发生率降低63-79％。
实施例7：温度对生物控制活性的影响
在两种不同的温度方案下比较了以不同比率施用于接种有xcc的卷心菜种子的桃色欧文氏菌分离株76及其他bca的功效。
如实施例5中所述进行盆栽试验，但进行了一些改动。用xcc分离株icmp6497(landcareresearch)人工接种卷心菜种子。将桃色欧文氏菌分离株76和三种其他bca以5×107、5×108和5×109cfu/ml的浓度施用于种子。在与实施例5中所述相同的条件下，将一个盆栽试验保持在生长室中。对于其他盆栽试验，生长室条件从20℃光照(400μmol/m2/s)13小时循环至10℃黑暗11小时。
对于具有2(主区)+10(区组)和2(温度方案)×(4(bca分离株)×3(低、中等和高比率)+1(xcc接种剂)+1(bp接种剂))的因子处理结构的随机化完全区组设计，使用anova一起分析两个温度方案下的出苗率百分比。主区是20℃d/10℃n和25℃d/15℃n的2种温度方案。包括桃色欧文氏菌分离株76在内的四种bca分离株以三种目标比率施用：低：3×107cfu/g；中等：3×108cfu/g；和高：3×109cfu/g。还包括用接种剂xcc分离株icmp6497或bp水处理的种子。对于比率因子，分析中包括线性和二次对比，以及用于检查bca和xcc接种剂的效果的对比。所有统计分析均使用genstat进行。
对于基于连续周的感染植物的累积总数的疾病发生率百分比的anova，来自用xcc接种剂预处理的种子的13种处理包括在分析中。在阴性对照(bp接种剂)中没有检测到症状，并且为了避免违反相等方差的anova假设，分析中省略了该处理。使用2(温度方案)×(4(bca分离株)×3(高、中和低比率)+1(xcc接种剂))因子处理结构，如针对出苗率所述进行anova。
对种子施用桃色欧文氏菌分离株76减少了卷心菜幼苗中的黑腐病(图16)。该分离株在两种温度方案下使疾病发生率显著降低了73-100％。所有三种施用率都是有效的。
在更温暖或更冷的温度条件下，桃色欧文氏菌分离株76的存在不影响卷心菜种子的出苗率(图17)。
实施例8：ph对生物控制活性的影响
连同另一种bca一起，研究了ph对桃色欧文氏菌分离株76对卷心菜黑腐病的生物控制活性的影响。
如实施例5中所述进行盆栽试验，但进行了一些改动。用xcc分离株icmp6497(landcareresearch)人工接种卷心菜种子，并用桃色欧文氏菌分离株76和另一种bca处理。将它们播种在ph5.0、ph5.8和ph6.4的盆栽混合物中。通过排除农业石灰并将白云石石灰的水平降低至3kg/m3，将盆栽混合物的ph降至ph5.0，并通过将农业石灰和过磷酸盐两者的水平增加至7kg/m3，将盆栽混合物的ph提高至ph6.4。根据澳大利亚盆栽混合物标准(australianstandardforpottingmixes)(as3743-2003)，在盆栽试验的开始和结束时测试盆栽混合物的ph。
对于具有15个区组和3(ph)×4(2(bca分离株)+1(xcc接种剂)+1(bp接种剂))因子处理结构的随机化完全区组设计，使用anova对ph盆栽试验中的出苗率百分比进行统计分析。盆栽混合物的ph为ph5.0、5.8或6.4。bca分离株是桃色欧文氏菌分离株76和另一种bca。还包括用接种剂xcc分离株icmp6497或bp水处理的种子。在分析中包括ph因子的线性和二次多项式对比，以及用于检查bca、bca分离株和xcc接种剂的作用的对比。
对于基于连续周的感染植物的累积总数的疾病发生率百分比的anova，来自用xcc接种剂预处理的种子的9种处理包括在分析中。在不同ph水平的bp水接种剂处理中没有检测到症状，并且为了避免违反相等方差的anova假设，分析中省略了该处理。使用3(ph)×3(2(bca分离株)+1(xcc接种剂))因子处理结构如针对出苗率所述进行anova。
盆栽混合物在盆栽试验的开始和结束时接近目标ph水平5.0、5.8和6.4。在不存在bca的情况下，卷心菜中的黑腐病水平在ph6.4下显著高于ph5.0和5.8(p＝0.004，图18)。
