本发明属于水产养殖技术领域，具体地说，涉及一种长薄鳅的人工授精方法。
背景技术：
长薄鳅(leptobotiaelongata，bleeker)又称花鳅、薄鳅，属鳅科、沙鳅亚科、薄鳅属是我国特有的种类，主要分布于上江中上游及其支流，在鳅科鱼类中，其个体最大、生长最快，一般个体为0.2-0.4kg，最大个体达到3.0kg。长薄鳅色泽鲜艳，头部和躯干部体表分布有不规则深褐色斑纹，观赏价值极高，在国内、国际市场上享有盛誉，1989年在新加坡国际观赏鱼评比中夺得金奖，它是一种兼可观赏和食用的名优经济鱼类，具有极好的市场开发前景。1998年国家濒危物种科学委员会和国家环保局将其列入中国濒危动物红皮书(殷红霞，2006)。
然而由于过度捕捞、水电站建设对长薄鳅产卵场的破坏及工业的快速发展导致的水域污染等因素的影响，使得长薄鳅的野生资源急剧下降，因此长薄鳅物种保护工作亟待开展。鱼类人工繁殖及增殖放流是目前开展物种保护、增加种群数量最有效的措施之一。完善的亲鱼人工繁殖技术是保证鱼类人工增殖放流工作顺利进行的先决条件。近年来国内学者对于长薄鳅相关研究很多，涉及生物学、人工繁殖、苗种培育等。在这些研究中长薄鳅人工繁殖和苗种培育是在在池塘条件下进行的(赵云芳，1995；梁银铨等，1999；梁银铨等，2007；梁银铨等，2000；孙大东等，2010)，但在室内鱼类循环水养殖系统条件下的研究尚未见报道。
目前长薄鳅的人工繁殖还处在一个初级研究阶段，内塘培育的亲鱼成熟率低，特别是雄鱼的精量极少，且雌雄大都不同步，常规的干法授精方法是先挤卵后挤精液，往往把卵挤出后再挤精液时精液很难挤出或很少，严重影响受精率。
为解决上述问题，本发明提供了一种长薄鳅的人工授精方法，该方法简单，操作方便，克服了以上的不足，在亲鱼成熟率差、不同步、精量少的情况下能有效提高长薄鳅的受精率。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的不足，目的是提供一种长薄鳅的人工授精方法，该方法在长薄鳅的繁殖时将雄鱼精液在生理盐水中进行短期保存，在雌鱼顺利排卵时利用等量的葡萄糖用水(盐度0.45％)激活，保证了精子的活力，提高了鱼卵的受精率，并且简单，操作方便。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一种长薄鳅的人工授精方法，包括如下步骤：
(1)试剂的准备：
a、分别准备一定质量浓度的生理盐水和葡萄糖注射液各一瓶，并将其放入与催产水温一致的水体中浸泡，备用；
b、准备ms222麻醉剂一袋，备用；
(2)工具的准备：
a、准备内壁光滑的塑料盆1-2个、鱼夹2个、20ml注射器2-4个、干燥的塑料吸管2-5个、毛巾2-4条、方形塑料盒2个、羽毛3-5根；
b、将塑料盆用毛巾擦干水分；将2个塑料盒装上与鱼催产池水温一致的清水，按50-100ppm的浓度往其中一个塑料盒中加入ms222麻醉剂，并将药物混合均匀备用；
c、准备一台增氧泵；
(3)人工受精操作：
a、将注射催产药物达到效应时间、并开始发情排卵的雌雄长薄鳅亲鱼拉网集中，然后挑选能顺利挤出精卵的雌雄亲鱼放入盛有麻醉剂溶液的塑料盒中麻醉；
b、取一个20ml的注射器从调节好水温的生理盐水注射液中吸取20ml生理盐水挤到准备好的塑料盆中；用另一个20ml注射器吸取等量的葡萄糖注射液备用；
