本发明属于生物技术领域，具体涉及一种茄子黄萎病抗病性的快速检测方法。
背景技术：
黄萎病是一种由大丽轮枝菌导致的常见的土传病害，该病原菌主要通过侵染植物根系堵塞植物根茎部维管束进而造成植物发病，常见蔬菜寄主包括茄子、番茄等。特别是由于棚室茄子连作造成黄萎病病害发生日益严重，对生产造成了严重危害。
当前常见黄萎病检测方法单一，主要是通过孢子悬浮液灌根或者通过刺茎、刺根等方法，即通过制备黄萎病菌孢子悬浮液对寄主植物进行灌根或者采用刺伤茎基部或者根部接种孢子悬浮液的方法。该方法虽然广泛应用，但是其制备孢子悬浮液工序繁琐且接种后植株发病耗时长，整个检测方法耗时可长达1个月以上时间。在接种过程中，由于接种土壤本身微生物种群及生物量已经达到动态平衡，接种后常导致病原菌孢子在土壤中被土壤已有微生物排斥，导致其存活时间很短，很难发挥其致病效果。在接种后植株发病时间较长，在发病过程中也常受外界因素影响，对其检测效果产生干扰。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是如何快速有效的检测茄子黄萎病抗性。
为了解决上述技术问题。本发明提供了一种茄子黄萎病抗性的快速检测方法。
本发明提供的茄子黄萎病抗性的快速检测方法包括如下步骤：
1)将茄子种子播种于含有黄萎病病原菌的培养基中，得到播种后培养基；
2)将基质覆盖所述播种后培养基中的种子上层，得到覆盖基质的培养基；
3)将所述覆盖基质的培养基进行培养，培养至茄子幼苗的子叶展开后，根据幼苗的生长势确定茄子的抗黄萎病类型。
上述步骤1)中，所述茄子种子在播种前还依次包括消毒和催芽的步骤。
进一步的，所述消毒的方法包括如下步骤：将茄子种子依次在无菌水、乙醇水溶液和次氯酸钠溶液中浸泡，得到消毒后种子。
所述消毒具体可按照如下方法进行：先将茄子种子在无菌水中浸泡，使所述茄子种子上的病原菌处于萌动的状态，然后将茄子种子依次在乙醇水溶液和次氯酸钠溶液中浸泡，将活化后的病原菌杀死，得到消毒后的种子。
更进一步的，所述乙醇水溶液为体积分数为75％的乙醇水溶液；
所述次氯酸钠溶液为质量浓度为5％的次氯酸钠溶液；
在所述无菌水中浸泡的时间可为1-2小时；
在所述乙醇水溶液和所述次氯酸钠溶液中浸泡的时间均可为30s，该步骤可重复3-5次；
所述浸泡后均包括用无菌水冲洗的步骤；所述冲洗的次数可为2-3次。
所述催芽的方法包括如下步骤：将用无菌水冲洗干净的消毒后的种子置于25-28℃条件下进行催芽。
上述步骤1)中，所述含有黄萎病病原菌的培养基的制备方法包括如下步骤：将黄萎病病原菌接种至含有pda培养基的培养皿中，培养至所述病原菌长满菌板，得到含有黄萎病病原菌的培养基。
进一步的，所述培养的条件为25℃、避光培养7-10天；所述培养皿中pda培养基的厚度至少为3mm。在本发明中，所述培养皿中pda培养基的厚度具体为3mm，所述培养皿的规格为直径80mm、高度10mm。
在本发明中，所述黄萎病病原菌是经过分离鉴定的黄萎病病原菌。所述分离鉴定的具体方法如下：将田间采集的发病茄子的病健结合处进行酒精消毒，消毒处理后置于无菌pda培养基中培养，待其长出大量菌丝后，首先在显微镜下观察拍照，然后将菌丝回接到健康茄子的根茎部，待茄子发病后，再按照上述方法从发病处分离培养病原菌，待长出大量菌丝后在显微镜下观察，若所得结果与前期观察拍照结果一致且与已报道的黄萎病病原菌的形态完全一致，则可证明该病原菌为黄萎病病原菌。在本发明中，所述黄萎病病原菌具体为大丽轮枝菌verticilliumdahliae。
上述步骤1)中，所述播种的方法为将催芽后的茄子种子均匀的播种在每个培养皿中。在本发明中，每个培养皿中具体播种50粒催芽后的茄子种子。
上述步骤2)中，所述基质可为混配基质，如蛭石和椰糠基质按照质量比为1：1混匀得到的混合基质，也可为单一基质，如蛭石。在本发明中，所述基质具体为蛭石。
上述步骤2)中，所述基质的厚度与所述培养皿口部平齐。
上述步骤2)中，所述基质在覆盖前还依次包括灭菌和润湿的步骤。
进一步的，所述灭菌的条件为：121℃灭菌30分钟；采用无菌水将所述基质润湿，具体的，可手持雾化好的小喷壶均匀喷洒基质。