桃色欧文氏菌分离株76导致所有ph水平下的疾病水平降低93-100％(图18)。该分离株在ph5.0下比其他bca更有效地控制黑腐病。
在存在桃色欧文氏菌分离株76的情况下，在所有ph水平下，卷心菜的出苗率都很高(图19)。
实施例9：在潮湿条件下的生物控制活性
评估了来自芸苔属的13种桃色欧文氏菌分离株(75、76、90、152、235、376、599、1601、1657、1774、1859、1860和1953)针对xcc分离株icmp21080(landcareresearch)的生物控制活性。
如实施例5中所述进行盆栽试验，但有一些例外。在xcc接种后非故意地覆盖种子。盆栽试验在3×6穴盘中进行，并且每个孔中仅播种一粒种子。在盆栽试验期间，盆栽混合物保持过度湿润。仅对幼苗的真叶评估黑腐病症状，直到播种后30天。
对于具有5个区组和15个处理的随机化完全区组设计，使用anova对出苗率和疾病发生率百分比进行统计分析。处理包括阳性和阴性对照，和桃色欧文氏菌分离株75、76、90、152、235、376、599、1601、1657、1774、1859、1860和1953。
对幼苗过度浇水，并且播种后30天(das)的疾病水平高，达到阳性对照中的95％(图20)。在阴性对照的子叶和真叶两者上都检测到黑腐病症状。
在这些条件下，有四种欧文氏菌分离株75、76、90和1859显著减少了由xcc分离株icmp21080引起的症状感染(图20)。在这些分离株的生物控制活性中没有检测到差异。
不同的欧文氏菌分离株对出苗率没有负面影响(图20)。
实施例10：施用方法对症状和潜伏xcc感染的影响
在温室和生长室条件下，与其他两种bca一起研究了施用于种子和/或播种孔的桃色欧文氏菌分离株76针对症状和潜伏xcc感染两者的功效。
用xcc分离株icmp21080(landcareresearch)接种卷心菜种子，并用bp水、桃色欧文氏菌分离株76或其他两种bca中的一种进行处理，如实施例5中所述。对于盆栽混合物施用，以相同的方式制备接种物，达到2×107cfu/ml的目标浓度，并在播种后1天施用于盆栽混合物。用饱和盆栽混合物(ph5.8，参见实施例5)填充2×2穴盘，并将总共2×107cfu施用于每个25ml孔的播种孔中。将穴盘在环境温度下储存在塑料袋中，直到第二天播种种子，如实施例5所述。
如实施例5中所述培养幼苗，只有一个盆栽试验保持在林肯大学(新西兰)的涂覆durolite的温室中。用于温室加热和通风的设定点温度分别为17℃和24℃。
如实施例5中所述评估幼苗出苗率和黑腐病症状的发生率。有一些例外。在生长室中，评估真叶中的疾病症状直到播种后40天。在温室中在播种后9天评估出苗率，并且评估子叶和真叶中的疾病症状分别直到播种后35和49天。
测试幼苗是否存在潜伏感染。从每个孔盘中随机选择一个在整个盆栽试验期间未显示疾病症状的幼苗。此外，测试随机选择的患病幼苗以作为阳性对照。在播种后41-46天从生长室中的盆栽试验对幼苗取样，并在播种后50-65天从温室中的盆栽试验对幼苗取样。按照实施例6中描述的方法从植物茎的维管中提取流体。
对于在生长室中具有15个区组和在温室中具有40个区组以及3(bca分离株)×3(施用方法)+1(xcc接种剂)+1(bp接种剂)因子处理结构的随机化完全区组设计，使用anova对出苗率百分比进行统计分析。bca分离株是桃色欧文氏菌分离株76及其他两种bca。还包括用接种剂xcc分离株icmp21080或bp水处理的种子。在分析中包括用于检查施用方法因子中的种子或盆栽混合物施用的影响以及bca、bca分离株和xcc接种剂的影响的对比。
对于生长室中的症状和潜伏感染百分比以及总疾病发生率以及温室中的症状感染百分比的anova，从因子处理结构中省略了bp接种剂因子。由于没有感染，因此这是必要的，以避免违反相等方差的anova假设。使用ls效应5％，将该处理与变量处理进行统计学比较。如针对出苗率所述，进行温室中的潜伏感染百分比和总疾病发生率的anova。症状感染的百分比是基于连续周的感染植物的累积总数。基于具有症状和潜伏感染的植物总数计算总疾病发生率。后者通过将无症状植物的数量乘以具有潜伏感染的植物的比例来针对各区组中的各处理来估计。
