病毒抗性烟草及其制备方法与流程

本发明涉及病毒抗性烟草及其制备方法。

背景技术：

马铃薯y病毒(potyvirus)属是植物病毒中最大的一族，以各种植物作为宿主。马铃薯病毒(potatovirus)y(以下称为pvy)是马铃薯y病毒(potyvirus)属的病毒，通过蚜虫而非持续性地传播，感染茄科植物的多个品种。在烟草(nicotianatabacum)中，pvy根据其毒株及感染的烟草品种而引起叶肉深绿变淡、叶脉及茎的坏疽、叶的变黄化、以及生长抑制等症状，其结果是导致烟叶的品质及产量降低，对世界的烟叶生产造成很大损害。特别是在发生叶脉及茎的坏疽症状时，随后由于叶的黄化及褐变，多数情况下植物体自身会枯死，对烟叶的品质及产量造成很大影响(非专利文献1)。而且，在使用感染pvy而品质降低的烟叶作为原料时，生产的烟草产品的品质也大幅降低。

另一方面，烟草丛顶病毒(tobaccobushytopvirus)(以下称为tbtv)是属于伞形植物病毒属(umbravirus)的病毒，是非洲和亚洲发生的烟草丛顶病(tobaccobushytopdisease)的致病病毒。该病毒在自然界中通过蚜虫持续性地传播，对烟草引起生长停滞及叶的斑纹症状，导致品质及产量降低。烟草丛顶病特别是非洲各国的重要病害。

对于烟草而言，已知有对pvy显示出抗性的现有遗传资源virgina突变体(以下称为vam)，并积极地充分用于烟草育种程序中。但是，最近世界上报告了打破vam抗性的pvy新毒株的vam-breaking毒株(有时也标记为pvy-breaking毒株或pvy-b)。因此，目前强烈地需求对该vam-breaking毒株的抗性烟草。过去，报告了通过放射线照射而获得了对vam-breaking毒株的抗性的烟草(非专利文献2)，但尚未确定其引起抗性的基因。另外，已知例如非洲烟草(nicotianaafricana)等烟草野生种中存在对pvy-breaking毒株显示抗性的物质，虽然正在推进对烟草(nicotianatabacum)的应用，但尚未达到实用化。

另一方面，使用43种烟草品种及烟草属(nicotiana)野生种实施了对烟草丛顶病抗性源的探索。其结果是报告了虽然在烟草品种中没有显示出抗性的品种，但数种野生种未表现出症状(非专利文献3)。但是，该抗性的遗传形式并不明确，在进一步从野生种向栽培种烟草(烟草)导入抗性的情况下，可以预测到也会同时导入对品质及产量造成不良影响的性状，距离实用化尚有很长的路。

约200种已知植物病毒抗性基因的约半数为隐性遗传(非专利文献4)。可以认为这些是病毒繁殖及细胞间转移等所需要的宿主因子。通过近10年的研究，这些因子的一部分已经明确。例如，翻译起始因子，如eif4e及eif4g、dead框rna螺旋酶样蛋白(非专利文献5)、富含半胱氨酸的vpg-相互作用蛋白(非专利文献6)及翻译延长因子(非专利文献7)等被确定为隐性的病毒抗性遗传因子。当然，可以认为这并不是全部，另外还有多个候选因子(非专利文献4)，例如，可以列举与植物病毒的筛管运输相关的各种植物因子(非专利文献8)。

病毒在从自身的基因组合成蛋白质时利用宿主的翻译起始机制。2002年报告了拟南芥(arabidopsisthaliana)中的对芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus)(tumv)的隐性抗性遗传因子是作为翻译起始因子eif(iso)4e的突变(非专利文献9)。自此以来，开始了在数种植物中对于eif4e基因家族与对已知的马铃薯y病毒组属病毒的隐性抗性的相关性进行了研究。由此可知，实际上通过eif4e或eif(iso)4e的突变而获得了隐性的病毒抗性。

例如，在专利文献1中记载了一种通过沉默eif4e来对植物赋予病毒抗性的方法。另外，在专利文献2中有关于通过抑制辣椒eif4e的功能而赋予病毒抗性的方法的记载，具体而言，报告了通过编码在特定氨基酸产生了突变的eif4e(不包含eif(iso)4e)的基因的过量表达而赋予病毒抗性的方法。另外，在专利文献3中记载了一种通过eif4e基因或eif(iso)4e基因的剪接突变而具有病毒不发挥作用的eif4e或eif(iso)4e的突变体。突变是在eif4e或eif(iso)4e的非编码区域或剪接元件(外显子/内含子边界部位的±10碱基的区域)的至少1个碱基发生了插入、缺失或取代，优选内含子为对象，更优选第1内含子为对象。另外，专利文献4中记载了与利用eif4e及eif(iso)4e两者中突变组合的对辣椒叶脉斑驳病(pepperveinalmottlevirus、pvmv)抗性植物的筛选相关的方法，具体而言，记载了筛选使eif4e及eif(iso)4e完全不表达且表达突变eif4e的植物的方法。

另外，例如报告了胡椒的引起对pvy的隐性抗性的基因为eif4e(非专利文献10)。另外，报告了三叶草黄叶脉病毒(cloveryellowveinvirus)在eif(iso)4e缺失拟南芥中繁殖，但在eif4e缺失拟南芥中不繁殖，并且与此相反，tumv在eif4e缺失拟南芥中繁殖，但在eif(iso)4e缺失拟南芥中不繁殖(非专利文献11)。另外，为了获得对pvmv的抗性，必须使eif4e及eif(iso)4e两者同时丧失功能(非专利文献12)。作为对近年的翻译起始因子及植物病毒抗性的综述，有例如非专利文献13及非专利文献14等。

还指出了马铃薯y病毒属病毒以外的有限数目的病毒与翻译起始因子的相关性。例如，黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus)(cmv)是黄瓜花叶病毒组(cucumovirus)属病毒，在eif4e或eif4g被破坏的拟南芥中，与cmv的细胞间转移有关的3a蛋白的生产受到阻碍(非专利文献15)。另外，水稻黄斑点病毒(riceyellowmottlevirus)(rymv)是南方菜豆花叶病毒(sobemovirus)属病毒，eif(iso)4g突变的稻变得对该病毒具有抗性(非专利文献16)。

对于与烟草相同为茄科植物的番茄而言，基于番茄突变体实验对象集合的整体分析，研究了马铃薯y病毒组抗性与翻译起始因子eif4e的关系。其中报告了，eif4e基因家族之一的eif4e1的功能抑制赋予对pvy及胡椒斑点病毒(peppermottlevirus)(pepmov)的抗性，而另一方面不赋予对烟草蚀刻病毒(tobaccoetchvirus)(tev)的抗性(非专利文献17)。另外，eif4e2、eif(iso)4e、eif4g及eif(iso)4g的功能抑制同时表现出不赋予对这些马铃薯y病毒属病毒的抗性的情况。另外，如果使用rnai(rna干扰)对eif4e1和eif4e2同时进行功能抑制，则显示出对包含pvy、pepmov及tev的7种马铃薯y病毒属病毒的抗性(非专利文献18)。但是另一方面，有趣的是eif(iso)4e的rnai表现出对这些病毒均没有抗性(非专利文献17)。另外，还表现出番茄的eif(iso)4e与马铃薯y病毒属以外的病毒抗性没有相关性(非专利文献18)。

eif(iso)4e虽然被分类为eif4e家族，但在植物中，通常eif4e与eif(iso)4e的dna序列同一性不满足60％。而且，eif(iso)4e形成与eif4e不同的翻译复合体。具体而言，eif(iso)4e与eif(iso)4g一起形成被称为eif(iso)4f的翻译复合体，eif4e与eif4g一起形成被称为eif4f的翻译复合体。

有在烟草(n.tabacum)中使eif4e1或eif(iso)4e的表达量降低的报告(非专利文献19)。在该报告中记载了使用反义技术抑制了烟草的eif4e1或eif(iso)4e的转录。并且，虽然记载了制备了eif4e1转录物的量被抑制为对照的30～40％的烟草和eif(iso)4e转录物的量被抑制为对照的60％的烟草，以及在两者交配而得到的后代中eif4e1转录物的量降低至对照的26％、eif(iso)4e转录物的量降低至对照的31％，但完全没有记载与病毒抗性的相关性。另外，虽然根据使用了本生烟草(nicotianabenthamiana)的检测体系暗示了pvy的hc-pro蛋白质与烟草的eif(iso)4e发生相互作用的可能性(非专利文献20)，但并未指出与抗性的相关性。

最近，对于烟草而言，根据pvy抗性的vam烟草及pvy敏感性的烟草的转录物的整体分析，发现了在vam烟草中特异性地在转录量低的基因中存在eif4e，该基因发生突变的烟草表现出pvy抗性(非专利文献21、非专利文献22)。烟草(n.tabacum)是具有来自nicotianasylvestris(s)的基因组和来自nicotianatomentosiformis(t)的基因组的双二倍体，因此，来自n.sylvestris(s)的基因和来自n.tomentosiformis(t)的基因基本上各存在一组，在非专利文献22中记载了抑制来自s的eif4e的功能会引起pvy抗性。

另外，最近报告了对于烟草而言，通过抑制作为翻译起始因子之一的eif(iso)4e基因的功能，可具有对于pvy-b及烟草丛顶病毒(tobaccobushytopvirus,tbtv)的抗性(专利文献5)。更具体而言，报告了通过抑制来自t的eif(iso)4e基因的功能而具有pvy-b抗性，通过抑制来自s的eif(iso)4e基因的功能而具有对tbtv的抗性(专利文献5)。

如上所述，烟草(nicotianatabacum)是双二倍体，与通常的二倍体植物相比，基因数量为2倍，源自林烟草(n.sylvestris)的基因和源自绒毛状烟草(n.tomentosiformis)的基因基本上通常各存在一组。因此，与其它的二倍体植物相比，遗传形式复杂。可以认为，在拟南芥中，存在3种eif4e，且存在1种eif(iso)4e(非专利文献13)，对于烟草而言，可在拟南芥中观察到的翻译起始因子均成组存在。可知，如果包含与eif4e在功能上类似的cap结合蛋白(cap-bindingprotein)时，则烟草的eif4e家族至少存在12个(非专利文献22)。进而，如果包含eif4g及eif(iso)4g，则其数量更多。因此，从其中通过功能抑制发现与希望的病毒抗性相关的因素需要大量的劳动。另外，通过制备抑制了翻译起始因子的功能的烟草、并使其组合进行交配，从而制备不同的多个翻译起始因子的功能受到抑制的烟草，研究其病毒抗性，发现与希望的病毒抗性相关的因素更是需要大量劳动。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2006/294618号说明书

专利文献2：美国专利第7772462号说明书

专利文献3：美国专利申请公开第2013/117879号说明书

专利文献4：国际公开第2005/118850号

专利文献5：国际公开第2015/199242号非专利文献

非专利文献1：hendersonr.g.andtroutmanj.l.(1963)aseverevirusdiseaseoftobaccoinmontgomerycounty,virginia.plantdiseasereporter47-3:187-189.

非专利文献2：pulcinellietal.(2009)reportingasourceofpvyntnresistanceinnicotianatabacuml.corestajointstudygroupsmeeting,rovinj,croatia.

非专利文献3：debruin.(1990)sourcesofresistanceinthegenusnicotianatotheviruscausingbushytopdiseaseintobacco.phytophylactica.22:263-264.

非专利文献4：trunigerv,arandama.(2009)recessiveresistancetoplantviruses.advvirusres.75:119-159.

非专利文献5：huangetal.(2010)ahostrnahelicase-likeprotein,atrh8,interactswiththepotyviralgenome-linkedprotein,vpg,associateswiththevirusaccumulationcomplex,andisessentialforinfection.plantphysiol.152:255-266.

非专利文献6：dunoyeretal.(2004)acysteine-richplantproteinpotentiatespotyvirusmovementthroughaninteractionwiththevirusgenome-linkedproteinvpg.j.virol.78:2301-2309.

非专利文献7：hwangetal.(2013)translationelongationfactor1b(eef1b)isanessentialhostfactorfortobaccomosaicvirusinfectioninplants.virology439:105-114.

非专利文献8：hipperetal.(2013)viralandcellularfactorsinvolvedinphloemtransportofplantviruses.frontplantsci.4:article154.

非专利文献9：lellisetal.(2002)loss-of-susceptibilitymutantsofarabidopsisthalianarevealanessentialroleforeif(iso)4eduringpotyvirusinfection.currbiol.12:1046-1051.

非专利文献10：ruffeletal.(2002)anaturalrecessiveresistancegeneagainstpotatovirusyinpeppercorrespondstotheeukaryoticinitiationfactor4e(eif4e).plantj.32,1067-1075.

非专利文献11：satoetal.(2005)selectiveinvolvementofmembersoftheeukaryoticinitiationfactor4efamilyintheinfectionofarabidopsisthalianabypotyviruses.febslett.579:1167-1171.

非专利文献12：ruffeletal.(2006)simultaneousmutationsintranslationinitiationfactorseif4eandeif(iso)4earerequiredtopreventpepperveinalmottlevirusinfectionofpepper.jgenvirol.87,2089-2098.

非专利文献13：robagliaandcaranta.(2006)trendsinplantscience11:40-45.

非专利文献14：leonardoetal.(2012)breedingforresistancetoviraldiseases.infritsche-netoandborem(eds.),plantbreedingforbioticstressresistance.springer-verlagberlinheidelberg.

非专利文献15：yoshiietal.(2004)thearabidopsiscucumovirusmultiplication1and2lociencodetranslationinitiationfactors4eand4g.jvirol.78:6102-6111.

非专利文献16：albaretal.(2006)mutationsintheeif(iso)4gtranslationinitiationfactorconferhighresistanceofricetoriceyellowmottlevirus.plantj.47:417-426.

非专利文献17：pironetal.(2010)aninducedmutationintomatoeif4eleadstoimmunitytotwopotyviruses.plosone5:e11313.

非专利文献18：mazieretal.(2011)knock-downofbotheif4e1andeif4e2genesconfersbroad-spectrumresistanceagainstpotyvirusesintomato.plosone6:e29595.

非专利文献19：combeetal.(2005)translationinitiationfactorseif4eandeifiso4earerequiredforpolysomeformationandregulateplantgrowthintobacco.plantmolecularbiology57:749-760.

非专利文献20：ala-poikelaetal.(2011)helpercomponentproteinaseofthegenuspotyvirusisaninteractionpartneroftranslationinitiationfactorseif(iso)4eandeif4eandcontainsa4ebindingmotif.jvirol.85:6784-6794.

非专利文献21：julioetal.(2013)characterisationofpvy(potatovirusy)resistanceintobacco:potentialroleofaneif4egeneidentifiedbyhighthroughputsequencingtechnologies.corestameetingagro-phytogroupsabstr.ap29.

非专利文献22：julioetal.(2015)aeukaryotictranslationinitiationfactor4e(eif4e)isresponsibleforthe“va”tobaccorecessiveresistancetopotyviruses.plantmolbiolrep.33:609-623.

