本发明涉及猪的人工授精，更加具体地说，涉及一种稀释剂及其制备方法和在猪精液低温保存中的应用。
背景技术：
猪人工授精技术是最简单有效的种猪培育和商品猪生产的方法，是实现科学现代化养猪的重要手段。与自然本交相比，猪人工授精有许多优点，它可以提高良种种公猪的利用率，能促进养猪业的品种改良和商品猪的质量；可以克服体格大小差异过大造成的交配困难；能减少疾病的传播；能减少人力、财力和物力的投入，提高养猪业的经济效益；在一定程度上可以克服精液地域和时间的限制，便于大面积推广应用。
猪人工授精技术的核心技术之一是猪精液的保存。好的精液保存(有效存活时间长)方法不仅能够大大促进猪人工授精技术的推广，而且对人工授精技术推广产生的价值至关重要。猪精液保存有常温保存、低温保存和冷冻保存三种方法。三种方法各有优缺点。常温保存方法简单，是目前养猪业生产上普遍应用的方法，缺点是保存时间较短。低温保存和冷冻保存目前技术上都还不很成熟，保存效果都不理想，要么有效保存时间短，要么保存后活率低，目前在生产实践中应用较少，特别是低温保存精液。
精液的保存与稀释液关系非常密切，在常温保存和低温保存时尤其如此。可以说，猪的常温保存稀释液和低温保存稀释液是猪精液常温保存和低温保存的关键，也是近些年来人们孜孜不倦一直研究的领域。
精液的低温保存就是在0～5℃的保存，通常是指冰箱冷藏室的保存。在0～5℃时，精子呈休眠状态，精子的代谢显著减弱，精子的活力明显下降，消耗的能量大大减少，理论上可极大地延长精子的存活时间。当温度回升后，精子代谢和运动又可逐渐恢复，仍具有正常的受精能力。低温保存需要降温，这会引起精子冷休克死亡，因此需要在精液的低温保存稀释液中添加抗冷休克物质如卵黄或奶类，并在降温过程中缓慢降温。由于猪精子对低温非常敏感，极容易冷休克死亡，因此低温保存的效果远远赶不上常温保存，似乎不适合猪精液的保存。有关猪精液低温保存的报道较少，生产实际中的应用更未见有报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种稀释剂及其制备方法和在猪精液低温保存中的应用，原材料来源方便，配置方法简单，能够明显延长猪精子低温保存有效存活时间和总存活时间。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
稀释剂，由基础稀释液和卵黄液组成，基础稀释液和卵黄液的体积比为(3—6)：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和水组成，在100ml水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2—5g、柠檬酸1—3g、葡萄糖1—4g、肾上腺素0.01—0.1g、青霉素0.01—0.1g、链霉素0.01—0.1g。
在上述技术方案中，基础稀释液和卵黄液的体积比为(4—5)：1。
在上述技术方案中，在100ml水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2.5—4g、柠檬酸1.5—3g、葡萄糖2—4g、肾上腺素0.03—0.05g、青霉素0.05—0.08g、链霉素0.05—0.08g。
在上述技术方案中，在100ml水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷3—5g、柠檬酸1—1.5g、葡萄糖1.5—2g、肾上腺素0.01—0.03g、青霉素0.01—0.05g、链霉素0.08—0.1g。
在上述技术方案中，链霉素为硫酸链霉素。
在上述技术方案中，青霉素为青霉素钠。
在上述技术方案中，卵黄液即鸡蛋的蛋黄的打匀状态，以新鲜鸡蛋制备，用浸渍体积百分数75％酒精的棉球檫拭蛋表面,干后打破蛋壳,慢慢倾去蛋清,将蛋黄移入小烧杯中,打匀使用。
在上述技术方案中，三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸和葡萄糖为分析纯，肾上腺素、青霉素和硫酸链霉素为医药级。
在上述技术方案中，水为超纯水、蒸馏水、二蒸水或者三蒸水。
在进行制备时，按照下述步骤进行：
步骤1，将三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素和链霉素均匀分散在蒸馏水中并定容，形成基础稀释液；同时将新鲜鸡蛋蛋黄打匀，形成卵黄液；
步骤2，将基础稀释液和卵黄液按照体积比为(3—6)：1进行混合均匀即可。
将制备的稀释剂进行低温保存，如0—5摄氏度下进行保存，保存时间不超过一周(即7天，每天24小时)。最好现配现用。
本发明的稀释剂在猪精液低温保存中的应用，猪精液和稀释剂的体积比为1：(1—5)，优选1：(2—4)。本发明还提供了肾上腺素在猪精液低温保存中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本猪精液低温保存稀释液具有原材料来源方便、配置方法简单的优点，能够明显提高猪精液低温保存的效果，使猪精子低温保存(0—5摄氏度)的有效存活时间平均延长到12天以上，总存活时间平均延长至14天以上(每天24小时)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细阐述。
使用的主要仪器设备和试剂如下：
海尔冰箱：型号bcd-216sdn，青岛海尔电冰箱股份有限公司。
低温高速离心机：型号centrifuge5810r，eppendorf公司产品。