施用方法显著影响了温室中卷心菜种子的出苗率，但在生长室中不影响(图21)。在温室中，桃色欧文氏菌分离株76在施用于种子时增加了出苗率，但是在作为盆栽混合物施用时降低了出苗率。种子施用和盆栽混合物施用之间没有显著的相互作用。
在温室和生长室两者中，桃色欧文氏菌分离株76对疾病发生率具有重要影响，导致症状和潜伏xcc感染两者的减少(图22和23)。这种分离株的种子施用和盆栽混合物施用单独地和组合地使黑腐病平均显著降低73％。
实施例11：与农用化学品的相容性
在温室中在商业苗圃中用于培养芸苔移植物的化学喷雾程序下评估了桃色欧文氏菌分离株76针对xcc分离株icmp21080(landcareresearch)的功效。
按照实施例5中描述的方法将桃色欧文氏菌分离株76施用于人工接种有xcc分离株icmp21080的卷心菜种子，只是将种子在播种前在环境温度下保持1天，然后在4℃下保持4天。将单个种子播种在2×2穴盘的每个孔中，并将10个相同处理的穴盘一起放在塑料托盘上。遵照具有总共8个区组的随机化完全区组设计，将托盘安置在林肯大学(新西兰)的涂覆durolite的温室中。在每个区组中，将未喷雾的处理重复两次，以最小化这些处理与经喷雾的处理之间的差异的方差。用于温室加热和通风的设定点温度分别为17℃和24℃。
如实施例5中所述对盆栽试验进行浇水和施肥，其中在肥料和化学喷雾施用之间进行至少一次浇水。注意确保幼苗在喷雾时未水胁迫并且叶子是干燥的。如图24所阐明，使用被校准成向每托盘40个幼苗喷雾2ml的触发泵喷雾器(jet500，mcgregor)，在播种后9和16天开始每周向所选幼苗施用化学喷雾。将幼苗移至待喷雾的单独区域以避免喷雾漂移。
如实施例5中所述评估幼苗。
对于具有8个区组和2个处理的随机化完全区组设计，使用anova对出苗率百分比进行统计分析。处理是用或不用桃色欧文氏菌分离株76处理的接种有xcc的种子。对于疾病发生率百分比的anova，使用2(种子接种剂)×3(喷雾)的因子处理结构。用或不用桃色欧文氏菌分离株76处理的xcc接种的种子的幼苗未喷雾或在播种后9或16天开始每周喷雾化学品。对于喷雾因子，包括对比以检查喷雾和喷雾时机的影响。
化学喷雾程序对桃色欧文氏菌分离株76的功效没有影响(图25)。该分离株施用于种子将经喷雾的幼苗中的疾病发生率显著降低至与未喷雾的幼苗中检测到的水平相似的水平。化学喷雾没有降低阳性对照中的疾病水平。
实施例12：植物生长促进
评估了桃色欧文氏菌分离株75、76、90和599以及一些其他细菌分离株促进温室中卷心菜植物生长的能力。
按照实施例4中描述的方法对卷心菜种子进行表面灭菌并用细菌分离株接种。将经处理的种子播种在0.9l塑料种植袋(egmontcommercial)中的潮湿盆栽混合物中。将六粒种子播种在每个袋中，达到10mm的深度，并在播种后8天减少成一个随机选择的正常幼苗。盆栽混合物由kiwipeat(600l/m3，newzealandgrowingmedia)、浮石(400l/m3，egmontcommercial)、osmocoteexactmini(1.5kg/m3，everrisinternational)、白云石石灰(4kg/m3，goldenbaydolomite)和hydraflo(1kg/m3，everrisinternational)构成。将每个袋子放在碟子上，并根据需要在高处施用水以使盆栽混合物保持在潮湿状态。
盆栽试验在林肯大学(新西兰)的涂覆durolite的温室中进行。用于温室加热和通风的设定点温度分别为17℃和24℃。根据收获日期(播种后22或43天)将盆栽试验分成两个实验。每个实验以具有10个区组的随机化完整区组设计安排。为了最小化阴性对照和处理之间差异的方差，每个区组中有三个阴性对照。
如实施例5中所述在播种后7天评估幼苗出苗率。在播种后22和43天收获盆栽试验。记录植物上完全展开的叶子的数量。在65-70℃完全干燥后测量根和茎的干重。在干燥之前，将根在水中仔细洗涤以除去盆栽混合物。