技术实现要素：

发明要解决的课题

虽然已知对pvy-b具有抗性的烟草，但如上所述，仅有几例，其抗性的持续性也尚不明确。因此，为了避免潜在的基因易损性(geneticvulnerability)，需要开发其它新型对包含pvy-breaking毒株的病毒的抗性烟草。同样地，与pvy相关，为了避免基因易损性，也需要开发新的抗性烟草。

因此，本发明是鉴于上述的问题而完成的，其目的在于提供对pvy或pvy-b具有更强抗性的新型抗性烟草。

解决课题的方法

本发明的病毒抗性烟草的一个方式是生产对病毒无功能的翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质、或翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达得到抑制，以及生产对病毒无功能的翻译起始因子eif4e2蛋白质、或翻译起始因子eif4e2基因的表达得到抑制，其中，上述翻译起始因子eif(iso)4e是eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t中的至少一者，上述翻译起始因子eif4e2是eif4e2-s及eif4e2-t中的至少一者。

本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式包括通过以下方式制备对病毒具有抗性的烟草：

生产对病毒无功能的翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质、或将抑制eif(iso)4e基因表达的突变导入eif(iso)4e基因；以及

生产对病毒无功能的翻译起始因子eif4e2蛋白质、或将抑制eif4e2基因表达的突变导入eif4e2基因，

其中，上述翻译起始因子eif(iso)4e是eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t中的至少一者，

上述翻译起始因子eif4e2是eif4e2-s及eif4e2-t中的至少一者。

本发明的病毒抗性烟草制备方法的另一个方式包括通过以下方式制备对病毒具有抗性的烟草：

导入使翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达量少于野生型的因子；以及导入使翻译起始因子eif4e2基因的表达量少于野生型的因子，

其中，上述翻译起始因子eif(iso)4e是eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t中的至少一者，

上述翻译起始因子eif4e2是eif4e2-s及eif4e2-t中的至少一者。

本发明的病毒抗性烟草的育种后代的制备方法的一个方式是使上述的病毒抗性烟草制备方法中制备的病毒抗性烟草或其后代自花受粉或异花受粉。

本发明的检测用多核苷酸的组合物的一个方式包含第一检测用多核苷酸和第二检测用多核苷酸，所述第一检测用多核苷酸是用于检测烟草的翻译起始因子eif4e2基因中的突变的多核苷酸，其中，该突变是生产对病毒无功能的eif4e2蛋白质、或抑制eif4e2基因表达的突变，所述第二检测用多核苷酸是用于检测烟草的翻译起始因子eif(iso)4e基因中的突变的多核苷酸，其中，该突变是生产对病毒无功能的eif(iso)4e蛋白质、或抑制eif(iso)4e基因表达的突变。

本发明的病毒抗性烟草筛选方法的一个方式包括：检测工序，利用上述的检测用多核苷酸的组合物检测在烟草中有无基因组dna中的上述突变；筛选工序，筛选在上述检测工序中检测到上述突变的烟草作为病毒抗性烟草。

本发明的判定用dna标记物的组合物的一个方式是用于判定烟草对病毒的抗性的dna标记物，其包含第一判定用dna标记物和第二判定用dna标记物，其中，

所述第一判定用dna标记物包含由含有翻译起始因子eif4e2基因中的突变的连续的碱基序列或其互补序列构成的多核苷酸，该突变是生产对病毒无功能的eif4e2蛋白质、或抑制eif4e2基因表达的突变，

所述第二判定用dna标记物包含由含有翻译起始因子eif(iso)4e基因中的突变的连续的碱基序列或其互补序列构成的多核苷酸，该突变是生产对病毒无功能的eif(iso)4e蛋白质、或抑制eif(iso)4e基因表达的突变。

本发明的烟叶的一个方式是上述病毒抗性烟草的烟叶。

本发明的烟草制品的一个方式包含上述烟叶作为原料。

发明的效果

根据本发明，可以提供对病毒具有抗性的新型病毒抗性烟草。

附图说明

图1是示出在烟草品种tn90中导入eif(iso)4e基因的rnai构建物而成的重组烟草中的、通过定量pcr得到的s型及t型的eif(iso)4e基因的表达分析的结果的图。图1示出了将对照的转录物的量的平均值设为1时的相对表达量。

图2是示出在烟草品种sr1中导入eif4e2基因或eif(iso)4e基因的rnai构建物而成的重组烟草中的、通过定量pcr得到的eif4e2基因及eif(iso)4e基因的基因表达分析的结果的图。图2示出了将对照的转录物的量的平均值设为1时的相对表达量。条形表示标准误差。

具体实施方式

本申请发明人等发现了通过抑制烟草的翻译起始因子eif4e2及eif(iso)4e这2种基因的功能来赋予复合病毒抗性的方法。通过该方法制备成的烟草对于potyvirus属病毒的pvy(potatovirusy)及pvy-b(pvy的vam-breaking毒株)、以及umbravirus属病毒的tbtv(烟草丛顶病毒(tobaccobushytopvirus))具有抗性。具体而言，制备对缺失了eif4e2-s的烟草品种tn90导入后述的抑制eif(iso)4e-t基因及eif(iso)4e-s这两种基因的转录的rnai构建物而成的重组烟草，实施了病毒检测，结果是对pvy、pvy-b、tbtv这3种病毒均具有抗性。另外，该重组烟草显示出比抑制了eif4e2-s的功能的烟草更强的对pvy的抗性，显示出比eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t这两者的功能被破坏的烟草更强的对pvy-b的抗性。另一方面，制备eif4e2-s及eif(iso)4e-t的功能被破坏的烟草突变体进行了病毒检测，结果是显示出比抑制了eif4e2-s的功能的烟草更强的对pvy的抗性，显示出比eif(iso)4e-t的功能被破坏的烟草即eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t这两者的功能被破坏的烟草更强的对pvy-b的抗性。另外，制备eif4e2-s、eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t这三者的功能被破坏的烟草突变体进行了病毒检测，结果是显示出比抑制了eif4e2-s的功能的烟草更强的对pvy的抗性，显示出比eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t这两者的功能被破坏的烟草更强的对pvy-b的抗性。

关于pvy，报告了vam抗性的原因在于翻译起始因子eif4e2-s基因的缺失，另外，关于pvy-b及tbtv，报告了由eif(iso)4e基因的功能被破坏引起的抗性，但尚不知晓对3种病毒全部具有抗性的烟草。

eif4e2及eif(iso)4e这两者的功能受到抑制的烟草对pvy、pvy-b及tbtv均具有抗性，实用性更高。需要说明的是，eif4e2-s及eif(iso)4e这两者的功能受到抑制的烟草对于pvy及pvy-b的抗性分别比现有的抗性烟草、即比eif4e2-s功能抑制烟草及eif(iso)4e功能抑制烟草有所增强，这是预料之外的，是意想不到的协同效应。

以下，对本发明的病毒抗性烟草的实施方式进行说明。需要说明的是，在本说明书中，在没有特别说明的情况下，表示数值范围的“a～b”是指“a以上且b以下”。

〔1.病毒抗性烟草及其制备方法〕

本实施方式的病毒抗性烟草是生产对病毒无功能的翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质或翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达得到抑制的、以及生产对病毒无功能的翻译起始因子eif4e2蛋白质或翻译起始因子eif4e2基因的表达得到抑制的病毒抗性烟草。

在本说明书中，“病毒抗性”是指与易感性烟草品种相比，由于病毒感染，烟草发生的症状会延迟、或变得轻微、或不发生。作为烟草发生的症状，可以列举：生长停滞、叶脉坏疽、茎坏疽、明脉、以及斑点等。或者，“病毒抗性”是指与易感性烟草品种相比，病毒的增殖受到抑制、或病毒在细胞间的转移受到抑制。

另外，“烟草”可以包括烟草的整个植物、植物组织(例如，叶、茎、花、根、生殖器官、胚及它们的一部分等)、苗及种子、以及干燥的叶、茎、花、根及种子等。

作为烟草(nicotiana)属植物的烟草(nicotianatabacum)是双二倍体，具有来自于作为原种的林烟草(nicotianasylvestris)的基因组(s型基因组)及来自于绒毛状烟草(nicotianatomentosiformis)的基因组(t型基因组)这两者。因此，n.tabacum具有碱基序列不同的2组eif(iso)4e基因及碱基序列不同的2组eif4e2基因。因此，“生产无功能的翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质”是指，生产无功能的翻译起始因子eif(iso)4e-s蛋白质、生产无功能的翻译起始因子eif(iso)4e-t蛋白质、或者上述两者。同样地，“翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达受到抑制”是指，翻译起始因子eif(iso)4e-s基因的表达受到抑制、翻译起始因子eif(iso)4e-t基因的表达受到抑制、或者上述两者。另外，“生产无功能的翻译起始因子eif4e2蛋白质”是指，生产无功能的翻译起始因子eif4e2-s蛋白质、生产无功能的翻译起始因子eif4e2-t蛋白质、或者上述两者。同样地，“翻译起始因子eif4e2基因的表达受到抑制”是指，翻译起始因子eif4e2-s基因的表达受到抑制、翻译起始因子eif4e2-t基因的表达受到抑制、或者上述两者。即，在本说明书中，在没有特别说明的情况下，简称为“eif(iso)4e”的情况是指eif(iso)4e-s或eif(iso)4e-t或这两者。同样地，在没有特别说明的情况下，简称为“eif4e2”的情况是指eif4e2-s或eif4e2-t或这两者。另外，在各基因中，有时将eif(iso)4e-s及eif4e2-s简称为“s型”，有时将eif(iso)4e-t及eif4e2-t简称为“t型”。

因此，关于各基因的s型及t型，将生产无功能的蛋白质的基因或基因的表达受到抑制的基因以小写字母“s”及“t”表示，将并非如此的正常基因以大写字母“s”及“t”表示，在该情况下，本实施方式的病毒抗性烟草存在以下的9个组合，均包含在本发明的范围内。

(1)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(2)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(3)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(4)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(5)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(6)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(7)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(8)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

(9)eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt

在本说明书中，不限于n.tabacum所含有的翻译起始因子，将具有来自于n.sylvestris的基因组的nicotiana属植物中该来自于n.sylvestris的基因组所编码的eif(iso)4e及eif4e2分别称为“eif(iso)4e-s”及“eif4e2-s”。同样地，将具有来自于n.tomentosiformis的基因组的nicotiana属植物中该来自于n.tomentosiformis的基因组所编码的eif(iso)4e及eif4e2分别称为“eif(iso)4e-t”及“eif4e2-t”。

因此，在本说明书中，“烟草”不仅包含n.tabacum，还包含具有来自于n.sylvestris的基因组及来自于n.tomentosiformis的基因组中至少种的nicotiana属的其它品种。作为这样的nicotiana属的其它品种，可以列举：n.sylvestris及tomentosae节中包含的nicotiana属植物，例如：绒毛烟草(n.tomentosa)、绒毛状烟草(n.tomentosiformis)、川上烟草(n.kawakamii)、耳状烟草(n.otophora)、赛特氏烟草(n.setchellii)、以及粘毛烟草(n.glutinosa)。

“对病毒无功能的eif(iso)4e蛋白质”是指病毒在自身增殖或细胞间转移时无法利用(至少利用受到部分阻碍)的eif(iso)4e蛋白质，包括：在烟草中无法实现正常的eif(iso)4e蛋白质功能(作为翻译起始因子的功能)的情况、以及虽然在烟草中实现了正常的eif(iso)4e蛋白质功能但病毒无法利用的情况这两者。对于“对病毒无功能的eif4e2蛋白质”而言，也是指同样的含义。这些蛋白质例如可以在细胞内生产。

是否对病毒为无功能的可以通过病毒检测来确认。病毒检测可以通过症状研究来进行，或者通过病毒蛋白或病毒基因组的检测或测定等来进行。病毒蛋白的检测及测定可以使用例如使用了对病毒蛋白的抗体的elisa法及蛋白质印迹法(westernblot)。对于该抗体及elisa试剂盒而言，也可以利用市售的抗体和试剂盒。例如，对于pvy及pvy-b而言，可以使用agdia(注册商标)公司的pvypathoscreenkit(注册商标)等。另外，在病毒rna基因组的检测及测定中可以使用例如逆转录定量pcr法。具体而言，可以从公共数据库获得例如pvy的基因组序列，设计适合定量pcr用的引物及探针序列，进行以将从植物样品中提取到的rna进行逆转录得到的cdna样品作为模板的pcr。通过症状研究，只要作为对象的烟草与翻译起始因子中没有突变的烟草相比，症状延迟、症状轻微或未见症状，则对病毒无功能。或者，通过病毒蛋白或病毒基因组的检测或测定等，只要作为对象的烟草与翻译起始因子中没有突变的烟草相比，该病毒蛋白或病毒基因组的量优选为一半以下、更优选为1/3以下、进一步优选为1/4以下、最优选为1/5以下，则对病毒无功能。

“eif(iso)4e基因的表达量”可以是eif(iso)4e转录成mrna的量(转录水平或转录物的量)及eif(iso)4e翻译成蛋白质的量(翻译水平或翻译产物的量)中的任一者，也可以是两者。因此，“eif(iso)4e的表达受到抑制”包括：与野生型相比，转录受到抑制的情况；与野生型相比，翻译受到抑制的情况；与野生型相比，转录及翻译两者受到抑制的情况。需要说明的是，“转录受到抑制”也包括转录物被分解的情况。即，“eif(iso)4e的表达受到抑制”也包括例如由于转录产物被分解，与野生型相比，eif(iso)4e基因的表达量受到抑制的情况。对于“eif4e2基因的表达量”及“eif4e2的表达受到抑制”，具有同样的含义。这些基因的表达是指例如细胞内的表达。

病毒抗性烟草所显示出抗性的病毒没有特别限定，可以列举例如：感染烟草的苜蓿花叶病毒(alfamovirus)属病毒(例如苜蓿花叶病毒)、植物昆虫病毒(curtovirus)属病毒(例如昆虫曲顶病毒(beetcurlytopvirus))、菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)属病毒(例如烟草曲叶病毒(tobaccoleafcurlvirus))、黄瓜花叶病毒(cucumovirus)属病毒(例如黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus)和花生矮化病毒(peanutstuntvirus))、等轴不稳定环斑病毒(ilarvirus)属病毒(例如烟草条纹病毒(tobaccostreakvirus))、马铃薯y病毒属病毒(例如马铃薯病毒y(pvy)、烟草蚀纹病毒(tobaccoetchvirus)、烟草叶脉斑点病毒(tobaccoveinmottlingvirus)及烟草脉带花叶病毒(tobaccoveinbandingmosaicvirus))、烟草花叶病毒(tobamovirus)属病毒(例如烟草花叶病毒)、烟草脆裂病毒(tobravirus)属病毒(例如烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus))、坏死病毒(necrovirus)属病毒(例如烟草坏死病毒(tobacconecrosisvirus))、巨脉病毒属(varicosavirus)属病毒(例如tobaccostuntvirus)、nepovirus属病毒(例如tobaccoringspotvirus)、伞形植物病毒(umbravirus)属病毒(例如烟草丛顶病毒(tobaccobushytopvirus)和烟草斑点病毒(tobaccomottlevirus))、马铃薯卷叶病毒属(polerovirus)属病毒(例如烟草脉曲黄病毒(tobaccoveindistortingvirus))、玉米线条病毒属(mastrevirus)属病毒(例如烟草黄矮病毒(tobaccoyellowdwarfvirus))、以及蕃茄斑萎病毒属(tospovirus)属病毒(例如蕃茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus))等病毒。本发明的病毒抗性烟草可以对1种病毒具有抗性，也可以对多种病毒具有抗性。本发明的病毒抗性烟草可以对马铃薯y病毒(potyvirus)属的病毒具有明显的抗性，其中，可以具有对于马铃薯病毒y(pvy)的pvy-o毒株、pvy-c毒株、pvy-z毒株、pvy-n(包含ntn和nw)毒株、特别是对于pvy毒株(vam-breaking毒株)的抗性，所述pvy毒株打破烟草的virgina突变体的病毒抗性或打破eif4e2-s缺失或功能抑制的烟草品系的病毒抗性。另外，本发明的病毒抗性烟草可以对伞形植物病毒(umbravirus)属病毒具有明显的抗性，其中，可以具有对烟草丛顶病毒(tobaccobushytopvirus,tbtv)的抗性。

(eif4e2基因)

将野生型的eif4e2-s基因的cdna序列的一例示于序列号1(genbank收录号：kf155696)。在序列号1中，可读框(openreadingframe)是第112号～第771号的碱基。另外，将野生型的eif4e2-s蛋白质的氨基酸序列及基因组的碱基序列的各一例示于序列号2及3。在序列号3中，翻译起始密码子是第241～243号的碱基，翻译终止密码子是第5307～5309号的碱基。另外，外显子是第131～491号的碱基(第1外显子)、第3031～3196号的碱基(第2外显子)、第3309～3434号的碱基(第3外显子)、第5106～5171号的碱基(第4外显子)、以及第5259～5540号的碱基(第5外显子)。