c、取完全麻醉的一尾雄鱼放到鱼夹中，腹部朝上托出水面，用干毛巾擦干鱼体肛门、鱼夹和操作人身上各部位的水分，保证含有麻醉剂的水不要混到精液中滴到盆里，用手轻压鱼腹部挤出精液，并用塑料吸管将雄鱼精液吸到塑料管内，然后再将精液挤到盛有生理盐水的塑料盆中，之后将亲鱼放到另一个盛有清水的塑料盒中使其缓慢苏醒；接着选一尾雌鱼放到鱼夹中，将亲鱼包好，一手捂住肛门，一手拿鱼夹将亲鱼抱出，用干毛巾擦干鱼体、鱼夹和操作人身上各部位的水分，保证含有麻醉剂的水不要滴到盆里，用手轻压鱼腹部挤出卵子，卵子挤出到装有生理盐水和精液的塑料盆中，之后将亲鱼也放到盛有清水的塑料盒中并开启增氧泵增氧使其缓慢苏醒；然后，用羽毛轻轻搅动含有精液和卵子的生理盐水5-20秒，使其充分混合均匀，接着将20ml的葡萄糖注射液挤入盆中的精卵上，再用羽毛轻轻搅拌20-30秒使精子充分激活并使卵子受精；
d、往上述盛有精液和卵子的塑料盆中加入1-2kg清水，搅拌10-20秒左右后静置1分钟左右，最后用大量清水清洗受精卵2-3次，最后移到孵化器中进行孵化。
优选的，所述生理盐水的质量浓度为0.9％，葡萄糖注射液的质量浓度为5％；二者的体积均为250-500ml。
优选的，所述塑料盒中清水的装入量约为塑料盒体积的1/2。
优选的，所述方形塑料盒盛水的容量大于50kg。
优选的，塑料盆中精液的挤入量为2-3滴。
本发明人工授精方法主要通过生理盐水的盐度基本符合亲鱼体液的盐度，能使精液能在短时间内得到较好的保存，而葡萄糖又能将其激活并提供营养能量，提高精子活力，达到较高的受精率的目的。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1)本发明取材方便，成本低廉，操作方法简单；
2)本发明是采用生理盐水对精子的短期保持，对雄鱼精量少的亲鱼，能利用生理盐水保存，利用葡萄糖提供营养能量，大大提高鱼卵的受精率，能有效地解决亲鱼雌雄不同步的问题；
3)本发明利用生理盐水对雄鱼精液进行稀释，使精卵迅速混合均匀、达到充分近距离接触、并利用葡萄糖为精子提供营养和能量，提高精子的活力和寿命，有效提高鱼卵的受精率。
具体实施方式：
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解，所举实施例的目的在于进一步阐述本发明的内容，而不能在任何意义上解释为对本发明保护范围的限制。
实施例1：
2017年7月11日，在四川省大渡河境内安谷鱼类增殖站，循环水系统催产孵化及苗种培育车间的1口2m培育缸中挑选成熟较好的长薄鳅亲鱼6组(雌雄比为2:2)进行人工催产，分两针注射，第一针时间为上午18:00时，第二针为晚上24:00时，催产水温为22℃。到第二天11:00时发现亲鱼有追逐发情的迹象，但追逐不明显。到12：00时发现亲鱼追逐明显激烈，将亲鱼捞起检查时发现亲鱼(雌鱼)已开始排卵，轻压腹部有卵流出，雄鱼也能挤出少量精液，即准备进行人工授精。此次人工授精分两种方法进行，各为3组亲鱼，一组为试验组，采用先挤精液到生理盐水中，再后挤卵到盆中，最后加葡萄糖稀释的方法进行受精；对照组按我们常用的干法授精法进行受精。具体如下：
一、试验组
长薄鳅的人工授精方法，包括如下步骤：
(1)试剂的准备：
a、分别准备250ml装0.9％的生理盐水和250ml装5％葡萄糖注射液各一瓶，并将其放入与催产水温一致的水体中浸泡，备用；
b、准备ms222麻醉剂一袋备用；