对于具有10(重复)+5(细菌分离株)的处理结构的随机化完全区组设计，使用anova对幼苗出苗率百分比、叶的数量以及茎和根的干重进行统计分析。对两个收获日期的每种分离株的数据均值进行了出苗率的组合分析。
对于使用桃色欧文氏菌的情况下的卷心菜出苗率和生长没有观察到负面影响(图26)。在卷心菜幼苗中，分离株76使茎干重增加45％(播种后22天)。在使用桃色欧文氏菌599的情况下，在播种后43天也检测到茎干重(37％)和根干重(59％)两者的增加。
实施例13：种子包衣制剂
将桃色欧文氏菌分离株76的种子包衣制剂抗xcc分离株icmp21080(landcareresearch)的功效与实施例5中描述的种子处理进行比较。还测试了另一种bca。
对于作为种子包衣的制剂，按照swaminathan等人(2015)中针对制剂5所述，配制桃色欧文氏菌分离株76的细胞和其他bca。按照实施例5中所述的方法，将该制剂施用于未处理的(裸)卷心菜种子和人工接种有xcc分离株icmp21080的种子。
还按照实施例5中描述的标准种子处理方法，将桃色欧文氏菌分离株76和其他bca施用于有或没有xcc的种子，仅使用三种不同浓度的bca：5×107、5×108和5×109cfu/ml。
如实施例5中所述进行盆栽试验并对其评估。
对于具有15个区组和2(制剂)×2(xcc存在或不存在)×(2(bca分离株)×3(低、中等和高比率)+1(bca不存在))因子处理结构的随机化完全区组设计，使用anova对出苗率百分比进行统计分析。制剂是种子包衣和标准种子处理，并施用于接种有xcc分离株icmp21080的种子并干燥过夜，或施用于裸种子。bca桃色欧文氏菌分离株76和另外一种bca以三种目标比率施用：低：3×107cfu/g；中等：3×108cfu/g；和高：3×109cfu/g。还包括未用bca处理的种子。对于比率因子，线性和二次多项式对比包括在分析中。
对于疾病发生率百分比的anova，仅有来自用xcc接种剂预处理的种子的14种处理被包括在分析中。省略了来自裸种子的其余14种处理，以避免违反相等方差的anova假设。在12个省略的处理中没有检测到症状，并且在剩余的2个处理中，3％的植物出现症状。使用相同的对比和2(制剂)×(2(bca分离株)×3(高、中等和低比率)+1(bca不存在))因子处理结构，如上所述对出苗率进行anova。
桃色欧文氏菌分离株76的种子包衣制剂显示出与标准种子处理相当的高水平的疾病控制(图27)。当以三种不同的比率施用时，配制成种子包衣的该分离株将疾病水平降低49-81％。桃色欧文氏菌分离株76在减少黑腐病方面比其他bca更有效。
bca或施用率对出苗率均无重大影响，但出苗率受到制剂的影响(图28)。与标准种子处理相比，在使用种子包衣的情况下的出苗率显著降低(8％)(p<0.001)。用病原体预处理种子也使出苗率从88％降低至84％(p<0.001)。
实施例14：桃色欧文氏菌的配制和施用
将桃色欧文氏菌分离株76的颗粒和冷冻干燥制剂抗xcc分离株icmp21080(landcareresearch)的功效与标准的非配制的制剂进行比较。在因子设计中检查将配制的接种物和非配制的接种物施用于种子和盆栽混合物以及作为浸液和叶面喷雾施用的单独和组合效果。
对于颗粒制剂，如专利wo2008023999(swaminathan和jackson，2008)所述，将桃色欧文氏菌分离株76的细胞涂覆在沸石上。对于冷冻干燥制剂，如wessman等人(2013)所述，将桃色欧文氏菌76的细胞在5％(w/v)蔗糖溶液中冷冻干燥。在施用当天在自来水中以图29中列出的目标浓度制备冷冻干燥制剂的悬浮液。
按照实施例5中描述的方法并进行一些修改，制备非配制的接种物。将桃色欧文氏菌分离株76在500mllb肉汤中在摇床上以250rpm、30℃在黑暗中培养16小时。将接种物再悬浮于无菌bp水中，调节至图29中列出的目标浓度。这些是在施用当天制备的。
用xcc分离株icmp21080人工接种卷心菜种子，并按照实施例5中所述的方法用桃色欧文氏菌分离株76的冷冻干燥和非配制的接种物的悬浮液处理。用0.7％(w/v)蔗糖或bp水处理各自对照的种子。