将野生型的eif4e2-t基因的cdna序列的一例示于序列号4(genbank收录号：km202068)。在序列号4中，可读框是第61～717号的碱基。另外，将野生型的eif4e2-t蛋白质的氨基酸序列及基因组的碱基序列的各一例示于序列号5及6。在序列号6中，翻译起始密码子是第1765～1767号的碱基，翻译终止密码子是第7112～7114号的碱基。另外，外显子是第1705～2012号的碱基(第1外显子)、第4639～4804号的碱基(第2外显子)、第4915～5040号的碱基(第3外显子)、第6927～6992号的碱基(第4外显子)、以及第7064～7114号的碱基(第5外显子)。

需要说明的是，genbank收录号km202068的eif4e2-t基因与genbank收录号kf155696的eif4e2-s基因的蛋白质编码区域的dna序列同一性为93.2％(657碱基中的612碱基一致)。另外，氨基酸序列的同一性为87.7％(219氨基酸中的192氨基酸一致)，相似性为97％。

具有相同功能的植物基因的蛋白质编码区域的碱基序列根据基因可以在栽培品种之间具有1％～数％左右的差异，可以在栽培品种与亲缘野生种之间有数％～10％左右的差异。在本说明书中，发生突变前的野生型的eif4e2基因中包含生成与由序列号1或序列号4所示的碱基序列构成的cdna对应的mrna的基因、以及编码由序列号2或序列号5所示的氨基酸序列构成的eif4e2蛋白质的基因。另外，在本说明书中，发生突变前的野生型eif4e2基因中包含下述基因，所述基因生成与由和序列号1或序列号4所示的碱基序列构成的cdna对应的mrna具有94％以上、优选95％以上、更优选97％以上、进一步优选99％以上的序列同一性的mrna，且编码功能性eif4e2蛋白质。另外，在本说明书中，野生型的eif4e2基因中包含下述基因，所述基因编码与序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有88％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的序列同一性的功能性eif4e2蛋白质。另外，在本说明书中，野生型的eif4e2基因包含下述基因，所述基因生成与在序列号1或序列号4所示的碱基序列中取代、缺失、插入和/或添加了1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～12个、1～10个、1～8个、1～5个、1～3个、1～2个或1个碱基而成的碱基序列对应的mrna，且编码功能性eif4e2蛋白质。另外，在本说明书中，野生型的eif4e2基因包含下述基因，所述基因编码具有在序列号2或序列号5所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1～20个、1～15个、1～12个、1～10个、1～8个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸而成的氨基酸序列的功能性eif4e2蛋白质。

例如，在本说明书中，发生突变前的野生型的eif4e2-t基因中包含mrna序列为genbank收录号km202068序列的基因。该序列是来自于烟草品系t021658的eif4e2-t基因的序列，对应于km202068的蛋白质编码区域的dna序列与烟草品种k326的eif4e2-t的基因组dna序列的外显子序列的序列同一性为99.2％(657碱基中的652碱基一致)。可以认为约1％的不同(657碱基中的5碱基的不同)是由烟草品系/品种之间的差异引起的。

需要说明的是，在本说明书中，“碱基序列的同一性”是指在多个碱基序列中完全相同的碱基的排列以多大程度的比率存在。同样地，“氨基酸序列的同一性”是指在多个氨基酸序列中完全相同的氨基酸的排列以多大程度的比率存在。另外，在本说明书中，“氨基酸序列的相似性”是指在多个氨基酸序列中完全相同的氨基酸或性质相似的氨基酸的排列以多大程度的比率存在。作为性质相似的氨基酸的例子，可以列举例如：具有带正电荷的残基的赖氨酸、精氨酸及组氨酸；具有带负电荷的残基的天冬氨酸及谷氨酸；具有非极性即疏水性的残基的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及脯氨酸；有极性但无电荷的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺。

关于“碱基序列的同一性”、“氨基酸序列的同一性”或“氨基酸序列的相似性”，可以用本领域技术人员通常使用的序列分析(相同性检索)程序blast(文献：altschuletal.(1990)basiclocalalignmentsearchtool.jmolbiol.215:403-410.)等或市售的核酸/氨基酸分析软件来进行计算。blast检索可以在genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)或日本dna数据库(dnadatabankofjapan)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html)等网站进行。此时，可以更改各种检索参数，但通常使用默认值。

另外，在本说明书中，“突变”是指dna中的点突变、缺失、插入、重复、易位及倒位，在没有特别说明的情况下是指相对于野生型的碱基序列的差异。

上述野生种的eif4e2基因的碱基序列可以使用序列号1或序列号4所示的碱基序列，利用blast程序等对genbank中收录的林烟草(n.sylvestris)、绒毛状烟草(n.tomentosiformis)或耳状烟草(n.otophora)的基因组(全基因组鸟枪法重叠群(wholegenomeshotguncontigs))进行相同性检索而得到。或者，源自烟草属植物的植物种的eif4e2基因的碱基序列可以使用例如基于本说明书所示的eif4e2的基因序列设计的引物序列，利用pcr法从该植物种的基因组dna扩增eif4e2基因并确定碱基序列来得到。作为相同性检索，可以使用blast程序，也可以使用市售的核酸/氨基酸序列分析软件。

另外，使用序列号1或序列号4所示的碱基序列作为探针，根据烟草野生种的基因组文库或cdna文库在严格条件进行杂交实验，由此能够获得烟草野生种的eif4e2基因的碱基序列。

(eif(iso)4e基因)

将野生型的eif(iso)4e-s基因的cdna序列的一例示于序列号7(genbank收录号：ay699609)。在序列号7中，可读框是第70～672号的碱基。另外，将野生型的eif(iso)4e-s蛋白质的氨基酸序列及基因组的碱基序列的各一例示于序列号8及9。在序列号9中，翻译起始密码子是第201～203号的碱基，翻译终止密码子是第4938～4940号的碱基。另外，外显子是第132～397号的碱基(第1外显子)、第1730～1898号的碱基(第2外显子)、第2029～2154号的碱基(第3外显子)、第4723～4785号的碱基(第4外显子)、以及第4893～5096号的碱基(第5外显子)。

将野生型的eif(iso)4e-t基因的cdna序列的一例示于序列号10(genbank收录号：eb683576)。在序列号10中，可读框是第37～624号的碱基。另外，将野生型的eif(iso)4e-t蛋白质的氨基酸序列及基因组的碱基序列的各一例示于序列号11及12。在序列号12中，翻译起始密码子是第201～203号的碱基，翻译终止密码子是第3418～3420号的碱基。另外，外显子是第164～382号的碱基(第1外显子)、第1620～1788号的碱基(第2外显子)、第1919～2044号的碱基(第3外显子)、第3205～3267号的碱基(第4外显子)、以及第3373～3593号的碱基(第5外显子)。

具有相同功能的植物基因的蛋白质编码区域的碱基序列根据基因可以在栽培品种之间有1％～数％左右的差异，可以在栽培品种与亲缘野生种之间有数％～10％左右的差异。在本说明书中，发生突变前的野生型eif(iso)4e基因中包含生成与由序列号7或序列号10所示的碱基序列构成的cdna对应的mrna的基因、以及编码由序列号8或序列号11所示的氨基酸序列构成的eif(iso)4e蛋白质的基因。另外，在本说明书中，发生突变前的野生型eif(iso)4e基因中包含下述基因，所述基因生成与由和序列号7或序列号10所示的碱基序列构成的cdna对应的mrna具有92％以上、优选95％以上、更优选97％以上、进一步优选99％以上的序列同一性的mrna，且编码功能性eif(iso)4e蛋白质。另外，在本说明书中，野生型eif(iso)4e基因中包含下述基因，所述基因编码与序列号8或序列号11所示的氨基酸序列具有92％以上、优选95％以上、更优选97％以上、进一步优选99％以上的序列同源性的功能性eif(iso)4e蛋白质。另外，在本说明书中，野生型eif(iso)4e基因包含下述基因，所述基因生成与在序列号7或序列号10所示的碱基序列中取代、缺失、插入和/或添加了1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～12个、1～10个、1～8个、1～5个、1～3个、1～2个或1个碱基而成的碱基序列对应的mrna，且编码功能性eif(iso)4e蛋白质。另外，在本说明书中，野生型eif(iso)4e基因包含下述基因，所述基因编码具有在序列号8或序列号11所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1～20个、1～15个、1～12个、1～10个、1～8个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸而成的氨基酸序列的功能性eif(iso)4e蛋白质。

例如，在本说明书中，发生突变前的野生型的t型eif(iso)4e-t基因中包含cdna序列为genbank收录号fn666434的序列的基因。该序列是来自于源自烟草品种samsunnn的eif(iso)4e-t基因的序列，与源自烟草品种k326的eif(iso)4e-t的cdna序列eb683576的序列同一性为97％。这2个基因所编码的蛋白质的氨基酸序列的同一性(identity)为97％、相似性(similarity)为99％。

可以认为上述的烟草属植物的eif(iso)4e基因的cdna序列与序列号7或序列号10所示的碱基序列具有90％以上的序列同一性。实际上，序列号7所示的碱基序列与林烟草(n.sylvestris)的eif(iso)4e基因的cdna序列显示出100％的序列同一性(不包括内含子)。序列号10所示的碱基序列与绒毛状烟草(n.tomentosiformis)的eif(iso)4e的cdna序列显示出99％的序列同一性(不包括内含子)。序列号7所示的碱基序列及序列号10所示的碱基序列分别与耳状烟草(n.otophora)的eif(iso)4e的基因组序列中除内含子以外的部分显示出98％和99％的序列同一性。

上述野生种的eif(iso)4e基因的碱基序列可以使用序列号7或序列号10所示的碱基序列，利用blast程序等对genbank中收录的林烟草(n.sylvestris)、绒毛状烟草(n.tomentosiformis)或耳状烟草(n.otophora)的基因组(全基因组鸟枪法重叠群(wholegenomeshotguncontigs))进行相同性检索而得到。或者，源自烟草属植物的植物种的eif(iso)4e基因的碱基序列可以使用例如基于本说明书所示的eif(iso)4e基因的碱基序列设计的引物序列，利用pcr法从该植物种的基因组dna扩增eif(iso)4e基因并确定碱基序列来得到。作为相同性检索，可以使用blast程序，也可以使用市售的核酸/氨基酸序列分析软件。

另外，使用序列号7或序列号10所示的碱基序列作为探针，根据烟草野生种的基因组文库或cdna文库在严格条件进行杂交实验，由此能够获得烟草野生种的eif(iso)4e基因的碱基序列。

(病毒抗性烟草的第一方式)

在病毒抗性烟草的一个方式中，通过使翻译起始因子eif(iso)4e基因中具有突变，生产对病毒无功能的翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质、或翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达得到抑制。

或者，通过使翻译起始因子eif4e2基因中具有突变，生产对病毒无功能的翻译起始因子eif4e2蛋白质、或翻译起始因子eif4e2基因的表达得到抑制。

或者，在翻译起始因子eif(iso)4e基因及翻译起始因子eif4e2基因这两者中具有突变。

在本发明的病毒抗性烟草在eif(iso)4e基因的编码区域具有突变的情况下，可以引起eif(iso)4e蛋白质的氨基酸序列的突变。同样地，在本发明的病毒抗性烟草在eif4e2基因的编码区域具有突变的情况下，可以引起eif4e2蛋白质的氨基酸序列的突变。作为氨基酸序列的突变，可以列举：取代、缺失及插入等。在突变为氨基酸的取代的情况下，取代的氨基酸及取代后的氨基酸只要是使对象基因的蛋白质为对病毒无功能即可，没有特别限定，例如，优选为非保守取代(non-conservativesubstitutions)。作为非保守取代，可以列举：将氨基酸取代为电荷或疏水性不同的其它氨基酸(从碱性氨基酸取代为酸性氨基酸或从极性氨基酸取代为非极性氨基酸等)、以及将某氨基酸取代为支链大小不同的其它氨基酸。其中，使其对病毒无功能的突变在本发明的范围内。是否对病毒无功能可以通过病毒检测来确认。另外，在编码区域具有突变的情况下，可以是移码突变或无义突变(变成终止密码子的突变)。在无义突变(变成终止密码子的突变)的情况下，发生无义介导的mrna衰变(nonsense-mediatedmrnadecay)(文献：brognaandwen2009,nat.structuralmol.biol.16:107-113)，有时转录物被分解。在该情况下，无义突变的位置优选位于第1外显子、第2外显子和/或第3外显子，更优选位于第1外显子和/或第2外显子。在移码突变或无义突变的情况下，该突变的位置，优选为比基因的5’末端侧的一半左右更靠近5’末端侧。具体而言，优选在第1外显子、第2外显子和/或第3外显子存在突变。越接近5’末端，蛋白质中的正常部分越短，因此对病毒无功能的可能性增高。

在本发明的病毒抗性烟草在非编码区域具有突变的情况下，虽然对编码的eif(iso)4e蛋白质及eif4e2蛋白质的氨基酸序列不造成影响，但可以使dna或mrna的二级结构改变、使用于转录或翻译机制的结合部位改变、或者使trna结合效率降低。由此，可以使转录水平降低、使翻译水平降低。

或者，在作为对象的基因的翻译起始密码子atg中的g突变为a的情况下，不进行正确的翻译起始，无法翻译正确的目标蛋白质。另外，在5’末端侧的非编码区域具有突变的情况下，因该突变而在与正确的可读框不同的可读框中产生atg(起始密码子)时，有可能从该错误的可读框开始翻译。即使在这样的情况下也不能生产正常的目标蛋白质。例如，在突变原为后面叙述的甲磺酸乙酯(ems)的情况下，gtg的g突变为a时或acg的c突变为t时，产生新的atg。在该情况下，可读框错位时，无法翻译正确的目标蛋白质。

在各基因的内含子5’末端的gt的g、或3’末端的ag的g突变为a时，不能在正确的位置除去内含子，无法翻译正确的蛋白质。

在eif(iso)4e基因或eif4e2基因的转录受到抑制的情况下，eif(iso)4e基因或eif4e2基因的转录物的量与野生型相比优选为20％以下，更优选为10％以下，进一步优选为5％以下。另外，在eif(iso)4e基因或eif4e2基因的翻译受到抑制的情况下，eif(iso)4e基因或eif4e2基因的翻译产物的量与野生型相比优选为20％以下，更优选为10％以下，进一步优选为5％以下。

另外，由于eif(iso)4e基因的突变，eif(iso)4e基因的rna的剪接有时无法正常地发挥功能。或者，由于eif4e2基因的突变，eif4e2基因的rna的剪接有时无法正常地发挥功能。例如，在内含子的5’末端侧的包含gt的前后10碱基、优选为5碱基、更优选为1碱基发生了突变的情况下、或者在内含子的3’末端侧的包含ag的前后10碱基、优选为5碱基、更优选为1碱基发生了突变的情况下，无法良好地进行内含子的切除，产生异常的mrna，可以生产对病毒无功能的eif(iso)4e蛋白质或eif4e2蛋白质、或者抑制eif(iso)4e基因或eif4e2基因的翻译。

在对象基因产生突变的方法没有特别限定，可以使用公知的方法。

作为突变原，可以使用例如：甲磺酸乙酯(ems)、叠氮化纳、溴化乙啶及亚硝酸等化学试剂，但使烟草的基因组dna发生突变的化学试剂并不限定于此。另外，作为突变原，可以列举例如：γ射线、重离子束、x射线、中子射线或uv等，但使烟草的基因组dna发生突变的放射线等并不限定于此。作为突变原，优选ems。

作为突变原处理的烟草的组织或器官，可以列举：种子、根、叶及花等，只要能使植物体再生即可，对其种类没有特别限定，优选为种子。关于诱变群体，对各种类型的植物组织经验性地确定诱变性的化学试剂或放射线的用量，使得能够得到低于达到致死性或生殖不育性的阈值水平的突变频率。

另外，作为突变原，也可以使用转座子(可移动遗传因子)。转座子在烟草基因组上转移，可以抑制对象基因的功能。作为这样的转座子的优选例子，可以举出烟草的反转录转座子tnt1。或者也可以将其它植物的转座子导入烟草来使用。作为这样的转座子，可以列举例如：玉米的转座子ac/ds、spm/dspm及mu、稻的转座子ndart、以及金鱼草的转座子tam等，但并不限定于此。