(2)工具的准备：
a、准备内壁光滑的塑料盆1个、鱼夹2个、20ml注射器2个、干燥的塑料吸管5个、毛巾4条、70kg容量的方形塑料盒2个和羽毛5根；
b、将塑料盆用毛巾擦干水分；将2个塑料盒装上与鱼催产池水温一致的清水，水量控制在塑料盒总容积的1/2左右，并按50ppm的浓度往其中一个塑料盒中加入ms222麻醉剂，然后将药物混合均匀备用；
c、准备一台增氧泵，包括电源、插线板和相关氧管、气石；
(3)人工受精操作：
a、挑选能顺利挤出精卵的雌雄亲鱼(1尾雌鱼1尾雄鱼)放入盛有麻醉剂溶液的塑料盒中麻醉；
b、取一个20ml的注射器从调节好水温的步骤(1)准备的生理盐水中吸取20ml生理盐水挤到准备好的塑料盆中，用另一个20ml注射器吸取等量的葡萄糖注射液备用；
c、取完全麻醉的一尾雄鱼放到鱼夹中，肛门朝上，用干毛巾擦干鱼体、鱼夹和操作人身上各部位的水分(保证含有麻醉剂的水不要滴到盆里)，用手轻压鱼腹部挤出精液，并用塑料吸管将雄鱼精液吸到塑料管内，然后再将精液挤到盛有生理盐水的塑料盆中(滴3滴精液)，之后将亲鱼放到盛有清水的另一塑料盒中使其缓慢苏醒；接着选1尾雌鱼放到鱼夹中包好，一手捂住肛门(确保鱼卵不要随意流出)，一手抓住鱼夹将亲鱼抱出，用干毛巾擦干鱼体、鱼夹和操作人身上各部位的水分(保证含有麻醉剂的水不要滴到盆里)，用手轻压鱼腹部挤出卵子，卵子挤出到装有生理盐水和精液的塑料盆中，之后将亲鱼也放到盛有清水的塑料盒中并开启增氧泵增氧使其缓慢苏醒；接着，用羽毛轻轻搅动含有精液和卵子的生理盐水20秒，使其充分混合均匀，并将20ml的葡萄糖用水挤入盆中精卵上，再用羽毛轻轻搅拌30秒使精子充分激活并使卵子受精；
d、1min后往上述盛有精液和卵子的塑料盆中加入1.5kg清水，搅拌10s左右后静置1分钟左右，最后用大量清水清洗受精卵3次，再用量筒计量法获受精卵0.8万粒(目前一种常用的计量方法)，并移到一个自制孵化篓中进行流水孵化，孵化水温为22.1℃；
e、用同样的方法进行剩下2组亲鱼的人工授精工作。最终计量3组亲鱼共获受精卵约2.6万粒。
(4)受精率统计：
经过10小时的孵化，受精卵已发育到原肠中期。随机用鱼苗捞网捞取少量鱼卵进行受精率统计(随机捞取三次取平均值)。统计结果为：第一次取卵128粒、受精卵109粒，受精率85.16％；第二次取卵136粒、受精卵116粒，受精率85.29％；第三次取卵187粒、受精卵159粒，受精率85.03％；平均受精率85.14％。
二、对照组
长薄鳅的干法人工授精方法，包括如下步骤：
1、受精前的试剂及工具准备
a、准备ms222麻醉剂一袋、内壁光滑的塑料盆1个、鱼夹2个、20ml注射器2个、干燥的塑料吸管2个、毛巾4条、70kg方形塑料盒2个、5根羽毛；
b、将塑料盆用毛巾擦干水分；将2个塑料盒装上与鱼催产池水温一致的清水，水量控制在塑料盆总容积的1/2左右，并按50ppm的浓度往其中一个塑料盒中加入ms222麻醉剂，并将药物混合均匀备用；并准备一台增氧泵，包括电源、插线板和相关氧管、气石；
2、人工授精操作
a、将能顺利挤出精卵的雌雄亲鱼(1尾雌鱼1尾雄鱼)放到盛有麻醉剂的溶液中麻醉；
