一种利用chr.7单QTL片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法与流程

本发明属于棉花分子育种
技术领域：
，具体涉及一种利用chr.7单qtl片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法。
背景技术：
：棉花是重要的经济作物，是纺织工业的主要原材料。长期以来，纤维产量和品质一直是棉花育种改良的两个重要目标。陆地棉(gossypium.hirsutuml.)因产量高、适应性广而占据当前世界棉花生产总量的90％(zhangetal.2015：sequencingofallotetraploidcotton(gossypiumhirsutuml.acc.tm-1)providesaresourceforfiberimprovement.natbiotechnol33:531-537)。但由于其纤维品质还不够理想，尚不能满足现代纺织技术飞速发展的需求，而海岛棉(g.barbadensel)基因组中蕴含着优异纤维基因(liuetal.2015：gossypiumbarbadensegenomesequenceprovidesinsightintotheevolutionofextra-longstaplefiberandspecializedmetabolites.scirep5:14139；wangetal.2013：geneticdissectionoftheintrogressivegenomiccomponentsfromgossypiumbarbadensel.thatcontributetoimprovedfiberqualityingossypiumhirsutuml.molecularbreeding32:547-562；yuanetal.2015：thegenomesequenceofsea-islandcotton(gossypiumbarbadense)providesinsightsintotheallopolyploidizationanddevelopmentofsuperiorspinnablefibres.scirep5:17662)，如何把这些优异基因引入产量高、适应性广的陆地棉，改良陆地棉的纤维品质，一直是育种工作者努力追求的目标。但是，由于种间杂交存在生殖隔离或杂交后代严重偏分离，直接利用这些优异基因资源进行育种有很大困难，这也是造成棉花纤维品质改良一直徘徊不前的重要原因。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速、高效的利用chr.7单qtl片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种利用chr.7单qtl片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法，包括以下步骤：1)以鲁棉研22号为母本和鲁原343为父本，构建重组自交系f8，重组自交系f8的单株与鲁棉研22号连续回交3～5次，用ssr分子标记从回交后代中筛选获得高纤维强力的chr.7单qtl片段置换系；2)以步骤1)中获得的chr.7单qtl片段置换系为非轮回亲本与轮回亲本杂交，获得f1代，所述的轮回亲本为待进行纤维品质改良的亲本；3)将步骤2)获得的f1代与轮回亲本回交，获得bc1f1代；4)用ssr分子标记从所述bc1f1代植株中筛选带有chr.7单qtl片段植株与轮回亲本进行2～4次回交，获得bcnf1代；5)用ssr分子标记从所述bcnf1代植株中筛选带有chr.7单qtl片段植株进行1～3次自交，获得棉花高纤维强力的育成品系bcnfm；所述ssr分子标记筛选用引物对包括dpl0852、dpl0757和dc40182；序列分别为seqidno.1～6。优选的，所述chr.7单qtl片段置换系的纤维长度为30～31.1mm，纤维强度为31～33.3cn/tex。优选的，步骤5)中所述2～4次自交每一次自交后用所述用ssr分子标记筛选带有chr.7单qtl片段植株进行下一次自交。优选的，步骤2)中所述的轮回亲本为鲁棉研29号、鲁7619、鲁6269、冀958、鲁棉研36号、鲁棉研37号、鲁s3586，鲁棉301或鲁棉319。优选的，步骤4)中所述回交次数为3次。优选的，步骤5)中所述自交次数为2次。