另外，将存在于土壤杆菌的ti质粒中的t-dna随机地(atrandom)插入烟草，也可以抑制eif(iso)4e基因或eif4e2基因的功能。因此，可以制备插入了t-dna的烟草突变体群体(实验对象集合)，并以eif(iso)4e基因或eif4e2基因的碱基序列为指标从其中筛选功能受到抑制的个体。

在作为对象的基因中具有纯合突变的病毒抗性烟草的制备方法的一例中，如上所述用突变原对烟草进行处理，制备使烟草基因组全体发生突变的烟草突变体群体(实验对象集合)，提取基因组dna。利用基因特异性引物，由实验对象集合的各个基因组dna或它们混合而成的dna对作为对象的基因进行扩增，确定其产物的碱基序列，筛选导入了突变的品系。突变的种类优选为伴有氨基酸突变的突变或无义突变，更优选为无义突变。播种筛选得到的品系的种子，从培育的植物中提取dna，筛选对于作为对象的基因导入纯合突变的个体。对于由此得到的、在目标基因中产生了纯合突变的品系进行病毒检测确认了抗性。此时，可以使用定量pcr等进行目标基因的表达分析，确认降低了转录量。

因此，在病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，可以包括以下至少1个工序：制备使烟草基因组全体发生突变的烟草突变体群体(实验对象集合)的工序、提取基因组dna的工序、确定对象基因的碱基序列的工序、筛选导入了纯合突变的品系的工序、以及进行病毒检测确认抗性的工序。

另外，为了去除对象基因以外的dna部位中导入的突变，可以使突变处理后的品系与未进行突变处理的品系在任意时机进行杂交。

从烟草突变体中提取基因组dna只要基于公知的方法来进行即可，也可以使用市售的提取试剂盒。另外，基因组dna可以是粗纯化物，也可以是经过若干纯化工序后的纯化品。

多核苷酸的扩增可以通过例如pcr法来进行，也可以通过其它公知的基因扩增方法、例如lcr(连接酶链式反应，ligasechainreaction)法或lamp(环介导的等温扩增，loop-mediatedisothermalamplification)法等来进行。

用于扩增各多核苷酸的引物序列例如可以如下所述进行设计。可以根据eif(iso)4e-s基因的碱基序列和eif(iso)4e-t基因的碱基序列的同一性分析结果，找到s型特异性区域及t型特异性区域，对该区域设计引物。通过使用该引物，可以从s型及t型混合存在的烟草基因组分别特异性地扩增s型及t型的基因。对于eif4e2基因也是同样的。作为待设计的部位，可以从s型或t型特异性区域选择，优选为内含子、5’非翻译区域或3’非翻译区域。引物的长度优选为15碱基～30碱基，特别优选为17碱基～25碱基。另外，作为用于扩增包含突变部位的给定碱基数的序列的引物，只要能够发挥功能，可以在该序列中包含1个或1个以上的取代、缺失和/或添加。另外，引物可以根据需要用荧光物质或放射性物质等进行标记。

扩增的各多核苷酸的长度只要是能够利用后面叙述的各种检测方法的长度即可，没有特别限定，例如为20碱基～5000碱基，更优选为50碱基～2000碱基，进一步优选为100碱基～700碱基，更进一步优选为100碱基～500碱基。

以下，作为检测突变的方法，举出代表性的方法，但并不限定于此。

(1)通过利用市售的测序仪等直接读取各多核苷酸的碱基序列来检测有无突变的方法。

(2)使用sscp(singlestrandconformationpolymorphism：单链构象多态性)法检测有无突变的方法。

从利用上述方法检测出突变的烟草突变体中，利用对对象基因的特异性引物确认扩增后的(pcr)产物的碱基序列，由此可以弄清楚突变是纯合突变还是杂合突变。

在ems处理的情况下，多数dna的突变为c→t和g→a。因此，通过ems处理进行突变时，成为终止密码子(即，成为无义突变的候选)的密码子为caa(最初的c取代为t)、cga(最初的c取代为t)、tgg(第2个g或第3个g取代为a)及cag(最初的c取代为t)这4种。

例如，在序列号3所示的eif4e2-s基因的基因组序列的情况下，如果(1)第389号的g取代为a、(2)第390号的g取代为a、(3)第398号的g取代为a、(4)第399号的g取代为a、(5)第427号的c取代为t、(6)第437号的g取代为a、(7)第438号的g取代为a、(8)第488号的g取代为a、(9)第489号的g取代为a、(10)第3114号的g取代为a、(11)第3115号的g取代为a、(12)第3147号的g取代为a、(13)第3148号的g取代为a、(14)第3186号的g取代为a、(15)第3187号的g取代为a、(16)第3330号的c取代为t、(17)第3375号的c取代为t、(18)第3403号的g取代为a、(19)第3404号的g取代为a、(20)第3432号的c取代为t、(21)第5121号的c取代为t、(22)第5125号的g取代为a、(23)第5126号的g取代为a，则成为终止密码子(taa、tag或tga)。因此，在病毒抗性烟草的一个优选例子中，突变是序列号3所示的eif4e2-s基因的基因组序列中的上述(1)～(23)所示的1个以上的突变。其中，优选为(1)～(22)中任意发生突变的情况，更优选为(1)～(20)中任意发生突变的情况。

另外，在序列号6所示的eif4e2-t基因的基因组序列的情况下，如果(1)第1913号的g取代为a、(2)第1914号的g取代为a、(3)第1922号的g取代为a、(4)第1923号的g取代为a、(5)第1948号的c取代为t、(6)第1958号的g取代为a、(7)第1959号的g取代为a、(8)第2009号的g取代为a、(9)第2010号的g取代为a、(10)第4722号的g取代为a、(11)第4723号的g取代为a、(12)第4755号的g取代为a、(13)第4756号的g取代为a、(14)第4794号的g取代为a、(15)第4795号的g取代为a、(16)第4936号的c取代为t、(17)第4981号的c取代为t、(18)第5009号的g取代为a、(19)第5010号的g取代为a、(20)第5038号的c取代为t、(21)第6942号的c取代为t、(22)第6946号的g取代为a、(23)第6947号的g取代为a，则成为终止密码子(taa、tag或tga)。因此，在病毒抗性烟草的一个优选例子中，突变是序列号6所示的eif4e2-t基因的基因组序列中的上述(1)～(23)所示的1个以上的突变。其中，优选为(1)～(22)中任意发生突变的情况，更优选为(1)～(20)中任意发生突变的情况。

另外，在序列号9所示的eif(iso)4e-s基因的基因组序列的情况下，如果(1)第270号的c取代为t、(2)第295号的g取代为a、(3)第296号的g取代为a、(4)第304号的g取代为a、(5)第305号的g取代为a、(6)第315号的c取代为t、(7)第330号的c取代为t、(8)第343号的g取代为a、(9)第344号的g取代为a、(10)第357号的c取代为t、(11)第394号的g取代为a、(12)第395号的g取代为a、(13)第1740号的c取代为t、(14)第1813号的g取代为a、(15)第1814号的g取代为a、(16)第1846号的g取代为a、(17)第1847号的g取代为a、(18)第1888号的g取代为a、(19)第1889号的g取代为a、(20)第2050号的c取代为t、(21)第2104号的c取代为t、(22)第2123号的g取代为a、(23)第2124号的g取代为a、(24)第2152号的c取代为t、(25)第4742号的g取代为a、(26)第4743号的g取代为a、或(27)第4926号的c取代为t，则成为终止密码子(taa、tag或tga)。因此，在病毒抗性烟草的一个优选例子中，突变是序列号9所示的eif(iso)4e-s基因的基因组序列中的上述(1)～(27)所示的1个以上的突变。其中，优选为(1)～(26)中任意发生突变的情况，更优选为(1)～(24)中任意发生突变的情况。

另外，在序列号12所示的eif(iso)4e-t基因的基因组序列的情况下，如果(1)第264号的c取代为t、(2)第289号的g取代为a、(3)第290号的g取代为a、(4)第298号的g取代为a、(5)第299号的g取代为a、(6)第315号的c取代为t、(7)第328号的g取代为a、(8)第329号的g取代为a、(9)第342号的c取代为t、(10)第379号的g取代为a、(11)第380号的g取代为a、(12)第1630号的c取代为t、(13)第1703号的g取代为a、(14)第1704号的g取代为a、(15)第1736号的g取代为a、(16)第1737号的g取代为a、(17)第1778号的g取代为a、(18)第1779号的g取代为a、(19)第1940号的c取代为t、(20)第1994号的c取代为t、(21)第2013号的g取代为a、(22)第2014号的g取代为a、(23)第2042号的c取代为t、(24)第3224号的g取代为a、(25)第3225号的g取代为a、或(26)第3406号的c取代为t，则成为终止密码子(taa、tag或tga)。因此，在病毒抗性烟草的一个优选例子中，突变是序列号12所示的eif(iso)4e-t基因的基因组序列中的上述(1)～(26)所示的1个以上的突变。其中，优选为(1)～(25)中任意发生突变的情况，更优选为(1)～(23)中任意发生突变的情况。

或者，突变可以是以下(a)～(d)的外显子中的突变：(a)编码由序列号2或序列号5所示的氨基酸序列构成的eif4e2蛋白质的野生型eif4e2基因的外显子、(b)编码与序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有88％以上序列同一性的功能性eif4e2蛋白质的野生型eif4e2基因的外显子、(c)编码由序列号8或序列号11所示的氨基酸序列构成的eif(iso)4e蛋白质的野生型eif(iso)4e基因的外显子、或者(d)编码与序列号8或序列号11所示的氨基酸序列具有92％以上序列同一性的功能性eif(iso)4e蛋白质的野生型eif(iso)4e基因的外显子，而且，所述突变可以是这些外显子中的下述(1)～(4)所示的1个以上的突变：(1)密码子caa的c取代为t、(2)密码子cga的c取代为t、(3)密码子cag的c取代为t、(4)密码子tgg的g(2个g中的任一者或两者)取代为a。

作为使对象基因发生突变的其它方法，也可以使用基因编辑技术。基因编辑技术是指向基因组的任意区域导入突变的技术。作为这样的技术，可以列举例如：talen(转录激活物样效应物，transcriptionactivator-likeeffectornuclease)、crispr(聚簇规则散布短回文重复，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)/cas、odm(寡核苷酸指导的诱变，oligonucleotidedirectedmutagenesis)及zfn(锌指核酸酶，zincfingernuclease)等。

odm和zfn的定义记载于文献：lusseretal.(2012)naturebiotechnology30:231-239。另外，对于odm，例如在文献：zhuetal.(1999)proc.natl.acad.sci.usa96:8768-8773、以及文献：ohandmay(2001)currentopinioninbiotechnology12:169-172.中记载了对植物的应用。对于zfn，在文献：duraietal.(2005)nucleicacidsres33:5978-5990中记载了对植物的应用。按照上述记载的方法可以向作为对象的基因中导入突变。

对于talen，如下所述。源自植物病原菌的dna结合蛋白转录激活物样(tal)效应物具有34个氨基酸重复的结构部分，该重复结构逐个碱基识别dna的碱基。dna中有4种碱基(a、t、g、c)，但由tal效应物的重复结构的第13号和第14号2个氨基酸决定dna序列的结合特异性。即，通过选择各重复结构的第13～14号氨基酸，能够人为地使tal效应物与希望的dna区域结合。将使该tal效应物与在二聚体时显示出dna切断活性的酶foki融合而成的酶称为tal效应物核酸酶(talen)。当设计为使2个该talen在彼此附近结合时，foki形成二聚体，切断2个talen之间的dna。发生切断后，可以进行dna的修复，但此时，有时切断部位稍被切除或导入了新的添加。已知talen对植物也起作用(文献：zhangetal.(2013)plantphysiology161:20-27)。

例如，优选在蛋白质编码区域中，对作为对象的基因特异性的优选15碱基～25碱基、更优选18碱基～22碱基的核苷酸序列进行设计。另外，在距其优选9碱基～15碱基的部位同样地设计核苷酸序列。上述2个核苷酸所包夹的部分随后被切断。

为了判断设计的核苷酸序列是否为对象基因特异性，可以通过对例如烟草(n.tabacum)或林烟草(n.sylvestris)或绒毛状烟草(n.tomentosiformis)的公知的序列数据库对设计的核苷酸序列进行同一性检索，来研究序列本身以外是否具有包含该序列的同源性高的区域。作为序列数据库，可以利用例如：genbank、embl(欧洲分子生物学实验室，theeuropeanmolecularbiologyloboratory)或ddbj(日本dna数据库，dnadatabankofjapan)等。作为序列分析算法，可以利用例如blast等。另外，作为数据库的序列的种类，有核苷酸集合(nucleotidecollection)(nr/nt)、表达序列标签(expressedsequencetags)(est)、基因组测量序列(genomicsurveysequences)(gss)、以及全基因组鸟枪法重叠群(wholegenomeshotguncontigs)(wgs)等，但并不限定于此。

基于设计的特异性核苷酸序列，对tale的基因序列进行设计。多个重复结构的结合可以使用例如goldengatetalenkit(addgene公司)，但并不限定于此。在使tale与foki融合时，例如可以设置适当的接头序列。需要说明的是，foki序列收录于公知数据库。用于使tale/foki融合基因在烟草中表达的启动子优选为高表达的启动子，可以列举：花椰菜花叶病毒35srna基因的启动子、肌动蛋白基因的启动子及泛素基因的启动子等的组成性表达启动子；rubisco小亚基基因的启动子、ppdk基因启动子等绿色组织特异性启动子；以及其它的器官或时期特异性启动子，但并不限定于此。为了提高表达量，可以在启动子与tale/foki之间设置希望的内含子。进而，为了提高表达量，还可以将tale/foki的密码子最优化为植物(烟草)的密码子。植物密码子记载于例如密码子选择数据库(codonusagedatabase)(http://www.kazusa.or.jp/codon/)等公知的数据库中。

在用于将talen表达盒(expressioncassette)导入植物的载体中，除了上述以外，还可以加入用于筛选导入了表达盒的植物细胞的耐药性基因(筛选标记物)的表达盒。作为耐药性基因，可以是能够筛选烟草细胞的药剂的耐受性基因，可以列举例如：卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶：npt-ii)及潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸转移酶：hpt)等，但并不限定于此。另外，只要启动子是组成性表达即可，没有特别限定。

另外，在将talen表达盒稳定地导入植物时利用土壤杆菌的情况下，talen表达盒和筛选标记物表达盒需要存在于t-dna中。在该情况下，作为t-dna的边界序列，右边界(rb)序列和左边界(lb)序列设置于t-dna的两端。

作为能够将基因导入烟草的载体，所述载体是用于将talen表达盒导入植物的载体，可以列举例如：pbi系、psb系(文献：komarietal.2006methodsinmol.biol.343:15-41.)、plc系(文献：美国专利第8298819号说明书)、以及pgreen(文献：hellensetal.2000plantmol.biol.42:819-832.)等，但不限定于此。

将talen表达盒导入植物的方法没有特别限定，可以使用上述使用土壤杆菌的方法、基因枪法、peg法、电穿孔法或农杆菌渗入法(agroinfiltration)等本领域技术人员通常使用的方法。另外，作为导入的烟草的组织或器官，只要能使植物体再生即可，对其种类没有特别限定，可以列举例如：种子、根、叶及花等。

对于转化植物的筛选及培育而言，只要是本领域技术人员就能够容易地实施。作为用于筛选的药剂，并不限定于此，可以列举：卡那霉素和潮霉素等。药剂的浓度可以设为例如20mg/ml～200mg/ml，优选为50mg/ml～100mg/ml。植物培养物的培育用的培养基可以是通常使用的培养基，作为无机盐的种类，可以列举ms和ls等，向其中添加例如：蔗糖、琼脂或植物激素等。它们的使用浓度可以按照本领域技术人员通常使用的技术方案作为基准。

作为进行基因导入的组织或器官，除了上述以外，还可以使用原生质体。原生质体可以使用细胞壁分解酶按照通常方法制备。另外，作为基因导入法，除了上述的稳定转化法，还可以使用瞬时法(transientmethod)。瞬时试验(transientassay)可以使用电穿孔法或peg法等通常方法来实施。另外，作为其它瞬时试验法，可以列举：农杆菌渗入法和病毒载体等。作为病毒载体，可以使用alsv(苹果潜在球形病毒，applelatentsphericalvirus)或trv(烟草脆裂病毒)等，但并不限定于此。