上述方法中，所述步骤1)和所述步骤2)均在无菌条件下操作。
上述步骤3)中，将所述覆盖基质的培养基进行培养的方法包括如下步骤：用封口膜将所述覆盖基质的培养基封口后进行培养，培养至茄子出苗后去除封口膜，使其正常展叶生长。所述培养的温度可为25-28℃，在25-28℃条件下既可以保持病原菌活性，又可以保证种子正常出苗。在本发明中，所述培养的温度具体为25℃。
上述步骤3)中，所述根据幼苗的生长势确定茄子的抗黄萎病类型的方法包括如下步骤：根据幼苗的生长势确定其病情指数，再根据所述病情指数确定其抗黄萎病类型。所述幼苗的生长势包括子叶伸展情况、子叶黄化情况、下胚轴伸展情况、下胚轴生长及侵染情况、根系生长及侵染情况。
进一步的，根据幼苗的生长势确定其病情指数，再根据所述病情指数确定其抗黄萎病类型的方法包括如下步骤：根据幼苗的生长势确定其病情等级，再根据所述病情等级计算其病情指数，最后根据所述病情指数确定其抗黄萎病类型；
所述根据幼苗的生长势确定其病情等级的标准如下：
0级：子叶伸展；下胚轴健壮；根系生长良好。
1级：子叶伸展；下胚轴健壮；主根生长优势受限，但侧根生长旺盛。
2级：子叶伸展受限，出现黄化现象；下胚轴生长纤细；主根染菌导致黑褐色，生长缓慢，侧根量少。
3级：子叶不伸展、黄化；下胚轴纤细；根系主根染菌导致黑褐色，生长缓慢，有少量侧根产生。
4级：子叶不伸展、黄化严重；下胚轴纤细、弯曲、有侵染现象；根系受侵染成黑褐色，短小、腐烂，无侧根产生，或者因根系受侵染严重未出苗。
所述病情指数的计算公式如下：病情指数(di)＝∑(级数×株数)/(最高级数×总株数)×100。
根据所述病情指数确定茄子抗黄萎病类型的标准如下：
若di≤15，待测茄子对黄萎病的抗性为抗病(r)；
若15＜di≤30，待测茄子对黄萎病的抗性为中抗(mr)；
若30＜di≤50，待测茄子对黄萎病的抗性为耐病(t)；
若50＜di≤70，待测茄子对黄萎病的抗性为中感(ms)；
若di＞70，待测茄子对黄萎病的抗性为感病(s)。
上述方法在选育抗黄萎病茄子品种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果：
(1)与常规孢子悬浮液灌根方法相比，本发明操作简单，省去制备孢子悬浮液的繁琐工序。该方法对目标品种只需要催芽播种，省去苗期管理复杂过程。
(2)与常规孢子悬浮液灌根方法相比，本发明简单省时省力，常规接种方法需要制备孢子悬浮液、播种育苗、苗期管理、接种后再进行管理，耗时通常长达1个月甚至更长，而本发明只需要简单培养致病菌、催芽播种，时间大大缩短。整个检测方法可在10天内全部完成。
(3)与常规孢子悬浮液灌根方法相比，本发明的结果较为精确，感病品种在接种后，出苗后子叶展开后即可发病，生长畸形；而抗病品种则生长正常，无病症。
本发明提供了一种茄子黄萎病抗病性的快速检测方法，该方法包括如下步骤：首先将分离鉴定后的黄萎病病原菌在pda培养基中培养，待其长满板后，将需检测的茄子种子依次进行消毒、催芽，并直接将催芽后的种子播种在长满黄萎病病原菌的pda培养基上，上面覆盖高温灭菌后的蛭石，再将播种后的培养基放在25℃培养箱中培养，待子叶展开后，开始调查其生长势，通过幼苗的生长势确定其抗病指数和抗病类型。通过实验证明：本发明的检测方法结果准确，且操作简单，省时省力。
附图说明
图1为含菌培养基和无菌培养基(常规培养基)播种无菌发芽茄子种子图片。a为长满黄萎病病菌的培养基；b为含黄萎病病菌的培养基上播种发芽的茄子种子；c为不含病菌的常规培养基上播种发芽的茄子种子；d为茄子种子播种后覆盖基质。
图2为常规无菌土壤播种和无菌培养基播种的对照表现。a为常规无菌土壤播种的对照表现；b为常规无菌培养基播种的对照表现。
图3为8种茄子栽培品种的黄萎病抗病性表现。a为苏琦茄菌板播种后的黄萎病抗病性表现；b为黑贵人菌板播种后的黄萎病抗病性表现；c为威11菌板播种后的黄萎病抗病性表现；d为威十六菌板播种后的黄萎病抗病性表现；e为沈茄一号菌板播种后的黄萎病抗病性表现；f为关东黑帝菌板播种后的黄萎病抗病性表现；g为黑仙子菌板播种后的黄萎病抗病性表现；h为黑亮1号菌板播种后的黄萎病抗病性表现。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