本发明的有益效果：本发明提供的利用chr.7单qtl片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法，利用棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系通过与轮回亲本杂交、回交和自交，采用了所述的棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系，能够将所述的高纤维强力chr.7单qtl片段稳定的置换到轮回亲本中，而不会将除棉花高纤维强力chr.7单qtl片段以外的基因置换到轮回亲本中，使得轮回亲本具有优良的纤维强力性状。同时，在育种过程中利用ssr分子标记辅助筛选目标性状植株，所述方法可在2～3年内快速、高效培育出纤维品质优良的棉花新品系。附图说明图1为实施例1中f1代不同遗传背景下纤维强力的效应评价；图2为实施例1中bc3f3代不同遗传背景下纤维强力的效应评价。具体实施方式本发明提供了一种利用chr.7单qtl片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法，包括以下步骤：：1)以鲁棉研22号为母本和鲁原343为父本，构建重组自交系f8，重组自交系f8的单株与鲁棉研22号连续回交3～5次，用ssr分子标记从回交后代中筛选获得高纤维强力的chr.7单qtl片段置换系；2)以步骤1)中获得的chr.7单qtl片段置换系为非轮回亲本与轮回亲本杂交，获得f1代，所述的轮回亲本为待进行纤维品质改良的亲本；3)将步骤2)获得的f1代与轮回亲本回交，获得bc1f1代；4)用ssr分子标记从所述bc1f1代植株中筛选带有chr.7单qtl片段植株与轮回亲本进行2～4次回交，获得bcnf1代；5)用ssr分子标记从所述bcnf1代植株中筛选带有chr.7单qtl片段植株进行1～3次自交，获得棉花高纤维强力的育成品系bcnfm；所述ssr分子标记筛选用引物对包括dpl0852、dpl0757和dc40182；序列分别为seqidno.1～6。在本发明中，所述的棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系作为非轮回亲本，为轮回亲本提供优质的纤维品质的基因资源。在本发明中所述棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系以鲁棉研22号(♀)和鲁原343(♂)为亲本，构建重组自交系f8，重组自交系f8的单株与鲁棉研22号连续回交4～6次获得的。在本发明中所述的鲁棉研22是山东棉花研究中心培育的综合性状优良、适应性广的转基因抗虫棉品种，衣分高；鲁原343是渐渗海岛棉优异纤维种质的陆地型长绒棉新品系，纤维品质好。本发明以高衣分的鲁棉研22号(♀)和优异纤维种质鲁原343(♂)为亲本，构建重组自交系f8，所述重组自交系f8中共有358个家系，本发明优选的从358个家系中选择一个性状优良的单株，所述性状优良的单株的fl为35.47mm，fs为39.3cn/tex-1，fm为4.01。本发明将所述性状优良的单株与轮回亲本鲁棉研22号连续回交3～5次，优选的为4次，本发明在回交过程中优选的每一世代借助分子标记进行辅助选择，获得棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系(sl7)。所述分子标记优选的为ssr分子标记，所述ssr分子标记的引物对包括dpl0852、dpl0757和dc40182；序列为seqidno.1～6。在本发明中利用所述ssr分子标记引物扩增每一世代植株全基因组dna，在本发明中，所述的pcr扩增优选的体系为10μl，具体的包括：超纯水(ddh2o)4.7μl，模板dna1.0μl，10×buffer1.0μl，2.5mmmgcl21.0μl，10mmdntps0.2μl，浓度为10μm的每一分子标记的正向引物(forwardprimer)1.0μl，反向引物(reverseprimer)1.0μl，taqdna聚合酶0.1μl。本发明中所述ssr分子标记pcr扩增反应程序优选的为：预热95℃5min，变性94℃45s，退火52～57℃45s，延伸72℃1min；循环30次，延伸72℃10min。本发明在pcr扩增反应结束后，优选的将所述扩增产物保存4℃。然后利用8％非变性聚丙烯酰胺(page)凝胶电泳检测产物条带，银染显色，观察结果。若扩增结果有且只有相应的dpl0852、dpl0757和dc40182引物对扩增的3个分子标记条带，即为带有chr.7单qtl片段的植株，可进行后续实验。在本发明中所述棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系的纤维长度为30～31.1mm，纤维强度为31～33.3cn/tex；所述棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系(sl7)的纤维长度和纤维强度与亲本鲁棉研22号存在显著性差异。