在从导入了基因的细胞再生得到的个体或组织或器官中，作为对象的基因中是否产生了突变可以通过以下方式来确认：以包夹作为目标的区域的方式设计引物，从希望的植物组织中提取dna，通过pcr等对该区域进行扩增，并弄清楚其产物的碱基序列。

分析基因表达的方法没有特别限定，可以用rna印迹杂交(northern杂交)法或定量pcr法等公知的方法来进行。用于杂交的探针可以是对象基因的cdna的碱基序列或其一部分、或者上述序列中存在1个或多个碱基的取代、缺失或插入的碱基序列，探针长度可以为例如20碱基～序列全长。

用于进行上述表达分析的rna提取可以通过盐酸胍法或sds-苯酚法等公知的方法来进行，也可以使用市售的试剂盒。另外，可以从总rna中进一步对mrna(polya+rna)进行纯化。

用于实施定量pcr的cdna的合成可以通过使用了逆转录酶和低聚dt引物或基因特异性引物的公知方法来进行，也可以使用市售的试剂盒。

另外，用于定量pcr的引物可以基于对象基因的cdna的碱基序列来设计。作为引物的长度，优选为15碱基～30碱基，特别优选为17碱基～25碱基。通过一组引物组扩增的靶序列的长度没有特别限定，例如可以为40碱基～序列全长，优选为50碱基～500碱基。

在实施使用了荧光pcr装置的定量pcr时，除了上述引物，还可以在靶序列中设定探针序列。靶序列的长度优选为40碱基～200碱基，进一步优选为50碱基～150碱基。作为标记引物和探针的报告染料(reporterdye)，可以列举：fam、hex、tet及cyanine5，并且淬灭染色，可以列举：tamra和bhq1等，但并不限定于此，本领域技术人员可以适当选择并组合。用作定量pcr的内标物的基因，只要是组成性表达基因即可，没有特别限定，作为优选的基因，可以列举：延长因子基因及肌动蛋白基因等。

对于crispr/cas，如下所述。crispr/cas系统是使用识别dna序列的指导rna和cas核酸酶的基因编辑技术，已知在植物中也发挥作用(文献：belhajetal.(2013)plantmethods9:39)。该技术是切断基因组上具有希望的序列的dna的技术，关于靶基因组序列的缺失、添加及插入，与talen一样，依赖于宿主的dna修复系统的错误。

作为用于在植物中使cas9表达的启动子，优选高表达的启动子，可以列举例如：上述的35srna基因的启动子、泛素基因的启动子及ppdk基因启动子等，但并不限定于此。为了提高表达量，也可以将希望的内含子设置于启动子与cas9之间。需要说明的是，cas9的碱基序列是公知的。另外，为了提高表达量，还可以将cas9的密码子最优化为植物(烟草)的密码子。另外，还可以在cas9中添加核定位信号nls(nuclearlocalizesignal)。

设计希望的基因组序列和互补的指导rna。例如，优选在蛋白质编码区域确定对象基因特异性的优选19碱基～22碱基的核苷酸序列。此时，在该序列的3’末端侧需要存在被称为原间隔物相邻基序(protospacer-adjacentmotif)(pam)的ngg序列。另外，在下面叙述的启动子的种类为u6的情况下，转录起始点(向导rna的5’末端)需要为g，在u3启动子的情况下需要为a。

为了判断向导rna的序列是否具有对象基因特异性，可以对例如烟草(n.tabacum)或林烟草(n.sylvestris)或绒毛状烟草(n.tomentosiformis)的序列数据库对于设计的序列进行同一性检索，来研究序列本身以外是否具有包含该序列的同源性高的区域。关于序列数据库及分析算法，与上述相同。

设计向导rna之后，在其3’末端侧融合sgrna支架(scaffold)序列，形成sgrna(向导(g)rna+grna支架)，制备用于表达该sgrna的构建物(construct)。此时，作为启动子，可以使用rna聚合酶iii的u6或u3等的启动子。使用适当的载体将完成的构建物导入烟草，对重组体进行筛选、再生。需要说明的是，为了更可靠地产生突变，可以在对象基因内部设计多个向导rna，并将表达它们的构建物同时导入烟草。在该情况下，可以在1个t-dna上同时设置多个向导rna表达盒和cas9表达盒。

需要说明的是，用于将使指导rna和cas9表达的盒导入植物的载体、以及烟草转化的方法与上述talen中的说明相同。

作为进行基因导入的组织或器官，除了上述以外，还可以使用原生质体。原生质体可以按照通常方法使用细胞壁分解酶来制备。另外，作为基因导入法，除了上述稳定转化法，可以使用瞬时法。对于瞬时试验，与上述talen中的说明相同。

在从导入了基因的细胞再生而成的个体或组织或器官中是否使对象基因产生突变，可以按照与上述talen中的说明相同的方法来确认。

作为病毒检测方法，可以列举：病毒溶液与碳化硅等固体粉末组合的机械接种法、以及使用具有病毒的蚜虫的虫媒接种法等，但并不限定于此。另外，使用的病毒没有特别限定，作为病毒抗性烟草显示出抗性的病毒，可以使用上述列举的病毒。

eif(iso)4e基因及eif4e2基因两者具有突变的病毒抗性烟草的制备方法没有特别限制，可以列举：利用eif(iso)4e基因具有突变的病毒抗性烟草与eif4e2基因具有突变的病毒抗性烟草的交配的方法；对于eif(iso)4e基因具有突变的病毒抗性烟草，在eif4e2基因中导入突变的方法；对于eif(iso)4e基因具有突变的病毒抗性烟草，导入使eif4e2基因的表达量降低的因子的方法；对于eif4e2基因具有突变的病毒抗性烟草，在eif(iso)4e基因中导入突变的方法；以及，对于eif4e2基因具有突变的病毒抗性烟草，导入使eif(iso)4e基因的表达量降低的因子的方法等。

另外，作为s型的eif(iso)4e基因、t型的eif(iso)4e基因、或这两种基因的功能受到抑制的烟草突变体，可以使用专利文献5中记载的突变体。

需要说明的是，在本实施方式中，“病毒抗性烟草”不仅包含如上所述制备及筛选得到的初代的烟草，还包含其后代的烟草。

(病毒抗性烟草的第二方式)

在病毒抗性烟草的一个方式中，通过将使翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达量少于野生型的因子导入烟草，翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达得到抑制。

或者，通过将使翻译起始因子eif4e2基因的表达量少于野生型的因子导入烟草，翻译起始因子eif4e2基因的表达得到抑制。

或者，导入了使翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达量少于野生型的因子、以及使翻译起始因子eif4e2基因的表达量少于野生型的因子这两者。

作为使对象基因的表达量少于野生型的方法，可以使用现有公知的方法，可以列举例如利用了反义、共抑制、rna干扰(rnai)、microrna、vigs(病毒诱导的基因沉默，virusinducedgenesilencing)、核酶、同源重组、以及显性负性基因产物的表达等的方法。

“使表达量少于野生型”是指，虽然只要与野生型相比减少即可，没有限制，但在将野生型的表达量设为100％时，优选减少至20％以下，更优选减少至10％以下，进一步优选减少至5％以下。这里，“野生型”是指未导入抑制对象基因表达的因子、且在对象基因中不具有突变的烟草。

需要说明的是，在本实施方式中，“病毒抗性烟草”也不仅包含导入了上述因子等的初代的烟草，还包含其后代的烟草。

作为抑制对象基因的表达的方法，优选为rnai。具体而言，制备使用对象基因(eif(iso)4e基因或eif4e2基因)的碱基序列或其一部分作为触发器(trigger)的rnai构建物，与在植物中表达的启动子连接，使用载体将其导入烟草。然后，使rnai构建物表达，得到使对象基因的表达受到抑制的病毒抗性烟草。因此，一个方式中的病毒抗性烟草可以保持用于抑制对象基因的表达的rnai构建物。

触发器的长度可以为例如21碱基～序列全长，优选为50碱基以上，更优选为100碱基以上。触发器序列中可以有1个或多个碱基的取代、缺失或插入。

通过使用s型基因和t型基因中序列同一性高的部分作为触发器的序列，可以利用一种rnai构建物抑制s型基因及t型基因两者的基因表达。即，例如在导入了以eif(iso)4e-s基因的序列作为触发器的rnai构建物的情况下，如果该触发器的序列与eif(iso)4e-t基因的序列的序列同一性高，则不仅可抑制eif(iso)4e-s基因的表达，还可以抑制eif(iso)4e-t基因的表达。对于eif4e2基因也是同样的。

在rnai中，将触发器序列功能性连接，使得其1个为正义方向另1个为反义方向，制备触发器序列反向重复的rnai构建物。此时，两触发器之间优选加入间隔序列。作为这样的间隔序列，优选为烟草的基因组中不含有的序列、或者内含子序列等成熟mrna中不含有的区域。作为这样的序列，可以列举例如：β葡萄糖醛酸酶(gus)基因、丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvatedehydrogenasekinase)(pdk)及过氧化氢酶(cat)基因等的内含子序列，但并不限定于此。

作为用于使rnai构建物在植物中转录的启动子，可以列举例如：花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus)35srna基因的启动子、肌动蛋白基因的启动子、以及泛素基因的启动子等组成性表达启动子；rubisco小亚基(rubiscosmallsubunit)基因的启动子及ppdk基因启动子等绿色组织特异性启动子；以及其它器官或时期特异性启动子，但并不限定于此。作为上述启动子，优选为在病毒感染的组织中表达的启动子。

另外，作为终止子，可以列举：花椰菜花叶病毒35srna或19srna基因的终止子、以及胭脂碱合成酶基因的终止子等，只要在植物中发挥作用即可，但并不限定于此。

在用于将rnai表达盒导入植物的载体中，除了上述以外，还可以加入耐药性基因的表达盒，所述耐药性基因的表达盒用于筛选导入了上述rnai表达盒的植物细胞。作为耐药性基因，只要是能够筛选烟草细胞的耐药性基因即可，可以列举例如：卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶：npt-ii)及潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸转移酶：hpt)等，但并不限定于此。另外，只要启动子也是进行组成性表达的启动子即可，没有特别限定。

另外，在稳定地向植物中导入rnai表达盒时利用土壤杆菌的情况下，rnai表达盒和筛选标记物表达盒需要存在于t-dna中。在该情况下，作为t-dna的边界序列，右边界(rb)序列及左边界(lb)序列可以分别设置于t-dna的两端。

另外，为了从视觉上预测基因表达，可以在t-dna中设置荧光蛋白质的表达盒。作为荧光蛋白质，可以列举例如绿色荧光蛋白质(gfp)及黄色荧光蛋白质(yfp)等，但并不限定于此。作为荧光蛋白质，优选为gfp。荧光可以用图像分析仪进行观察。

作为能够将基因导入烟草中的载体，其用于将rnai表达盒导入植物，可以列举例如：pbi系、psb系(文献：komarietal.2006methodsinmol.biol.343:15-41.)、plc系(文献：美国专利第8298819号说明书)、pgreen(文献：hellensetal.2000plantmol.biol.42:819-832.)、phellsgate(文献：wesleyetal.2001plantj27:581-590.)、以及psp231(文献：国际公开第2011/102394号公报)等，但并不限定于此。

将rnai表达盒导入植物的方法没有特别限定，可以利用使用上述土壤杆菌的方法、基因枪法、peg法、电穿孔法或农杆菌渗入法等本领域技术人员通常使用的方法。另外，作为导入的烟草组织或器官，只要能够使植物体再生即可，对其种类没有特别限定，可以列举例如：种子、根、叶及花等。

对于转化植物的筛选和培育而言，只要是本领域技术人员就能够容易地实施。作为用于筛选的药剂，可以列举：卡那霉素和潮霉素等，但并不限定于此。药剂的浓度可以为例如20mg/ml～200mg/ml，优选为50mg/ml～100mg/ml。植物培养物的培育用培养基可以使用通常所用的培养基，作为无机盐的种类，可以举出ms和ls等，可以向其中添加例如：蔗糖、琼脂或植物激素等。这些的使用浓度只要按照本领域技术人员通常使用的实验方案即可。

对于分析基因表达的方法和病毒检测方法，如上所述。

需要说明的是，本领域技术人员应当容易理解，病毒抗性烟草可以是上述第一方式与上述第二方式的组合。即，可以是以下的方式：通过在作为对象的基因中的任一者中具有突变，生产对病毒无功能的蛋白质；或者，抑制了基因的表达，对其它对象基因，通过将使对象基因的表达量少于野生型的因子导入烟草，抑制了对象基因的表达。

另外，也可以是利用被认为对象基因中的任一种基因的功能缺失的烟草品种、品系或现有种与上述第一方式或上述第二方式组合的烟草。作为这样的烟草品种、品系或现有种的例子，例如，作为被认为s型eif4e2基因的功能缺失的烟草品种、品系、现有种，可以非限定地举出：virginamutant、perevi、scr、bursana、kerti、havana211、远州、冲绳1、tn86、tn90、tn97、k326pvy、nc291及nc745等。另外，可以举出非专利文献yamamoto,y.(1992)studiesonbreedingoftobaccovarietiesresistanttoveinalnecrosisdiseasebypotatovirusystraint.bulletinoftheleaftobaccoresearchlaboratory,1-87.中记载的烟草植物，所述烟草的s型eif4e2基因自身缺失、或在该基因内部存在碱基缺失、碱基取代或碱基插入的。需要说明的是，这里所谓的基因不仅包含编码蛋白质的区域，还包含启动子、内含子或终止子。有无基因自身的缺失、基因内部的缺失、取代或插入，可以通过以作为对象的基因的碱基序列作为基础，例如设计扩增基因全长或一部分的引物，以研究对象的烟草的dna为模板进行pcr，从而进行判断。例如，如果产物未被扩增，则可以判断基因自身缺失，如果产物被扩增，则可以通过对其碱基序列进行解读，从而容易地判断有无碱基的缺失、取代或插入。

在烟叶生产中，对多种病毒同时具有抗性的遗传资源是极其重要的，目前为止，尚不知晓对pvy、pvy-b及tbtv均具有抗性的烟草。在本实施方式的病毒抗性烟草的一个方式中，可以提供对pvy、pvy-b及tbtv均具有抗性的病毒抗性烟草。

〔2.病毒抗性烟草的育种后代的制备方法〕

另外，本发明提供病毒抗性烟草的育种后代的制备方法。

在该方法的一个方式中，使上述病毒抗性烟草制备方法中制备的病毒抗性烟草或其后代进行自花受粉或异花受粉。这里，受粉可以在自然状态下进行，也可以认为地进行。在一个实施方式中，该后代可以使上述病毒抗性烟草制备方法中制备的初代病毒抗性烟草进行自花受粉或异花受粉而得到，或者从这样得到的后代进一步反复进行自花受粉或异花受粉而得到。

在异花受粉中，与上述的病毒抗性烟草或其后代交配的可以是在各基因中具有相同突变的病毒抗性烟草，可以是在各基因中具有不同突变的病毒抗性烟草，也可以是在各基因中不具有突变的烟草，还可以使在各基因中具有突变但没有病毒抗性的烟草。

在该方法的一个方式中，可以得到杂交种代(f1、f2、···)、突变体的自身繁殖代(m1、m2、···)、回交(bc1、bc2、···)代等的育种后代的烟草。需要说明的是，这些烟草可以具有雄性不育(ms)性状。

另外，本发明提供一种使上述病毒抗性烟草制备方法中制备的病毒抗性烟草或其后代进行自花受粉或异花受粉的病毒抗性烟草育种方法。作为该方法的一个方式，例如，在得到了上述病毒抗性烟草制备方法中制备的在eif(iso)4e基因及eif4e2基因上产生了突变的病毒抗性烟草个体后，与烟草品种或烟草品系交配，制备杂交种第一代f1，但并不限定于此。这里，对该品种或品系进一步进行回交，制备bc1f1。筛选具有该突变的个体，并进一步反复进行与该品种或品系的交配(回交)，制备bcxf1(x为例如3～8)。然后，使该bcxf1自身繁殖，在bcxf2代中，筛选以纯合方式具有该突变的个体，为了固定遗传背景，反复进行自身繁殖(bcxf3、bcxf4、···)，培育新的病毒抗性烟草。需要说明的是，各代的个体筛选可以利用后述的dna标记物。