下述实施例中的pda培养基是将200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂和1l水混匀得到的。
实施例1、一种茄子黄萎病抗病性的快速检测方法
1、黄萎病病原菌的分离鉴定与培养
(1)黄萎病病原菌的分离鉴定
将田间采集的发病茄子的病健结合处进行酒精消毒，消毒处理后置于无菌pda培养基中培养，待其长出大量菌丝后，首先在显微镜下观察拍照，然后将菌丝回接到健康茄子的根茎部，待茄子发病后，再按照上述方法从发病处分离培养病原菌，待长出大量菌丝后，在显微镜下观察，若所得结果与前期观察一致且与文献“引起茄子黄化萎蔫病原菌的分离与鉴定[j].江苏农业科学，2012，40(12):127-129”中已报道的黄萎病病原菌的形态完全一致，则可证明该病原菌为黄萎病病原菌。本发明的黄萎病病原菌为大丽轮枝菌verticilliumdahliae。
(2)将经鉴定后的黄萎病病原菌接种在pda培养基上(培养皿的规格为直径80mm、高度10mm)，然后置于恒温培养箱中，在25℃、避光条件下培养7-10天，使病原菌长满板且长势旺盛均匀，得到含菌的待播种培养基(图1a)。
为了防止浸水后的蛭石压坏培养基，便于种子发根及吸取养分，pda培养基的厚度至少为3mm，在本实施例中pda培养基的厚度为3mm。本发明在制备pda培养基时，向培养皿中倒入加热溶解后的pda培养基，以刚好能够没过培养皿底部为准，厚度约为3mm。
2、茄子种子的消毒
先用无菌水浸泡茄子种子1-2小时，使种子上的病原菌处于萌动的状态，再用无菌水冲洗，冲洗掉一部分病原菌，得到清洗后的种子；然后将清洗后的种子放入体积分数为75％的乙醇水溶液中浸泡半分钟，再放入质量浓度为5％的次氯酸钠溶液(购自哈尔滨市道外区凯誉试剂经销部)中浸泡半分钟，重复3-5次，将活化后的病原菌杀死；最后用无菌水冲洗2-3次，得到消毒后的种子。
3、茄子种子的播种
将步骤2中的消毒后的种子置于25-28℃条件下进行催芽，得到催芽后的种子；并将催芽后的种子均匀地播种于步骤1中含菌的待播种培养基中，在每个培养皿中播种50粒种子，得到播种后培养基(图1b)。并以未接种黄萎病病原菌的pda培养基作为空白对照(图1c)。
4、覆盖基质
(1)基质的预处理
本发明的覆盖基质可为混配基质，如蛭石和椰糠基质按照质量比为1：1混匀得到的混合基质，也可为单一基质，如蛭石。
本实施例以蛭石(购自彰武中农赛世农业科技有限公司)为基质，采用灭菌锅将蛭石在121℃高温下灭菌30分钟。并在覆盖之前采用无菌水将蛭石充分润湿(手持雾化好的小喷壶均匀喷洒)，得到处理后的基质。
(2)覆盖基质
将处理后的基质覆盖播种后培养基中的种子上层，覆盖厚度与培养皿口部平齐即可，不可按压(注意不要破坏培养基)，得到覆盖基质的培养基(图1d)，采用封口膜封闭覆盖基质的培养基，防止染杂菌。
上述步骤1-4均在无菌操作台中操作。
5、培养
将覆盖基质的培养基置于恒温培养箱进行培养，培养条件为25℃，培养至茄子出苗后立即去除封口膜，将培养皿打开使其正常展叶生长。
分别在无菌的纯土壤和无菌的培养基上按照常规方法播种无菌茄子种子作为对照，在对照中长出的茄子苗均为正常生长的苗，以对比在含菌培养基中播种的茄子种子的发病情况。常规无菌土壤播种和无菌培养基播种的对照表现如图2所示。
6、黄萎病抗病性鉴定
待茄子幼苗的子叶展开后，立即调查出苗率及其生长情况，包括子叶伸展情况、子叶黄化情况、下胚轴伸展情况、下胚轴生长及侵染情况、根系生长及侵染情况。根据幼苗的生长势确定病情等级，并计算病情指数。最后根据病情指数确定待测茄子抗黄萎病类型。
本发明中的茄子黄萎病的病情分级为0、1、2、3和4级，具体各级别的标准如下：
0级：子叶伸展；下胚轴健壮；根系生长良好。
1级：子叶伸展；下胚轴健壮；主根生长优势受限，但侧根生长旺盛。