将颗粒制剂以及冷冻干燥和非配制的接种物的悬浮液用手以图29中所概述的比率掺入主体盆栽混合物和覆盖盆栽混合物中。为每种类型的接种物制备单独的主体和覆盖混合物。盆栽混合物的组成如实施例5中所述，并以0.04l/l混合物的比率润湿。主体混合物用于在播种之前填充穴盘，并且覆盖混合物用于在播种后覆盖种子。
播种后，使用活塞加压手动喷雾器(solo456，solonz)将冷冻干燥和非配制的接种物的悬浮液以浸液形式单独施用于混合物，并且在22天后使用触发泵喷雾器(jet500，mcgregor)以叶面喷雾形式施用于幼苗。所用的比率概述于图29中。
按照2(种子接种剂)×2(种子制剂)×4(散装混合物)×4(覆盖混合物)×3(浸液)×3(叶面喷雾)的因子设计制备总共576种独特的处理组合。在每孔含有25ml盆栽混合物的2×2穴盘中，在每个孔中播种两个经处理的种子，达到10mm的深度。用来自阴性对照的种子制备另外的64孔盘，其中一半用蔗糖处理，剩余的用bp水处理。将它们播种在潮湿的未处理盆栽混合物中。
在施用浸液后，将穴盘放置在生长室中的塑料袋中过夜。由于空间限制，盆栽试验分布在新西兰biotron(林肯大学)的两个生长室(bdw120plantgrowthcabinets，conviron)中。生长室中的条件从25℃光照(400μmol/m2/s)13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。在苗圃中重复整个盆栽试验。最初将穴盘置于涂覆durolite的温室中，但由于低光照条件，在播种后5天移至玻璃暖房中。在盆栽试验的最后一周，它们被送回温室。穴盘以完全随机的顺序安置在各个碟子上。阴性对照随机分布在其他孔盘中，并用作二次传播的指标。
盆栽试验如实施例5中所述被浇水和施肥，并在播种后7天减少成每孔一个正常幼苗。在生长室和苗圃中使用数据记录器(hobou23prov2，onset)每30分钟记录温度和相对湿度。
使用与实施例5中描述的方法类似的方法在盆栽试验中评估幼苗出苗率和黑腐病症状的发生。在播种后15、21和42天进行疾病评估。
针对具有2(种子接种剂)×2(种子制剂)×4(主体混合物)×4(覆盖混合物)×3(浸液)的因子处理结构的完全随机设计，使用anova对出苗率百分比进行统计分析。将第五因子3(叶面喷雾)添加到因子处理结构中用于疾病发生率百分比的anova。用或不用分别作为含有蔗糖或bp的冷冻干燥制剂或非配制制品的桃色欧文氏菌分离株76处理xcc接种的种子。将主体和覆盖混合物用水或桃色欧文氏菌分离株76处理，所述桃色欧文氏菌分离株76作为颗粒或冷冻干燥制剂或非配制的制品。后两种处理和水作为浸液和叶面喷雾施用。分别分析两个地点：生长室和温室，并且对于前者，两个生长室被用作anova的协变量。在主体混合物、覆盖混合物、浸液和叶面喷雾因子的分析中包括对比以检查桃色欧文氏菌和制剂的作用。疾病发生率的百分比是基于连续周中具有症状的幼苗的累积总数。所有统计分析均使用genstat进行。
生长室的平均温度和相对湿度高于苗圃。
在生长室和玻璃暖房两者中，桃色欧文氏菌分离株76的不同制剂和施用方法下的出苗率都高(图30)。
在生长室和玻璃暖房两者中，将桃色欧文氏菌施用于种子是影响疾病发生率的主要因素(图30)。疾病水平平均降低了51％。在玻璃暖房中，冷冻干燥制剂的功效高于非配制的制品，但在生长室中未检测到差异(图31)。
在没有种子施用的情况下，将冷冻干燥制剂或非配制制品的桃色欧文氏菌分离株76添加到生长室中的主体混合物中和玻璃暖房中的覆盖混合物中，与阳性对照相比都显著降低了疾病水平(图31)。疾病水平高于或倾向于高于种子施用，并且施用至种子和盆栽混合物两者没有增强功效。
与冷冻干燥制剂和非配制制品相比，将桃色欧文氏菌的颗粒制剂添加到玻璃暖房中的主体和覆盖混合物以及生长室中的主体混合物中显著增加了疾病水平(图31)。在没有种子施用的情况下，疾病水平高于或等同于阳性对照。
没有证据表明以播种后浸液形式或播种后22天叶面喷雾形式施用桃色欧文氏菌降低了疾病发生率(图31)。
实施例15：苗圃培育的幼苗移植物中的生物控制活性