〔3.dna标记物及其利用〕

在本发明中，可以利用eif4e2基因(eif4e2-s基因或eif4e2-t基因)上发生的突变来开发dna标记物，可以将其充分应用于标记物育种。“dna标记物”是指品种之间或个体之间的dna碱基序列的差异(突变或多态性)、或者用于检测该差异的工具，是指成为用于识别品种或个体的标记物的碱基序列的差异(突变或多态性)、或者用于检测该差异的工具。在确定eif4e2基因中的突变，并确认了由该突变引起对病毒的抗性的情况下，可以将产生了该突变的烟草突变体用作该病毒抗性的育种亲本。此时，由于已知与抗性相关的引起抗性的突变，因此，可以在eif4e2基因上设计能够用于识别引起抗性的突变的标记物。由于该突变与病毒抗性的关系不因遗传分离而切断，因此能够进行精密的标记物育种。如果检测出有无该突变，则在反复进行交配等时不需要每次确认病毒抗性。

另外，与eif4e2基因相关的dna标记物可以和与eif(iso)4e基因相关的同样的dna标记物一起使用。通过组合使用两种基因的标记物，可以减少育种的时间及劳动。

可以基于通常方法进行从烟草提取基因组dna，可以使用市售的提取试剂盒，但没有特别限定。另外，基因组dna可以是粗纯化物，也可以是经过若干纯化工序后的纯化品。作为检测有无突变的技术，有例如：应用了rflp或将单链dna用于探针的核酸(也称为“多核苷酸”)的杂交的技术、以及pcr等这样的伴随多核苷酸扩增的技术等，只要可以检测突变即可，没有特别限定。

在对多核苷酸进行扩增的情况下，可以通过例如pcr法进行，也可以通过其它公知的基因扩增方法、例如、lcr法、sda(链置换扩增，stranddisplacementamplification)法或lamp法等来进行。扩增的各多核苷酸的长度只要是能够用下面叙述的各种检测方法的长度即可，没有特别限定，优选为例如40碱基～5000碱基，更优选为100碱基～1000碱基，进一步优选为100碱基～700碱基，更进一步优选为100碱基～500碱基。

用于扩增各多核苷酸的引物序列优选设计为包夹突变部位或者包含突变部位，但设计引物序列的位置没有特别限定。在以包夹突变部位的方式设计引物序列的情况下，例如，可以将其设计成位于eif4e2基因内。引物的长度优选为15碱基～30碱基，特别优选为17碱基～25碱基。另外，作为用于对包含突变部位的给定碱基数的序列进行扩增的引物，只要能够发挥作用即可，可以在该序列中包含1个或1个以上的取代、缺失和/或添加。另外，引物可以根据需要用荧光物质或放射性物质等进行标记。

检测的突变是生产对病毒无功能的eif4e2蛋白质的突变、或者是抑制eif4e2基因的表达的突变。其具体例子如〔1.病毒抗性烟草〕项所述。

以下，作为检测突变的方法，可以举出代表性的方法，但并不限定于此。

(1)通过利用市售的测序仪等直接读取扩增的多核苷酸的碱基序列来检测有无突变的方法。

(2)使用sscp(单链构象多态性，singlestrandconformationpolymorphism)法检测扩增的多核苷酸上有无突变的方法。

(3)对于扩增的多核苷酸，利用特异性识别突变部位序列(突变前的序列或突变后的序列)的限制酶进行处理，然后通过是否切断来进行判断的方法(caps(酶切扩增多态性序列法，cleavedamplifiedpolymorphicsequence)法)。另外，可以使用通过包含有意设计的错配引物的引物组来制备限制酶识别部位的dcaps(衍生caps，derivedcaps)法。需要说明的是，本领域技术人员可以不需要花费很多的劳动设计引物序列，进行pcr，检测希望的突变。例如，可以通过网络进行引物序列的设计(文献：neffetal.(2002)web-basedprimerdesignforsinglenucleotidepolymorphismanalysis.trendsingenetics18:613-615)。

需要说明的是，在引物之一的3’末端附近导入错配的情况下，在使用具有校对活性的dna聚合酶进行pcr时，错配被修正，有可能无法被限制酶切断。因此，在dcaps法中，在使用错配引物时，优选不具有校对活性的dna聚合酶。作为这样的dna聚合酶，可以举出takarataq^tm(takarabio公司)，但并不限定于此。另外，在引物的3’末端附近导入限制酶切断部位的情况下，可以以引物长度的差异的形式来检测是否切断。

(4)通过设计在突变部分特异性地杂交的探针并使其杂交来确认有无突变的方法。

分析方法没有特别限定，可以使用例如：使用taqman(注册商标)探针法的pcr、或者作为利用tof-ms的测定技术的massarray(注册商标)分析等。

(5)设计引物序列使一部分含有突变部位的序列(突变前的序列和/或突变后的序列)，并通过pcr法等使其扩增，由此通过有无扩增来检测有无突变的方法(等位基因特异性pcr法)。作为对照，例如可以使用由对突变前的碱基序列特异性的碱基序列构成的核酸引物。

需要说明的是，在引物的3’末端附近导入目的突变的碱基时，其位置优选为末端或者从末端至数个碱基之间。另外，在引物的3’末端附近导入目的突变时，除了突变型的序列，有时也一起对未突变的野生型序列进行扩增。在这样的情况下，可以将目标错配以外的错配用突变型检测用引物和野生型检测用引物导入相同位置，进行pcr，得到对突变型或野生型特异性的扩增。

另外，根据需要，除了作为目标的基因用引物，还可以在pcr反应液中加入作为pcr内标物的基因用的引物。

需要说明的是，在检测上述例示的突变以外的突变时，本领域技术人员可以不需要花费很多的劳动设计引物序列，进行pcr，检测希望的突变。

需要说明的是，基因突变的检测技术详细地记载于以下文献：日本专利厅的网站<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0025.html>。另外，基因突变的检测和分析方法详细地记载于以下文献：日本专利厅的网站<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0028.html>。或者可以参考文献：agarwaletal.(2008)advancesinmolecularmarkertechniquesandtheirapplicationsinplantsciences.plantcellrep.27:617-631.、neffetal.(1998)dcaps,asimpletechniqueforthegeneticanalysisofsinglenucleotidepolymorphisms:experimentalapplicationsinarabidopsisthalianagenetics.plantj.14:387-392.。

因此，本发明提供用于检测eif4e2基因中的突变的多核苷酸。该突变是生产对病毒无功能的eif4e2蛋白质的突变、或者是抑制eif4e2基因的表达的突变。其具体例子如〔1.病毒抗性烟草〕项所述。

另外，上述检测用多核苷酸的一个方式为核酸引物或核酸引物的组。核酸引物的组可以是包夹上述突变的核酸引物的组，也可以是包含以下多核苷酸的核酸引物的组，所述多核苷酸由包含上述突变的连续的碱基序列或其互补序列构成。上述检测用多核苷酸的另一个方式是与包含上述突变的连续的碱基序列或其互补序列杂交的核酸探针。

另外，与eif4e2基因相关的上述检测用多核苷酸可以和与eif(iso)4e基因相关的同样的检测用多核苷酸组合使用。通过将与eif4e2基因相关的检测用多核苷酸和与eif(iso)4e基因相关的检测用多核苷酸组合使用，可以同时进行两种基因的突变的检测，能够减少育种的时间及劳动。需要说明的是，作为与eif(iso)4e基因相关的检测用多核苷酸，可以使用专利文献5中记载的检测用多核苷酸。

需要说明的是，组合物的形态没有特别限制，可以以预先混合的状态提供，或者可以是以相互不同的容器提供、使用者在即将使用前组合使用的试剂盒的形态。

另外，本发明提供烟草对病毒的抗性的判定方法，该方法的特征在于，在烟草的基因组dna中，将eif(iso)4e基因及eif4e2基因中发生了上述突变作为病毒抗性的指标。

另外，本发明提供病毒抗性烟草的育种方法，该方法的特征在于包括使用上述判定方法筛选对病毒的抗性的烟草的筛选工序。

另外，本发明提供病毒抗性烟草筛选方法，该方法的特征在于包括以下工序：在烟草中利用上述检测用多核苷酸检查基因组dna中有无上述突变的检查工序、将该检查工序中检测出上述突变的烟草作为病毒抗性烟草进行筛选的筛选工序。利用检测用多核苷酸的检查方法的详细情况如上所述。

另外，本发明提供用于判定烟草对病毒的抗性的dna标记物，其特征在于包含：由eif(iso)4e基因中的含有上述突变的连续的碱基序列或其互补序列构成的多核苷酸、以及由eif4e2基因中的含有上述突变的连续的碱基序列或其互补序列构成的多核苷酸。

〔4.烟叶及烟草制品〕

栽培本发明的病毒抗性烟草而生产的烟叶不感染该病毒(例如，打破virgina突变体的病毒抗性的pvy毒株)所引起的病。因此，特别是在发生该病的环境中进行栽培的情况下，与栽培没有病毒抗性的烟草而生产的烟叶相比，品质降低减轻，具有高品质。其结果是能够生产更高品质的烟草产品。

“烟叶”是收获烟草植物的原叶后使其干燥而得到的，是指成为用于制造烟草制品的原料的叶。“烟草制品”是指纸烟(带过滤嘴、无过滤嘴)(cigarette)、雪茄(cigar)、小雪茄(cigarillo)、瑞典口含烟(snus)、鼻烟(snuff)、嚼烟及电子烟等。

因此，本发明提供由上述病毒抗性烟草生产的烟叶。另外，本发明提供烟叶的生产方法，该方法包括使上述病毒抗性烟草收获后的原叶干燥的工序。

另外，本发明提供含有上述烟叶作为原料的烟草产品。

〔5.总结〕

如上所述，本发明的病毒抗性烟草的一个方式是生产对病毒无功能的翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质、或翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达得到抑制，以及生产对病毒无功能的翻译起始因子eif4e2蛋白质、或翻译起始因子eif4e2基因的表达得到抑制，其中，上述翻译起始因子eif(iso)4e是eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t中的至少一者，上述翻译起始因子eif4e2是eif4e2-s及eif4e2-t中的至少一者。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，在上述翻译起始因子eif(iso)4e基因中具有突变，由此，生产对病毒无功能的上述翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质、或抑制了上述翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，在上述翻译起始因子eif4e2基因中具有突变，由此，生产对病毒无功能的上述翻译起始因子eif4e2蛋白质、或抑制了上述翻译起始因子eif4e2基因的表达。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，上述突变优选为无义突变。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，上述翻译起始因子eif(iso)4e基因中的上述突变可以是eif(iso)4e-s基因中的突变、或者是eif(iso)4e-t基因中的突变、或者是eif(iso)4e-s基因中的上述突变及eif(iso)4e-t基因中的上述突变两者，

所述eif(iso)4e-s基因中的突变是以下(a1)或(a2)的外显子中的无义突变：

(a1)编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif(iso)4e-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-s基因的外显子、或

(a2)编码与序列号8所示的氨基酸序列具有92％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif(iso)4e-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-s基因的外显子，

所述eif(iso)4e-t基因中的突变是以下(b1)或(b2)的外显子中的无义突变：

(b1)编码由序列号11所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif(iso)4e-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-t基因的外显子、或(b2)编码与序列号11所示的氨基酸序列具有92％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif(iso)4e-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-t基因的外显子。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，翻译起始因子eif4e2基因中的上述突变可以是eif4e2-s基因中的突变、或者是eif4e2-t基因中的突变、或者是eif4e2-s基因中的上述突变及eif4e2-t基因中的上述突变两者，

所述eif4e2-s基因中的突变是以下(c1)或(c2)的外显子中的无义突变：

(c1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif4e2-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-s基因的外显子、或

(c2)编码与序列号2所示的氨基酸序列具有88％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif4e2-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-s基因的外显子，

所述eif4e2-t基因中的突变是以下(d1)或(d2)的外显子中的无义突变：

(d1)编码由序列号5所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif4e2-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-t基因的外显子、或

(d2)编码与序列号5所示的氨基酸序列具有88％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif4e2-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-t基因的外显子。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，上述无义突变优选为以下(1)～(4)所示的1个以上的突变：(1)密码子caa的c取代为t、(2)密码子cga的c取代为t、(3)密码子cag的c取代为t、(4)密码子tgg的g(2个g中的任一者或两者)取代为a。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，优选翻译起始因子eif4e2基因中的上述突变包含eif4e2-s基因中的突变。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，优选翻译起始因子eif(iso)4e基因中的上述突变包含eif(iso)4e-t基因中的突变。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，上述病毒可以是马铃薯y病毒(potyvirus)属的病毒。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，上述马铃薯y病毒(potyvirus)属的病毒是马铃薯病毒y(potatovirusy)的一个毒株，可以是打破烟草的virgina突变体的病毒抗性的毒株、及马铃薯病毒y(potatovirusy)中的至少一者。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，可以进一步具有对伞形植物病毒(umbravirus)属病毒的抗性。

另外，在本发明的病毒抗性烟草的一个方式中，上述伞形植物病毒(umbravirus)属病毒可以为烟草丛顶病毒(tobaccobushytopvirus)。

本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式包括通过以下方式制备对病毒具有抗性的烟草：

生产对病毒无功能的翻译起始因子eif(iso)4e蛋白质、或将抑制eif(iso)4e基因的表达的突变导入eif(iso)4e基因，以及

生产对病毒无功能的翻译起始因子eif4e2蛋白质、或将抑制eif4e2基因的表达的突变导入eif4e2基因，其中，

上述翻译起始因子eif(iso)4e是eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t中的至少一者，

上述翻译起始因子eif4e2是eif4e2-s及eif4e2-t中的至少一者。

另外，在本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，上述突变可以是无义突变。

另外，在本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，可以通过甲磺酸乙酯产生上述突变。

另外，在本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，上述翻译起始因子eif(iso)4e基因中的突变可以是eif(iso)4e-s基因中的突变、或者是eif(iso)4e-t基因中的突变、或者是eif(iso)4e-s基因中的上述突变及eif(iso)4e-t基因中的上述突变两者，

所述eif(iso)4e-s基因中的突变是以下(a1)或(a2)的外显子中的无义突变：

(a1)编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif(iso)4e-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-s基因的外显子、或

(a2)编码与序列号8所示的氨基酸序列具有92％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif(iso)4e-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-s基因的外显子，

所述eif(iso)4e-t基因中的突变是以下(b1)或(b2)的外显子中的无义突变：

(b1)编码由序列号11所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif(iso)4e-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-t基因的外显子、或(b2)编码与序列号11所示的氨基酸序列具有92％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif(iso)4e-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif(iso)4e-t基因的外显子。

另外，在本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，上述翻译起始因子eif4e2基因中的突变可以是eif4e2-s基因中的突变、或者是eif4e2-t基因中的突变、或者是eif4e2-s基因中的上述突变及eif4e2-t基因中的上述突变两者，

所述eif4e2-s基因中的突变是以下(c1)或(c2)的外显子中的无义突变：

(c1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif4e2-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-s基因的外显子、或

(c2)编码与序列号2所示的氨基酸序列具有88％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif4e2-s蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-s基因的外显子，

所述eif4e2-t基因中的突变是以下(d1)或(d2)的外显子中的无义突变：

(d1)编码由序列号5所示的氨基酸序列构成的翻译起始因子eif4e2-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-t基因的外显子、或

(d2)编码与序列号5所示的氨基酸序列具有88％以上序列同一性的功能性翻译起始因子eif4e2-t蛋白质的野生型的翻译起始因子eif4e2-t基因的外显子。

另外，在本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，上述无义突变可以是以下(1)～(4)所示的1个以上的突变：(1)密码子caa的c取代为t、(2)密码子cga的c取代为t、(3)密码子cag的c取代为t、(4)密码子tgg的g(2个g中的任一者或两者)取代为a。