2级：子叶伸展受限，出现黄化现象；下胚轴生长纤细；主根染菌导致黑褐色，生长缓慢，侧根量少。
3级：子叶不伸展、黄化；下胚轴纤细；根系主根染菌导致黑褐色，生长缓慢，有少量侧根产生。
4级：子叶不伸展、黄化严重；下胚轴纤细、弯曲、有侵染现象；根系受侵染成黑褐色，短小、腐烂，无侧根产生，或者因根系受侵染严重未出苗。
本发明中的病情指数的计算公式如下：
病情指数(di)＝∑(级数×株数)/(最高级数×总株数)×100；
根据病情指数确定待测茄子抗黄萎病类型：
若di≤15，待测茄子对黄萎病的抗性为抗病(resistance，r)；
若15＜di≤30，待测茄子对黄萎病的抗性为中抗(mediumresistance，mr)；
若30＜di≤50，待测茄子对黄萎病的抗性为耐病(tolerant，t)；
若50＜di≤70，待测茄子对黄萎病的抗性为中感(moderatesusceptibility，ms)；
若di＞70，待测茄子对黄萎病的抗性为感病(susceptibility，s)。
实施例2、实施例1中的方法在检测茄子黄萎病抗病性中的应用
一、供试材料
本实施例选用8种茄子栽培品种，具体信息如表1所示。其中，苏崎茄经前人试验论证(参考文献：茄子黄萎病抗性鉴定与ssr标记的关联分析[d].江苏.扬州大学.)为高抗黄萎病品种，其余茄子品种均为市场搜集的常规栽培品种。
表1、8种茄子栽培品种的名称及来源
二、本发明方法进行黄萎病抗病性鉴定
按照实施例1中的方法分别对步骤一中的供试材料的黄萎病抗病性进行鉴定。待茄子子叶展开后进行调查、拍照。
8种茄子栽培品种的黄萎病抗病性表现如下：
1、苏琦茄菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：叶伸展良好，无黄化现象，主根生长良好，生长优势明显，有少量侧根产生(图3a)。
2、黑贵人菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：子叶伸展受限，有黄化现象，主根生长优势明显，有少量侧根产生(图3b)。
3、威11菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：子叶伸展受限，有黄化现象，主根生长优势受到限制，产生大量侧根(图3c)。
4、威十六菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：子叶伸展受限，有黄化现象，主根生长优势受到限制，产生大量侧根(图3d)。
5、沈茄一号菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：子叶伸展严重受限，黄化现象严重，下胚轴生长畸形，整个根系受到病原菌侵染导致呈黑褐色，且短小、有少量侧根(图3e)。
6、关东黑帝菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：子叶伸展严重受限，黄化现象严重，下胚轴生长畸形，整个根系受到病原菌侵染导致呈黑褐色，且短小、无侧根(图3f)。
7、黑仙子菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：子叶伸展严重受限，黄化现象严重，下胚轴生长畸形，整个根系受到病原菌侵染导致呈黑褐色，且短小、无侧根(图3g)。
8、黑亮1号菌板播种后的黄萎病抗病性表现如下：子叶伸展受限，有黄化现象，主根生长优势受到限制，产生大量侧根(图3h)。
三、常规方法进行黄萎病抗病性鉴定
通过常规黄萎病抗性检测方法检测8种茄子栽培品种对黄萎病抗性的类型。具体步骤参考文献“茄子黄萎病抗性鉴定与ssr标记的关联分析[d].江苏.扬州大学.”中的方法。
本发明的黄萎病抗病性检测方法与常规黄萎病抗性检测方法的检测结果如表2所示。从表中可以看出，本发明的黄萎病抗病性检测方法与常规检测方法的检测结果均一致。说明本发明的黄萎病抗病性检测方法的结果是准确可靠的。
表2、本发明检测方法与常规检测方法的检测结果