在不同浇水方案下进行的两个盆栽试验中研究了桃色欧文氏菌分离株76防止在苗圃中的移植物培育期间卷心菜幼苗中xcc的无症状传播的能力。
对于这两个盆栽试验，将桃色欧文氏菌分离株76以种子处理的形式施用于天然感染xcc的卷心菜种子。使用该分离株的冷冻干燥细胞，在非无菌自来水中以5×109cfu/ml的浓度制备桃色欧文氏菌分离株76的接种物。在第一个盆栽试验中，将商业成膜剂peridiam(6.67mg/ml，bayer)和红色染料(6.67mg/ml，bayer)加入到一半接种物中。将接种物以0.6ml/g种子的比率施用于种子，并在层流柜中的封闭但未密封的培养皿中干燥过夜。在第一个盆栽试验中，阳性对照的种子以类似方式处理但没有bca，而裸的“未处理”种子在第二个盆栽试验中用作阳性对照。
在第一个盆栽试验中的不同种子处理按照不同方法播种。对于方法a，将具有成膜剂和染料的种子处理物播种在144穴盘(每孔25ml)中，其含有在商业苗圃中用于芸苔移植物培育的盆栽混合物。这种盆栽混合物由泥炭(0.75m3/m3，newzealandgrowingmedia)、填砂(粒径1-4mm，0.2m3/m3，northendsandandsinglesupplies)、yarapgmix12-14-24(橙色，1.2kg/m3，yara)、nutricotemicrote70day(1kg/m3，yates)、白云石石灰(6.6kg/m3，ravensdown)、石膏(1.5kg/m3，ravensdown)、磷酸岩(0.3kg/m3，summit-quinphos)和penetraidere-wettinggranules(0.5kg/m3，searles)构成，并且含水量为15％。对于方法b，如实施例5中所述，将不含成膜剂和染料的种子处理物播种在含有饱和室内盆栽混合物的144穴盘中。在每个孔中播种单个种子，达到10mm的深度，并准备14个穴盘用于重复的四个处理中的每一个。
将穴盘置于具有防风布末端的未加热温室中，并对播种在商业盆栽混合物中的那些(方法a)在播种20分钟内浇水。在温室中历时2周后，将穴盘移至遮荫棚并再生长4周。试验以裂区设计安排，阳性对照和bca种子处理形成主区，方法a和b为副区。在主区之间竖立塑料屏障以降低交叉污染的可能性。总共有三次重复。每次重复的设置以2周的间隔交错，在第一次和第三次重复的播种之间间隔4周。
在第二个盆栽试验中，将裸的“未处理的”种子和用桃色欧文氏菌分离株76处理的种子播种在含有商业盆栽混合物的144个穴盘中，并在播种20分钟内浇水。对于每个重复，每种处理准备两个孔盘。试验以裂区设计安排，重复四次。将重复的每个处理的一个托盘放置在新西兰biotron(林肯大学)的生长室中。生长室中的条件从25℃光照(400μmol/m2/s)13小时循环至15℃黑暗11小时，具有79％的恒定相对湿度。其余的托盘在林肯大学的苗圃外部生长。将托盘放置在单独的外罩中，这些外罩的一半侧面覆盖有塑料，以防止处理之间的交叉污染，并且剩余侧面和顶部具有通风网以防止卷心菜白蝶。将粘稠的黄色和蓝色昆虫诱捕器(egmontcommercial)悬挂在每个外罩中以捕获蚜虫、粉虱和蓟马。四个重复试验的设置以1周的间隔错开。幼苗生长6周。
根据需要浇灌试验以使盆栽混合物保持在潮湿条件下。在第一个盆栽试验中，这是用手持式浇水棒手动在高处进行，直到将幼苗移到遮荫棚，在遮荫棚中主要使用自动顶置式微喷洒水器。第二个盆栽试验在盆栽混合物的表面上浇水，直到幼苗出现，之后从下面浇水。这包括用水手动填充穴盘基部，然后当盆栽混合物的表面变湿时，排出多余的水。
从播种后14-21天开始，每隔一周将液体肥料(1:200稀释，agrichemhighnk，pggwrightsonturf)在第一个盆栽试验中在高处施用，并且在第二个盆栽试验中从下面施用于穴盘基部中。在第一个盆栽试验中遵循如实施例11中所述的商业苗圃的化学喷雾程序以控制霜霉病和害虫。从播种后14天开始，每周喷洒幼苗。
对于每个试验，使用数据记录器(hobou23prov2，onset)每30分钟记录温度和相对湿度。在第二个盆栽试验中，每天早上8点之前记录植物的表面水分和吐水的出现以及降雨。