本发明的病毒抗性烟草制备方法的另一个方式包括通过以下方式制备对病毒具有抗性的烟草：

导入使翻译起始因子eif(iso)4e基因的表达量少于野生型的因子，以及

导入使翻译起始因子eif4e2基因的表达量少于野生型的因子，其中，

上述翻译起始因子eif(iso)4e是eif(iso)4e-s及eif(iso)4e-t中的至少一者，

上述翻译起始因子eif4e2是eif4e2-s及eif4e2-t中的至少一者。

另外，在本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，上述病毒可以是马铃薯y病毒(potyvirus)属的病毒。

另外，在本发明的病毒抗性烟草制备方法的一个方式中，上述马铃薯y病毒(potyvirus)属的病毒是马铃薯病毒y(potatovirusy)的一个毒株，可以是打破烟草的virgina突变体的病毒抗性的毒株、及马铃薯病毒y(potatovirusy)中的至少一者。

本发明的病毒抗性烟草的育种后代的制备方法的一个方式是使上述的病毒抗性烟草制备方法中制备的病毒抗性烟草或其后代进行自花受粉或异花受粉。

本发明的检测用多核苷酸的组合物的一个方式包含第一检测用多核苷酸和第二检测用多核苷酸，所述第一检测用多核苷酸是用于检测烟草的翻译起始因子eif4e2基因中的突变的多核苷酸，该突变是生产对病毒无功能的eif4e2蛋白质、或抑制eif4e2基因的表达的突变，所述第二检测用多核苷酸是用于检测烟草的翻译起始因子eif(iso)4e基因中的突变的多核苷酸，该突变是生产对病毒无功能的eif(iso)4e蛋白质、或抑制eif(iso)4e基因的表达的突变。

本发明的病毒抗性烟草筛选方法的一个方式包括：检测工序，利用上述的检测用多核苷酸的组合物检测在烟草中有无基因组dna中的上述突变；筛选工序，筛选在上述检测工序中检测到上述突变的烟草作为病毒抗性烟草。

本发明的判定用dna标记物的组合物的一个方式是用于判定烟草对病毒的抗性的dna标记物，其包含第一判定用dna标记物和第二判定用dna标记物，

所述第一判定用dna标记物包含由含有翻译起始因子eif4e2基因中的突变的连续的碱基序列或其互补序列构成的多核苷酸，该突变是生产对病毒无功能的eif4e2蛋白质、或抑制eif4e2基因表达的突变，

所述第二判定用dna标记物包含由含有翻译起始因子eif(iso)4e基因中的突变的连续的碱基序列或其互补序列构成的多核苷酸，该突变是生产对病毒无功能的eif(iso)4e蛋白质、或抑制eif(iso)4e基因表达的突变。

本发明的烟叶的一个方式是上述病毒抗性烟草的烟叶。

本发明的烟草制品的一个方式包含上述烟叶作为原料。

以下示出实施例对本发明的实施方式进行更详细地说明。当然，本发明并不限定于以下实施例，不言而喻，细节部分可以是各种方式。另外，本发明并不限定于上述实施方式，在权利要求所示的范围内可以进行各种变更，将各个公开的技术方法适当组合而得到的实施方式包含于本发明的技术范围内。另外，参考并引用本说明书中记载的文献的全部内容。

实施例

〔实施例1〕

(基因序列的获得)

[eif4e2基因]

使用genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)进行检索，作为烟草(n.tabacum)的翻译起始因子，得到了genbank收录号为eb451717的eif4e的mrna碱基序列、kf155696的eif4e的mrna碱基序列、以及km202068的eif4e的mrna碱基序列。将这些eif4e命名为eif4e2。它们与eif4e1(收录号：ay702653，非专利文献19)的同一性为70％～74％。根据使用了genbank数据库的绒毛状烟草(n.tomentosiformis)及林烟草(n.sylvestris)的wgs(whole-genomeshotguncontigs)的blast分析确认了收录号为eb451717的eif4e2及kf155696的eif4e2来自于林烟草(n.sylvestris)，收录号为km202068的eif4e2来自于绒毛状烟草(n.tomentosiformis)。eb451717(蛋白质编码区域的序列为第87～746号的碱基)与kf155696(蛋白质编码区域的序列为第112～771号的碱基)的蛋白质编码区域中的dna序列的同一性为99.8％(660碱基中的659碱基一致)，编码的蛋白质的氨基酸序列的同一性为100％。dna序列中的一个碱基的不同可以认为是由于来自各dna的品种的不同所引起的。将这些序列分别命名为eif4e2-s(genbank收录号：eb451717、kf155696)及eif4e2-t(genbank收录号：km202068)。破坏eif4e2-s基因的功能的烟草显示出对pvy的抗性(非专利文献22)。

将eif4e2-s(kf155696)的碱基序列示于序列号1，将编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号2，另外，将eif4e2-s基因的基因组序列示于序列号3。基因组序列是来自品种k326的序列，由收录号awoj01222271的第7001号的碱基～第13000号的碱基构成。另外，将eif4e2-t的碱基序列示于序列号4，将编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号5，另外，将eif4e2-t基因的基因组序列示于序列号6。通过以km202068的序列进行查询，对genbank数据库的烟草(n.tabacum)的wgs进行blast分析，从而得到了序列号6。具体而言，是收录号awoj01182781(来自于品种k326的基因组dna序列)的互补序列中第30001～38039号的序列。该基因组序列中的外显子序列与km202068的蛋白质编码区域的dna序列的同一性为99.2％(657碱基中的652碱基一致)。km202068来自于品系t021658，awoj01182781来自于品种k326，因此可以认为该约1％的不同(657碱基中的5碱基不同)是由于烟草品系/品种之间的差异引起的。eif4e2-s基因与eif4e2-t基因的蛋白质编码区域中的dna的序列同一性为93.2％(657碱基中的612碱基一致)。另外，氨基酸序列的同一性为87.7％(219氨基酸中的192氨基酸一致)，相似性为97.3％(219氨基酸中的213氨基酸一致或相似)。序列同一性等的分析中使用了核酸/氨基酸序列分析软件genetyx(注册商标)(ver.12)(genetyx公司)。

[eif(iso)4e基因]

通过genebank数据库进行检索，得到了收录号为ay699609的烟草(n.tabacum)的翻译起始因子eif(iso)4e的mrna碱基序列，将其示于序列号7。另外，将由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号8。根据使用了genbank数据库的wgs的blast分析，弄清楚该eif(iso)4e来自于林烟草(n.sylvestris)，因此将该基因命名为eif(iso)4e-s。以该序列进行查询，检索了genbank数据库的烟草(n.tabacum)的wgs重叠群，结果是得到了在蛋白质编码区域中显示出100％序列同一性的来自于烟草品种k326的基因组序列(收录号为awoj01412288)。将该序列中eif(iso)4e-s基因部分的序列(eif(iso)4e-s基因的基因组序列)示于序列号9。

另外，作为由来自于绒毛状烟草(n.tomentosiformis)的基因组编码的n.tabacum的eif(iso)4e-t，鉴定了genbank收录号为eb683576(示于序列号10)及fn666434这两种。前者是来自于烟草品种k326的eif(iso)4e-t基因的序列，后者是来自于烟草品种samsunnn的eif(iso)4e-t基因的序列，两者的序列同一性为97％。这2种基因编码的蛋白质的氨基酸序列同一性为97％，相似性为99％。可以认为该序列的不同是由于来源品种之间的差异所引起的。另外，eif(iso)4e-s(ay699609)与eif(iso)4e-t(eb683576)的dna的序列同一性为91％。另外，eif(iso)4e-s的氨基酸序列(序列号8)与eif(iso)4e-t的氨基酸序列(序列号11)的同一性为91％，相似性为96％。使用eif(iso)4e-t(eb683576)的mrna序列检索了genbank数据库的烟草(n.tabacum)的wgs重叠群，结果是得到了在蛋白质编码区域中显示出100％序列同一性的来自于烟草品种k326的基因组序列(收录号为awoj01054542)。将该序列中eif(iso)4e-t基因部分的序列(eif(iso)4e-t基因的基因组序列)示于序列号12。

(rnai构建物的构建)

为了制备eif4e2及eif(iso)4e表达抑制烟草，构建了以这些基因的内部序列作为触发器的rnai构建物。

制备了对eif4e2的触发器序列(来自于eb451717的339碱基、序列号13)及eif(iso)4e的触发器序列(来自于ay699609的313碱基、序列号14)进行特异性扩增的引物(表1)。在各基因的fw引物的5’末端添加用于在后述的克隆中使用的cacc序列。需要说明的是，虽然eif4e2用的触发器及eif(iso)4e用的触发器均是基于s型基因的序列设计的，但这些触发器序列相对于各基因的t型具有90％以上序列同一性，因此可以认为具有使s型基因及t型基因这两种基因的转录物的量减少的效果。

[表1]

表1:翻译起始因子的rnai触发器序列克隆用引物

使用magdea(注册商标)rna100(gc)(precisionsystemscience公司)，从烟草幼苗提取rna并纯化。接着。使用primescript^tmrt试剂试剂盒(takarabio公司)由纯化后的rna合成了cdna。以该cdna为模板，使用表1所示的基因特异性引物，对eif4e2和eif(iso)4e的基因片段进行了扩增。具体而言，20μl反应液中含有模板dna10ng、引物各5pmoles，酶使用primestarmaxdna聚合酶(takarabio公司)，进行了35次1循环：98℃10秒钟、55℃15秒钟、72℃15秒钟的反应。使用minielutepcr纯化试剂盒(qiagen公司)对pcr产物(eif4e2约320bp、eif(iso)4e约310bp)进行纯化，然后克隆至载体pentr^tm/d-topo(注册商标)(lifetechnologies公司)。确认了插入序列的碱基序列之后，使用gateway(注册商标)lrclonase(注册商标)ii酶混合物(lifetechnologies公司)，将插入序列克隆至rnai载体psp231(文献：参考国际公开第2011/102394号公报)。psp231是在phellsgate12(文献：wesleyetal.,2001,plantj.,27,581-590参照)的saci部位插入了gfp(绿色荧光蛋白基因)表达盒的载体，是用花椰菜花叶病毒35srna基因启动子驱动触发器序列的反向重复序列包夹pdk/cat内含子的类型的rnai序列的形式的双元载体。在克隆于psp231之后，确认rnai触发器序列及其朝向，制成最终的rnai构建物。

通过电穿孔法将制备的rnai构建物导入土壤杆菌lba4404株。

(烟草转化)

烟草的转化用通常方法(叶盘法)进行。作为烟草品种，使用了petithavanasr1及tn90。sr1为pvy及pvy-b敏感性的品种，tn90为eif4e2-s基因缺失的pvy抗性(pvy-b敏感性)的品种。

剪切烟草子叶的四角，使切下的叶在土壤杆菌溶液中浸渍10分钟。擦拭多余的液体，然后将叶置于ls固体培养基(含有3％蔗糖、0.8％琼脂)上。在25℃、3天、黑暗下进行培养，由此使重组土壤杆菌感染烟草，将各翻译起始因子的rnai构建物导入sr1。另外，将翻译起始因子eif(iso)4e的rnai构建物导入了tn90。在含有250mg/l的头孢噻肟(cefotaxime)和作为植物激素的2-异戊烯腺嘌呤(2ip)(10mg/l)及iaa(0.3mg/l)的ls固体培养基上将叶切片放置4天，对土壤杆菌进行除菌。重组体的筛选在以上述浓度含有头孢噻肟和植物激素的ls培养基中进一步含有50mg/l卡那霉素而得到的培养基上进行。将从筛选的重组体再分化而得到苗置于生根培养基(含有1.5％蔗糖、0.3％结冷胶、以及上述浓度的头孢噻肟和卡那霉素的ls固体培养基)中使其生根。在温室培育得到的重组烟草。

(转化初代重组烟草中的翻译起始因子的转录分析)

对于重组烟草，为了研究eif4e2或eif(iso)4e基因的表达，基于各基因的碱基序列设计了实时pcr用的引物组/探针(表2)。另外，使用rneasyplantminikit(qiagen公司)从各重组烟草的叶提取了总rna。使用primescriptreagentkit(takarabio公司)从得到的rna合成cdna，作为实时pcr的模板。在实时pcr中，使用taqmanfastadvancedmastermix(lifetechnologies公司)进行扩增反应。反应条件为在50℃2分钟、95℃20秒钟之后进行40次95℃1秒钟、60℃20秒钟的循环。表达分析使用steponesoftwarev2.2(lifetechnologies公司)。使用延长因子1-α(ef1-α)基因作为pcr的内标物，通过与该基因的表达量相比计算出靶基因的相对基因表达量。使用了非重组烟草(sr1及tn90)作为对照。

[表2]

表2:定量pcr用引物/探针

测定了在烟草品种sr1中导入了eif4e2的rnai构建物而得到的重组烟草的eif4e2基因的转录物的量、以及导入了eif(iso)4e的rnai构建物而得到的重组烟草的eif(iso)4e基因的转录物的量。对于eif4e2而言，得到了显示出对照品种sr1的10％以下的表达量的3个品系：4e2#3、4e2#4及4e2#5。另外，对于eif(iso)4e而言，得到了显示出对照品种sr1的5％左右的表达量的3个品系：iso4e#1、iso4e#7及iso4e#15。另外，将对导入了eif(iso)4e的rnai构建物的tn90的eif(iso)4e基因的转录物的量进行测定得到的结果示于图1。作为转化初代中转录抑制程度高的品系，选择了#8(对照品种tn90的6％的表达量)，作为没有转录抑制的对照品系，选择了#27(与tn90同等的表达量)。

(转化次代的重组烟草的分离)

将转化初代中转录抑制程度高的转化sr1烟草、即eif4e2表达抑制的3个品系及eif(iso)4e表达抑制的3个品系的自身繁殖种子、以及转化初代中eif(iso)4e的转录抑制程度高的转化tn90的#8及没有转录抑制的#27的自身繁殖种子无菌地播种于ls固体培养基(含有3％蔗糖、0.8％琼脂)上。使用fluorimager595(moleculardynamics公司)测定了发芽、生长的幼植物体的gfp荧光。如上所述，在用于构建物导入的psp231中，在t-dna区域上的rnai表达盒相邻处设置有35s启动子-gfp表达盒。在幼植物体中，将发强gfp荧光的植物判断为对rnai构建物的纯合品系、将完全不发出荧光的植物判断为对rnai构建物的无效分离(nullsegregant)品系(不存在rnai构建物)、将发弱荧光的植物判断为对rnai构建物的半合子品系。由此，得到了eif(iso)4e表达抑制品系tn90#8的纯合品系。需要说明的是，可判断tn90#27是未检测到荧光的无效分离品系。将播种后3周的植物转移至温室，移植至培养土壤中进行培育。

(转化次代的重组烟草中的翻译起始因子的转录分析)

为了研究各重组烟草品系的次代中的eif4e2及eif(iso)4e基因的表达，如上所述从重组烟草的叶提取rna，合成cdna，作为实时pcr的模板。如上所述实施实时pcr，使用ef1-α基因作为内标物，使用非重组烟草作为对照植物。需要说明的是，对于引物及探针而言，eif4e2、eif(iso)4e均使用了s型基因用的引物及探针。

将利用实时pcr进行的eif4e2及eif(iso)4e的基因表达分析的结果示于图2。可以确认，在sr1的情况下，eif4e2表达抑制品系#3、#4及#5的表达分别被抑制为非重组品系(sr1)的15％、5％、7％左右。另一方面可以确认，eif(iso)4e表达抑制品系#1、#7及#15的表达分别被抑制为非重组品系(sr1)的9％、5％、6％左右。

使eif4e2基因被判断为纯合体的rnai重组烟草(sr1)与eif(iso)4e基因被判断纯合体的rnai重组烟草(sr1)交配，制备了具有eif4e2基因的rnai构建物及eif(iso)4e基因的rnai构建物两者的重组烟草(sr1)。

(多个翻译起始因子的转录受到抑制的重组烟草植物的病毒接种试验)

在病毒接种试验中使用了具有eif(iso)4e基因的rnai构建物的烟草tn90#8纯合品系。需要说明的是，如上所述，tn90是eif4e2-s基因原本缺失的品种。另外，作为对照，使用了栽培品种tn90、tsukuba(つくば)1号、以及eif(iso)4e的s型及t型基因两者的功能被破坏的突变体(以下称为“eif(iso)4e突变体”)。eif(iso)4e突变体是通过对烟草种子进行ems处理而得到的突变体，序列号9所示的eif(iso)4e-s基因的第330号的c突变为t，另外，序列号12所示的eif(iso)4e-t基因的第299号的g突变为a。这些突变均为无义突变(该突变体的详细情况记载于专利文献5)。