本发明在获得棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系后，以所述的棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系为非轮回亲本与轮回亲本(♀)杂交获得f1代。在本发明中所述的非轮回亲本为待进行纤维品质改良的亲本；优选的为产量高，衣分高(大于43％)，纤维强力一般的品种；在本发明具体实施过程中所述的轮回亲本可以为鲁棉研29号，鲁7619，鲁6269，冀958，鲁棉研36号，鲁棉研37号，鲁s3586，鲁棉301，鲁棉319或者其他符合要求的常规陆地棉品种。在本发明中所述的杂交采用本领域常规的杂交方法即可，无其他特殊要求。本发明优选的在获得f1代后对所述f1代的植株进行ssr分子标记筛选，即在f1世代，应用ctab法提取植株dna，采用棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系sl7上的分子标记引物对dpl0852、dpl0757、dc40182进行pcr扩增，具体的pcr体系和程序采用上述技术方案所述的体系和程序，在此不再赘述；若扩增结果有且只有相应的3个分子标记条带，即为带有chr.7单qtl片段的植株，可进行后续实验。在本发明中，f1世代所有的单株均含有供体片段。本发明在获得f1代后，将获得的f1代与轮回亲本回交获得bc1f1代。在本发明中所述的回交采用本领域常规的回交方法即可，无其他特殊要求。本发明在获得bc1f1代后，优选的种植bc1f1代，采用ssr分子标记筛选携带有chr.7单qtl片段的植株，所述ssr分子标记筛选方法与上述一致，在此不再赘述。本发明在获得携带有chr.7单qtl片段的bc1f1代植株后，将所述的携带有chr.7单qtl片段的bc1f1代植株与轮回亲本进行2～4次回交获得bcnf1代。在本发明中所述回交次数优选的为3次；所述3次回交后获得bc3f1代；在本发明中每一回交世代优选的借助ssr分子标记进行筛选获得携带有chr.7单qtl片段的植株。本发明在获得bcnf1代后，从bcnf1代植株中筛选带有chr.7单qtl片段植株进行1～3次自交获得棉花高纤维强力的育成品系bcnfm。在本发明中所述筛选带有chr.7单qtl片段植株的方法即为ssr分子标记，在此不再赘述。本发明在获得携带chr.7单qtl片段的bcnf1代植株后，将所述获得的携带chr.7单qtl片段的bcnf1代植株进行1～3次自交；优选的进行两次自交。在本发明中优选的采用bc3f1进行两次自交获得棉花高纤维强力的育成品系bc3f3，所述自交过程中优选的采用ssr分子标记筛选携带有chr.7单qtl片段的植株进行下一次自交；所述自交结束后获得棉花高纤维强力的育成品系。本发明中获得的棉花高纤维强力的育成品系可以在不同地域环境中种植，所述棉花高纤维强力的育成品系优良纤维品质能够稳定遗传。下面结合实施例对本发明提供的一种利用chr.7单qtl片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1chr.7单qtl片段置换系的构建：鲁棉研22是山东棉花研究中心培育的综合性状优良、适应性广的转基因抗虫棉品种，衣分高；鲁原343是渐渗海岛棉优异纤维种质的陆地型长绒棉新品种，纤维品质好。以高衣分的鲁棉研22号(♀)和优异纤维种质鲁原343(♂)为亲本，构建358个家系的重组自交系f8，选择一个性状优良的单株(fl为35.47mm，fs为39.3cn/tex-1，fm为4.01)与轮回亲本(鲁棉研22号)连续回交，并借助分子标记辅助选择，获得一个高纤维强力的单片段置换系(sl7)。纤维长度30-31.1mm，纤维强度31-33.3cn/tex与轮回亲本存在显著性差异。不同遗传背景轮回亲本的选择：不同遗传背景亲本选择的原则是产量高(比对照增产10％以上)且衣分高(43％以上)，纤维品质一般。我们选择国家黄河流域审定品种4个，如：鲁棉研29号，鲁7619，鲁6269，冀958；山东省审定品种2个，如：鲁棉研36号，鲁棉研37号和3个本课题组创制的高产新品系，如鲁s3586，鲁棉301，鲁棉319。以chr.7单qtl片段置换系为非轮回亲本(♂)与轮回亲本(♀)杂交获得f1代；在f1代进行纤维强力的评价，结果如附图1：f1代，不同遗传背景下，纤维强力均有提高，p2和p9在5％水平存在差异，p1、p3、p4、p5、p6、p7和p8在1％水平存在显著性提高。分子标记辅助选择：2015年夏天在山东棉花研究中心临清试验站和中国农科院棉花研究所白壁试验站种植f1和各个亲本，每个组合种植3个重复，每行15-20株。