如实施例4中所述在播种后7-8天评估幼苗出苗率。在不同阶段针对黑腐病症状评估试验。在第一个盆栽试验中，分别在播种后20-23天和20-44天在子叶中记录了一次和在真叶中记录了2-3次特征性v形褪绿病变和黑化脉(rimmer等人，2007)的存在。在第二个盆栽试验结束时(播种后42天)对真叶进行疾病评估。
在第一个盆栽试验中在播种后43-51天和在第二个盆栽试验中在播种后42-46天，对随机选择的未显示症状的幼苗测试维管流体中xcc和欧文氏菌物种的存在。还测试了在真叶中具有症状的一些幼苗。按照实施例6中描述的方法从植物茎的维管中提取流体。
用引物对zup2311和zup2312通过pcr扩增测试流体的xcc(rijlaarsdam等人，2004)。从流体(50μl)中提取dna，并使用redextract-n-amp植物pcr试剂盒(sigma-aldrich)按照制造商的说明书用0.25μm的每种引物扩增。将反应物在热循环仪中在94℃下温育3分钟，然后经历在94℃下30秒、在60℃下30秒和在72℃下1分钟的35个循环，然后在72℃下温育10分钟。
通过琼脂糖凝胶(1.5％w/v)电泳在1×tae缓冲液中分离扩增产物(10μl)，用溴化乙锭染色并在versadocimager(bio-radlaboratories)上通过uv透照显现。在每个凝胶上包括分子量标志物hyperladder50bp(bioline)，用于确定产物的大小。
用针对桃色欧文氏菌分离株76中的未知功能的蛋白质而设计的引物对欧文氏菌属1f(5’-aaccttcgctcagtttccag-3’)和欧文氏菌属1r(5’-cctgacgttcatccaccag-3’)通过pcr扩增来评估维管流体中欧文氏菌属物种的存在。如上针对zup引物对所述进行反应，不同之处在于退火温度升至63℃。通过琼脂糖凝胶电泳检测长度为263bp的产物。
在每次pcr运行中包括xcc分离株icmp21080(landcareresearch)和桃色欧文氏菌分离株76的标准品。如实施例4所述制备用于这些标准品的接种物，仅在第二个盆栽试验中，后一种标准品由用于种子处理的相同接种物制备。将接种物连续稀释10倍，得到浓度在10至1×106cfu/ml范围的标准品。
在第一个盆栽试验中，针对具有3(重复)+2(主区)+2(副区)和因子处理结构2(种子处理)×2(方法)的裂区设计，使用anova对xcc和桃色欧文氏菌分离株76的出苗率和发生率百分比进行统计学分析。主区是种子处理(对照或桃色欧文氏菌分离株76)，副区是用于处理和生长种子的方法。在方法a中，种子处理与成膜剂和染料组合施用并在商业盆栽混合物中生长，而在方法b中，种子处理仅在自来水中施用并在饱和的室内盆栽混合物中生长。涉及anova的所有统计分析均使用genstat(vsninternational)进行。
将第一个盆栽试验中xcc的发生率分为症状感染百分比、潜伏感染和总疾病发生率。基于具有症状和潜伏感染的植物总数计算总疾病发生率。后者通过将无症状植物的数量乘以具有潜伏感染的植物的比例针对每个重复中的每个处理来估计。进行卡方检验以检验如下假设：潜伏xcc感染与ep76是否发生在使用方法a用该分离株处理的幼苗的维管流体中相关。
在第二个盆栽试验中，针对具有4(重复)+2(主区)+2(副区)和2(地点)×2(种子处理)的因子处理结构的裂区设计，使用anova对xcc和桃色欧文氏菌分离株76的出苗率和发生率百分比以及叶面水分和吐水的频率进行统计分析。主区是地点(苗圃或生长室)，并且副区是种子处理(对照或桃色欧文氏菌分离株76)。
对于用桃色欧文氏菌分离株76处理的种子，两次盆栽试验中出苗率都高(图32和33)。
在第一个盆栽试验中，在<6％的幼苗中检测到疾病症状(图34)。潜伏感染更频繁(>24％)。在商业盆栽混合物中生长的来自桃色欧文氏菌分离株76和成膜剂和染料组合处理的种子(方法a)的幼苗中的xcc感染是最低的，但是当与在饱和的内部盆栽混合物中生长(方法b)的阳性对照比较时，差异才是显著的。在该阳性对照中，症状和潜伏感染均显著高于其他处理。当用自来水中的桃色欧文氏菌分离株76处理种子并使种子在饱和的室内盆栽混合物中生长(方法b)时，症状和潜伏感染与在商业盆栽混合物中生长(方法a)的阳性对照中的那些是相当的。