将pvy(pvy-n)、pvy-b或tbtv接种于移植于培养土壤后10天的个体。pvy-b是用在日本烟草产业株式会社烟叶研究所分离的病毒毒株，使pvy抗性的烟草现有品种virgina突变体(vam)发生坏疽症状的vambreaking毒株。tbtv是伞形植物病毒(umbravirus)属病毒，对烟草的叶引起斑纹症状。接种源使用了感染各病毒而发病的黄色种品种tsukuba(つくば)1号(pvy及tbtv的情况)或vam(pvy-b的情况)的患病叶。tsukuba1号是对pvy、pvy-b及tbtv易感性的品种，通过接种显示出明确的病状。将采集的患病叶在乳钵中与0.01n磷酸盐缓冲液一起磨碎。使用碳化硅将该磨碎液涂抹接种于移植1周后的烟草苗的最大叶(从下起第4或5片)的半个叶片。然后，在温室内进行栽培，观察病状。

将pvy的接种结果、pvy-b的接种结果及tbtv的接种结果分别示于表3、4及5。需要说明的是，对于各表中表示基因的s型及t型的“s”及“t”而言，大写字母表示没有突变，小写字母表示有突变(或表达抑制)。

如表3所示，在pvy的接种试验中，对于对照的tsukuba1号、eif(iso)4e突变体而言，分别在接种8天后、15天后在全部个体中观察到发病。另外，对于现有的pvy抗性品种tn90而言，在接种15天后在1/4以上的个体中观察到病状，在接种30天后在半数以上的个体中观察到病状。另一方面，对于eif4e2-s及eif(iso)4e的功能受到抑制的烟草tn90#8而言，在接种15天后完全未观察到病状，在接种30天后也仅在15个个体中的1个个体观察到病状。由此可知，eif4e2-s及eif(iso)4e的功能受到抑制的烟草tn90#8比现有的pvy抗性品种表现出更强的抗性。

另外，如表4所示，在pvy-b的接种试验中，对于对照的tn90及tsukuba1号而言，分别在接种8天后、15天后在基本全部个体中观察到发病。另外，对于作为现有的pvy-b抗性烟草的eif(iso)4e突变体而言，在接种15天后在14个个体中的2个个体中观察到病状，在接种30天后，在接近8成的个体中观察到病状。另一方面，对于eif4e2-s及eif(iso)4e的功能受到抑制的烟草tn90#8而言，在15个个体中，接种8天后在1个个体中观察到病状，接种15天后在2个个体中观察到病状，但在接种30天后病状仍是2个个体(13.3％)。由此可知，eif4e2-s及eif(iso)4e的功能受到抑制的烟草tn90#8比现有的pvy-b抗性品系表现出更强的抗性。

另外，如表5所示，在tbtv的接种试验中，eif4e2-s及eif(iso)4e的功能受到抑制的烟草tn90#8比对照的tn90及tsukuba1号的发病程度显著降低。

[表3]

pvy接种试验结果

[表4]

pvy-b接种试验结果

[表5]

tbtv接种试验结果

由以上可知，通过不仅抑制eif4e2-s基因，还抑制eif(iso)4e-s基因及eif(iso)4e-t基因两者的转录，对pvy、pvy-b及tbtv这全部3种病毒具有抗性。另外，令人惊讶的是弄清楚了对于pvy及pvy-b而言，与现有的抗性品系相比，抗性得到增强。

〔实施例2〕

(eif4e2-s基因、eif(iso)4e-s基因及eif(iso)4e-t基因中具有突变的烟草突变体的筛选)

作为eif4e2-s基因的功能受到抑制的烟草，使用了品种tn90。另外，作为eif(iso)4e-s基因及eif(iso)4e-t基因两者的功能受到抑制的烟草，使用了实施例1中的eif(iso)4e突变体。本突变体对于eif(iso)4e-s基因及eif(iso)4e-t基因这两种基因以纯合的方式导入了突变(无义突变)，eif(iso)4e-s基因及eif(iso)4e-t基因这两种基因的转录受到抑制(专利文献5)。需要说明的是，对于各个体中的eif4e2基因及eif(iso)4e基因的基因型，以eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt的方式进行表示。例如，tn90的基因型为eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt，上述的eif(iso)4e突变体为eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt。

eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt及作为对照的eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt品系如下所述进行培育。首先，使tn90与eif(iso)4e突变体交配得到f1后，使tn90再次与f1交配得到了bc1f1。在bc1f1播种后，从各个体提取dna，使用判断有无eif4e2-s基因缺失的显性scar标记物(表6)及判断eif(iso)4e-s基因和eif(iso)4e-t基因的多态性的dcaps标记物(详细情况记载于专利文献5，序列记载于下述表7)，筛选了基因型为eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt的个体。接着，播种筛选个体的自身繁殖种子(bc1f2)，通过与bc1f1相同的dcaps标记物分析筛选了基因型为eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt的个体及eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt的个体。使筛选个体自身繁殖，对显示该基因型的品系的种子进行了增殖。

[表6]

[表7]

*将为了制备野生型的限制酶部位而插入的靶摸板dna和发生错配的碱基以小写字母表示。

进行个体筛选时的dna提取如下所述进行。将烟草叶样品(1cm×1cm)加入2ml的管中，添加400μl的提取液(组成为200mmtris-hcl(ph7.5)、250mmnacl、25mmedta、0.5％sds)及200μl是蛋白质沉淀溶液(proteinprecipitationsolution)(qiagen公司制造)，然后加入金属锥进行破碎，以13000rpm离心分离10分钟。将上清300μl转移至新的1.5ml管，加入800μl的100％乙醇，翻转混和。以15000rpm离心分离10分钟，然后完全除去上清。确认了颗粒干燥后，加入te(10mmtris-hcl(ph7.5),1mmedta)50μl。

eif4e2-s基因的多态性可以通过使用设计于该基因内的引物(表6)进行pcr、并利用电泳确认有无扩增来判断。使用烟草基因组dna5ng在10μl的反应体系中进行了pcr。pcr反应所需要的酶及试剂类使用了qiagenmultiplexpcrkit(qiagen公司)。在反应中，在95℃下15分钟后进行38次94℃下30秒钟、58℃下30秒钟及72℃下45秒钟的循环，最后在72℃下延伸90秒钟。电泳的结果是确认了，对于具有正常的eif4e2-s基因的样品而言，确认到与475bp片段相当的条带，另一方面，对于如tn90那样缺失了eif4e2-s基因的样品而言，未确认到条带，因此可以根据有无条带来判断eif4e2-s基因的缺失。

为了判断eif(iso)4e-s基因及eif(iso)4e-t基因的多态性，使用了dcaps标记物。使用tksgflex^tmdna聚合酶进行了1^stpcr。以约5ng基因组dna作为模板，制备为引物浓度1μm，使用添加了酶的缓冲液。pcr进行1次94℃1分钟，30次98℃10秒钟、60℃15秒钟及68℃30秒钟的循环，1次68℃90秒钟。然后，将1^stpcr产物稀释至100倍，以1μl作为模板，用takarataq^tm进行了2^ndpcr。与1^stpcr一样地制备为引物浓度1μm，使用添加了酶的缓冲液。pcr进行1次94℃2分钟，40次94℃30秒钟、52℃30秒钟及72℃30秒钟的循环，1次72℃90秒钟。用nlaiii(newenglandbiolabs公司)对eif(iso)4e-s基因的2^ndpcr产物进行了处理。用mboi(takarabio公司)对eif(iso)4e-t基因的2^ndpcr产物进行了处理。在对用eif(iso)4e＿s引物扩增后的产物进行了限制酶处理的情况下，可以将未观察到切断的样品的基因型判断为ss，在对用eif(iso)4e＿t引物扩增后的产物进行了限制酶处理的情况下，可以将未观察到切断的样品的基因型判断为tt。可以容易地进行如下判断：例如，用eif(iso)4e＿s引物扩增的产物未发生切断且用eif(iso)4e＿t引物扩增的产物发生了切断的样品的基因型为sstt，用eif(iso)4e＿s引物扩增的产物发生切断且用eif(iso)4e＿t引物扩增的产物未发生切断的样品的基因型为sstt，用两种引物扩增的产物均发生了切断的样品的基因型为sstt，用两种引物扩增的产物均未发生切断的样品的基因型为sstt，出现用两种引物扩增的产物均发生了切断的情况和未发生切断的情况的样品的基因型为sstt。

接着，将eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt及eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt的培育及筛选方法示于以下。使上述的bc1f1代中筛选得到的eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt与tn90交配，得到了bc2f1。播种bc2f1代，通过与bc1f1相同的dcaps标记物分析筛选了基因型为eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt的个体。使筛选得到的bc2f1个体进行自身繁殖，得到了bc2f2。在该bc2f2品系中，筛选了基因型显示为eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt及eif4e2-sstt/eif(iso)4e-sstt的个体。

(对eif4e2/eif(iso)4e烟草双重突变体的病毒接种试验)

向移植于培养土壤后2周的个体接种了pvy或pvy-b。病毒接种源的制备及对烟草的接种方法用与上述的实施例1相同的方法实施。接种后，在温室内进行栽培，在合适的时间时观察适当病状。将eif4e2和eif(iso)4e双重功能缺失突变体烟草的病毒接种试验结果示于表8和表9。

如表8所示，在pvy的接种试验中，对于对照的tsukuba1号、在eif(iso)4e的s和t两者中具有突变的突变体(eif(iso)4e-s&t突变体)、以及在eif(iso)4e的t中具有突变的突变体(eif(iso)4e-t突变体)而言，在接种10天后，在全部个体中观察到了坏疽症状。另外，对于现有的pvy抗性品种tn90而言，在接种19天后，在半数以上的个体中观察到病状，对于eif4e2-s突变体(双重突变体的对照)而言，在接种28天后，在40％的个体中观察到病状。另一方面，对于eif4e2-s及至少eif(iso)4e-t这两者的功能受到抑制的双重突变体(eif4e2-s/eif(iso)4e-s&t双重突变体及eif4e2-s/eif(iso)4e-t双重突变体)而言，在接种28天后，完全未观察到病状。由此可知，eif4e2-s及至少eif(iso)4e-t的双重突变体显示出比现有的pvy抗性品种更强的抗性。

另外，如表9所示，在pvy-b的接种试验中，对于对照的tn90、tsukuba1号及在eif4e2的s中具有突变的突变体(eif4e2-s突变体：双重突变体的对照)而言，分别在接种7天后，在全部个体中观察到发病。另外，对于作为pvy-b抗性烟草的在eif(iso)4e的s及t两者中具有突变的突变体(eif(iso)4e-s&t突变体)而言，在接种19天后，在15个个体中的3个个体中观察到病状，在接种28天后，在15个个体中的5个个体中观察到病状。对于在eif(iso)4e的t中具有突变的突变体(eif(iso)4e-t突变体)而言，虽然在接种7天后，仅在10个个体中的2个个体中观察到病状，但在接种10天后，在10个个体中的5个个体中观察到病状，在接种19天，在全部个体中观察到病状。另一方面，对于eif4e2-s及至少eif(iso)4e-t的两者的功能受到抑制的双重突变体(eif4e2-s/eif(iso)4e-s&t双重突变体及eif4e2-s/eif(iso)4e-t双重突变体)而言，在接种28天后也完全未观察到病状。另外，对于eif4e2和eif(iso)4e基因的转录均被rnai抑制的重组体而言，在接种28天后也完全未观察到病状。由此可知，通过抑制eif4e2及eif(iso)4e不同的2种基因的功能，显示出比现有的pvy-b抗性品种更强的抗性。

[表8]

pvy接种试验结果

[表9]

pvy-b接种试验结果

由以上可知，通过抑制eif4e2-s基因、并抑制eif(iso)4e-t基因的转录，而且通过抑制eif4e2-s基因、并抑制eif(iso)4e-s基因及eif(iso)4e-t基因两者的转录，对pvy及pvy-b的抗性程度比现有的抗性品系更加增强。

工业实用性

本发明可以用于烟草的育种。

序列表

<110>日本烟草产业株式会社(japantobaccoinc.)

<120>病毒抗性烟草及其制备方法

<130>jt17169

<150>jp2016-166176

<151>2016-08-26

<160>40

<170>patentinversion3.5

<210>1

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ttcaatttaaattcgattacatttctccactaggttcccttttttgtttattgttgtctg3060

actgcgtatatttcctgcttttgaccatgtaacctgtctggatatcaacaatcttcactc3120

ttaacttttgttttctggcatgttgctacacttgatgctccatggttttgcaatgatata3180

tgactggttggttttatgctgcagatgagcattggtaggaagtggaaggagatcatcgat3240

gctgaaaaaatatcctatagtttccatgtaacttctgttgccccttaccattattgcaaa3300

atcaagtgtcttttatctttcctcctgttaatttttttctttcttaatcaacctttcttt3360

tggttgttgcaggatgactctaaaaaggaaaggtcagttaagagtcgatatactgtgtga3420

attcccttattgtgtgggattgacaccggtccctaagtttactgaaaattgtacgattag3480

cattagtttgcgcttgtctgctgcaaattttgattttcttgaaatttattcgtacttgat3540

atgtatctttggatgtattgtgttaaagattttgtttgcttctttgttacttgtctaaag3600

tgtgcctcatgtcttaattt3620

<210>13

<211>339

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacum)

<400>13

gcgggtagatgaagtagaagtagtcgacgatggacctgaagaaggagaaattgtggatga60

atctgatgatacggcgtcgtatttgggcaaagaaatcaaacctaagcatccattagagaa120

ttcttggactttttggtttgataatcctatggctaaatctagacaagctgcttggggcag180

ttcccttcgcgaactttacactttttccactgtcgaagatttttggggtgtttacaataa240

tatcaaccacccaagcaagttagttgtgggagcagactttcattgttttaagcataaaat300

tgagccaaagtgggaagatcctgtatgtgcgaatggagg339

<210>14

<211>313

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacum)

<400>14

agaggcgacggaggttccgccggcgtcagcgacggagacggtggcgaagcagccacataa60

gctagagaggagatggacattctggttcgataatcaatctaagccgaaacaaggagccgc120

ttggggaagttctcttcgaaaagcttatactttcgaaactgttgaggaattctggagttt180

atatgatcagatattcaagcccagcaagttgactgctaatgcggactttcatttgttcaa240

agctgggattgagcccaaatgggaagatcctgagtgtgctagtggtggcaagtggactgt300

tacgagcagcaga313

<210>15

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

caccgcgggtagatgaagtagaag24

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

cctccattcgcacatacagg20

<210>17

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

caccagaggcgacggaggttcc22

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

tctgctgctcgtaacagtcc20

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

gccactgaagcaccgatagag21

<210>20

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

ttatcgaaccagaatgtccatctc24

<210>21

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>21

tttctggattacagcaactcgattggcttc30

<210>22

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

gccactgaagcaccgatagag21

<210>23

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

ttatcgaaccagaatgtccatctc24

<210>24

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>24

tccgccggcgtcagcgac18

<210>25

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

gccggatacggtggagaag19

<210>26

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

ccaaacagcgccttgctt18

<210>27

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>27

atggacattctggttcgat19

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

ctaagggtgctgccagcttt20

<210>29

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

gtcaagcactggagcatatcca22

<210>30

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>30

atcatgaaccatccaggacagattgg26

<210>31

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

gaattggacaatgagctttagt22

<210>32

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

tagatgtgtggctgtaaattg21

<210>33

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

ggcctaaacgttgtaagacaa21

<210>34

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

tgcttagttaaatgctacaggg22

<210>35

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

aaatcgacacaaagggaggag21

<210>36

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

aacttccccaagcggctccat21

<210>37

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

gacctgaacattgcaagatga21

<210>38

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

ggcttacttgaatgctacaagg22

<210>39

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

gcctcaatcgacacaaaagggagag25

<210>40

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

agcgccttgcttcggcttatcgat24