电子天平：型号ja2003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司制造。
优普超纯水器：型号uph-1-20l，成都超纯科技有限公司制造。
普通生物显微镜：型号ba410，motic公司产品。
tris(三羟甲基氨基甲烷)：货号zz02531，novon公司进口分装产品。
柠檬酸：分析纯，批号2011121，天津市北方天医化学试剂厂生产。
葡萄糖：分析纯，批号2013815，天津市北方天医化学试剂厂生产。
注射用肾上腺素：医药级，批号1212251，天津金耀氨基酸有限公司生产。
注射用青霉素钠(青霉素)：兽用，批号a120201116，哈药集团制药总厂产品。
注射用硫酸链霉素(链霉素)：兽用，批号1369130111，河北远征药业有限公司产品。
选择当日产下的鸡蛋进行卵黄打匀，备用。
首先制备稀释剂如下
1.基础稀释液和卵黄液的体积比为3：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成，在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2g、柠檬酸2.5g、葡萄糖3g、肾上腺素0.08g、青霉素0.05g、链霉素0.03g。
2.基础稀释液和卵黄液的体积比为6：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成，在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷5g、柠檬酸1g、葡萄糖2.5g、肾上腺素0.05g、青霉素0.05g、链霉素0.05g。
3.基础稀释液和卵黄液的体积比为4：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成，在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2.5g、柠檬酸1.4g、葡萄糖2g、肾上腺素0.03g、青霉素0.05g、链霉素0.08g。
4.基础稀释液和卵黄液的体积比为5：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成，在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷3g、柠檬酸2g、葡萄糖1g、肾上腺素0.05g、青霉素0.01g、链霉素0.01g。
5.基础稀释液和卵黄液的体积比为4：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成，在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷4g、柠檬酸3g、葡萄糖1g、肾上腺素0.1g、青霉素0.08g、链霉素0.05g。
6.基础稀释液和卵黄液的体积比为4：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成，在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷3.5g、柠檬酸2.5g、葡萄糖4g、肾上腺素0.05g、青霉素0.1g、链霉素0.1g。
对上述制备的六组稀释剂进行猪精液的低温保存实验，具体如下：
猪鲜精为长白猪精液，活率0.85以上，来自天津市警备区青光农场种猪场。种公猪健康，强壮，生殖能力正常。鲜精用毛巾包裹，1～2h内运回实验室。运输过程中应避光，应防止精液的温度快速下降和剧烈震荡。
用毛巾包裹的鲜精和低温保存稀释液同时放置于室温下1～2小时，使鲜精降温至室温，并使鲜精温度和稀释液温度一致。将鲜精放入离心机，1000rpm离心10分钟，去上清液，然后沿管壁缓慢加入低温保存稀释液至原精液体积的四倍，加入时边加入边混合均匀。最后将混合均匀的用低温保存稀释液稀释的精液封口后放入含有400ml水的500ml的烧杯中，与烧杯一起放入冰箱的冷藏室进行降温并保存。
鲜精、稀释后的精液以及保存期间的精液(每日)应进行精子存活率测定。待测定的精液首先放入37℃恒温箱中孵育10min，然后滴加在37℃的载玻片上，盖上盖玻片，37℃的温度下置显微镜下进行观察确定。观察时至少观察5个不同视野，每个视野观察十个精子，记录存活精子数，算出精子的存活率。存活率测定应尽量快，应选择盖玻片中间的部位进行测定。经测试，使用稀释剂后六组实验的总体有效存活时间平均可延长至12天以上，总存活时间平均延长至14天以上，最长可至16天。
基于测试结果，重点分析肾上腺素的影响，同时以实施例3制备的稀释剂为例，采用相同配方，不添加肾上腺素，形成稀释剂的对照组，以实施例3的稀释剂为肾上腺素组，如下表所示：
由此可知，肾上腺素的添加有效延长猪精子(精液)的存活时间。
将六组实施例作为肾上腺组，将六组实施例相同配方不添加肾上腺素作为对照组，进行猪精子低温保存的测试，如下表所示：
肾上腺素对低温保存猪精子有效存活时间和总存活时间的影响
根据本发明内容进行配方的调整，均可实现稀释剂的制备，且与实施例表现出基本一致的性能，即延长猪精液低温保存时间至14天以上，即有效存活时间达到平均12.50±2.00天，总存活时间平均可达14.70±1.92天。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。