在现蕾期整行按照单株全部取样，放入2.0ml的离心管中，并加入新鲜配置的提取液600μl，放入组织研磨仪进行磨样，应用ctab法提取dna，采用单片段置换系(sl7)上的分子标记(表1)进行pcr扩增，pcr反应体系为10μl，其中超纯水(ddh2o)4.7μl，模板dna1.0μl，10×buffer1.0μl，2.5mmmgcl21.0μl，10mmdntps0.2μl，浓度为10μm的正向引物(forwardprimer)1.0μl，反向引物(reverseprimer)1.0μl，taqdna聚合酶0.1μl。ssr扩增反应程序：预热95℃5min，变性94℃45s，退火52～57℃45s，延伸72℃1min；循环30次，延伸72℃10min；保存4℃至取出，利用8％非变性聚丙烯酰胺(page)凝胶电泳，银染显色，银染显色过程为：0.1％agno3银染12-15min，2％naoh+1％甲醛显色5-10min，蒸馏水漂洗2-3次，记录结果。选择含有3个分子标记的单株与相应轮回亲本杂交，获得bc1f1。表1单片段置换系(sl7)的ssr分子标记引物名称正向引物序列反向引物序列dpl0852gttccaaatcaatctcgtgtggctgttacagatcaaactcccdpl0757ccctacaacagtttgataccatgaattgagggtattgctatacatcggdc40182aaaatactaaagtcgatagaattgcaccgttccaaatagggtc2015年冬天在海南三亚种植bc1f1和相应亲本，每行15-20株，每株取样提取dna，采用单片段置换系(sl7)上的分子标记(表1)进行扩增，确定bc1f1的基因型，选择含有3个分子标记的单株与相应轮回亲本回交，获得bc2f1，种子按单株收获。2016年夏天在山东棉花研究中心临清试验站种植bc2f1和相应亲本，重复之前步骤，获得bc3f1，种子按单株收获。2016年冬天海南三亚种植bc3f1和相应亲本，每行15-20株，每株取样提取dna，采用单片段置换系(sl7)上的分子标记(表1)进行扩增，确定bc3f1的基因型，选择含有3个分子标记的单株自交，获得bc3f2，种子按照纯合的单株混收。2017年夏天在山东棉花研究中心临清试验站和中国农科院棉花研究所白壁试验站种植f1、bc3f2和各个亲本，每个组合种植3个重复，每行15-20株。bc3f3代，不同遗传背景下，纤维强力也均有提高，见附图2，p1和p2在5％水平存在差异，p3、p5、p7和p8在1％水平存在显著性提高。田间鉴定：2017年夏天在山东棉花研究中心临清试验站和中国农科院棉花研究所白壁试验站种植f1、bc3f2和各个亲本，每个组合种植3个重复，每行15-20株。每行收取20铃，送20g皮棉到农业部纤维检测中心(中国农科院棉花研究所)检测纤维强力，检测结果见表2。表2f1和bc3f3世代纤维强力检测结果(单位：cn·tex-1)由上述实施例可知，本发明提供的利用棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系进行棉花分子育种的方法，通过利用棉花高纤维强力chr.7单qtl片段置换系与不同高产但纤维品质不理想的棉花品质/品系连续回交并自交，将该片段置换系导入到不同遗传背景的陆地棉中，结合分子标记辅助选择目标性状，在f1和bc3f3世代进行评价，可以系统、有效地提高棉花纤维强力，可以快速、高效培育优异(高纤维强力)棉花新品种/品系。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>山东棉花研究中心<120>一种利用chr.7单qtl片段置换系改良棉花纤维强力的分子育种方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gttccaaatcaatctcgtgt20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggctgttacagatcaaactccc22<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccctacaacagtttgataccatga24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4attgagggtattgctatacatcgg24<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaaatactaaagtcgatagaattgc25<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6accgttccaaatagggtc18当前第1页12