在6周龄幼苗的维管流体中检测到欧文氏菌属物种(图35)。在商业盆栽混合物中生长来自由桃色欧文氏菌分离株76和成膜剂和染料组合处理的种子(方法a)的幼苗中，欧文氏菌属的出现率显著更高。在维管流体中存在欧文氏菌属对xcc感染没有影响(
在第二个盆栽试验中，6周后卷心菜幼苗中xcc感染的水平低(图36)。在<4％的阳性对照植物的维管流体中检测到xcc。从用桃色欧文氏菌分离株76处理的种子生长的幼苗中，xcc感染水平倾向于更低。它们在生长室中也倾向于比在苗圃中更低。
在第二个盆栽试验中，欧文氏菌属物种出现在<14％的幼苗中(图36)。在由用桃色欧文氏菌分离株76处理的种子生长的植物中，欧文氏菌属在维管流体中的存在显著更高。在生长室和苗圃之间没有发现定殖率不同。
实施例16：田间生物控制活性
研究了桃色欧文氏菌分离株76防护xcc的天然种子传播接种物的能力及其对田间疾病发展的影响，并与第二种bca进行了比较。
在林肯大学(新西兰)的两个不同地点进行了两次田间试验。按照实施例5中描述的方法，用桃色欧文氏菌分离株76或另一种bca处理天然侵染有xcc的卷心菜种子。按照商业实践，在苗圃中培育幼苗移植物。将处理过的种子播种在含有25ml/孔的饱和盆栽混合物(ph5.8，参见实施例5)的144个穴盘中。在每个孔中播种单个种子，达到10mm的深度。按照随机化完全区组设计设置的穴盘最初放置在涂覆durolite的温室中，然后移动到带有防风布端和/或遮荫棚的未加热的温室中，然后在室外进行硬化。如实施例5中所述对幼苗进行浇水和施肥。
除了种子处理之外，还将bca施用于为第二次田间试验而培育的幼苗移植物的叶子。将桃色欧文氏菌分离株76在250ml的lb肉汤中在200rpm的摇床上，在30℃在黑暗中培养16小时。通过测量600nm下的培养物的光密度来确定细菌接种物的浓度。基于该测量，将适当体积的培养物与自来水和成膜剂/润湿剂bind-r-duo(0.8ml/l，sstnewzealand)组合以制备1×1011cfu/l的喷雾。bca仅施用于从用相同分离株处理的种子生长的幼苗的叶子。使用活塞加压的手动喷雾器(solo456，solonz)以6.5ml/s的水速对叶子喷洒至溢流。
将幼苗机械移植到田间。对于第一次田间试验，第一次重复在播种后42天(das)移植，其余三次重复由于恶劣天气条件，在3天后移植。第二次田间试验在播种后41天移植。只有那些可能在移植中存活的幼苗才被转移到田间。田间试验以具有四个区组的随机化完全区组设计设置，每个区组的每个处理有大约600株植物。
在移植之前，将肥料施用于土壤以满足卷心菜的营养需求。在移植之前和之后施用除草剂以控制杂草。一旦进入田间，使用顶喷式喷灌机灌溉植物以维持植物的正常生长。在苗圃和田地两者中根据需要施用杀虫剂以保护植物免遭虫害。
定期评估田间试验中黑腐病症状的发生。在第二次田间试验中，评估仅在田间移植后进行。
针对随机化完全区组设计，使用anova对出苗率和疾病发生率百分比进行统计分析。疾病发生率是基于连续周中感染植物的累积总数。一个区中的第一行和最后一行植物被认为是缓冲植物并且被排除在分析之外。通过根据梯形规则计算曲线下面积并除以第一次和最后一次评估之间的天数来确定平均疾病发生率。
在移植物培育期间进行或不进行叶面施用，桃色欧文氏菌分离株76的种子施用延迟了田间黑腐病的进展(图27和38)。
参考文献
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保藏受理通知和存活证明
每种菌株的保藏受理通知和存活证明(如下表所汇总)在以下页中提供。
序列表
<110>aj帕克
<120>生物控制组合物
<130>836930hcf
<150>nz723115
<151>2016-08-12
<160>22
<170>patentin3.5版
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