b、亲鱼完全被麻醉后，一人将1尾雌鱼放到鱼夹中提出，用干毛巾擦干鱼体、鱼夹和操作人身上各部位的水分(保证含有麻醉剂的水不要滴到盆里)，将卵挤到准备好的的擦干水分的盆中，亲鱼挤完卵后放到另一只盛有清水的塑料盒中使其缓慢苏醒；接着将雄鱼用同样的方法(放入鱼夹、擦干水分、挤精)将精液挤到装有卵的塑料盆中(只能挤出了3-4滴精液)，然后用羽毛轻轻搅动15秒(使精卵充分混合)；接着加入少量清水并用羽毛轻轻搅拌25秒使精子充分激活并使卵子受精；
c、1分钟后用大量清水清洗受精卵3次，再用量筒计量获卵0.6万粒，移到一个自制孵化篓中进行流水孵化，孵化水温为22.1℃。
d、用同样的方法进行其他2组亲鱼的人工授精操作。最后统计共获卵2.4万粒左右。
3、受精率统计
经过10小时的孵化，受精卵已发育到原肠中期。随机用鱼苗捞网捞取少量鱼卵进行受精率统计(随机捞取三次取平均值)。统计结果为：第一次取卵115粒、受精卵33粒，受精率28,7％；第二次取卵177粒、受精卵54粒，受精率30.5％；第三次取卵254粒、受精卵77粒，受精率30.3％，平均受精率30.04％。
实施例2
2017年6月14日，在四川省攀枝花市境内金沙江中游大唐观音岩水电站鱼类增殖放流站室外水泥池中挑选成熟亲鱼4组(雌雄比为1:1)进行催产。分两针注射，第一针时间为上午9:00时，第二针为晚上15:30时，催产水温为24℃。到22:00估计到效应时间拉起网箱进行观察发现亲鱼还未排卵。半小时后发现亲鱼在池中有追逐发情现象，捞起亲鱼检查时发现雌鱼已开始排卵，轻压腹部有卵流出，雄鱼也能挤出少量精液，即准备进行人工授精。此次人工授精分两种方法进行，一种为试验组，选择亲鱼2组，采用先挤精液到生理盐水中，再后挤卵到盆中，最后加葡萄糖稀释的方法进行受精；对照组亲鱼2组，按我们常用的干法授精法进行受精。具体如下：
一、试验组
长薄鳅的人工授精方法，其步骤是：
(1)试剂的准备：
a、分别准备250ml装0.9％的生理盐水和250ml装5％葡萄糖注射液各一瓶，并将其放入与催产水温一致的水体中浸泡，备用；
b、准备ms222麻醉剂一袋备用；
(2)工具的准备：
a、准备内壁光滑的塑料盆1个、鱼夹2个、20ml注射器2个、干燥的塑料吸管4个、毛巾4条、70kg方形塑料盒2个和羽毛5根；
b、将塑料盆用毛巾擦干水分；将2个塑料盒装上与鱼催产池水温一致的清水，水量控制在塑料盆总容积的1/2左右，并按50ppm的浓度往其中一个塑料盒中加入ms222麻醉剂，然后将药物混合均匀备用；
c、准备一台增氧泵，包括电源、插线板和相关氧管、气石；
(3)人工受精操作：
a、挑选能顺利挤出精卵的雌雄亲鱼(1尾雌鱼1尾雄鱼)放入盛有麻醉剂溶液的塑料盒中麻醉；
b、取一个20ml的注射器从调节好水温的步骤(1)中准备的生理盐水中吸取20ml生理盐水挤到准备好的塑料盆中，用另一个20ml注射器吸取等量的葡萄糖注射液备用；
c、取完全麻醉的一尾雄鱼放到鱼夹中，腹部朝上，用干毛巾擦干鱼体、鱼夹和操作人身上各部位的水分(保证含有麻醉剂的水不要滴到盆里)，用手轻压鱼腹部挤出精液，并用塑料吸管将雄鱼精液吸到塑料管内，然后再将精液挤到盛有生理盐水的塑料盆中，之后将亲鱼放到另一个盛有清水的塑料盒中使其缓慢苏醒；接着选1尾雌鱼依次放到鱼夹中包好，一手捂住肛门(确保鱼卵不要随意流出)，一手抓住鱼夹将亲鱼抱出，用干毛巾擦干鱼体、鱼夹和操作人身上各部位的水分(保证含有麻醉剂的水不要滴到盆里)，用手轻压鱼腹部挤出卵子，卵子挤出到装有生理盐水和精液的塑料盆中，之后将亲鱼也放到盛有清水的塑料盒中并开启增氧泵增氧使其缓慢苏醒；接着，用羽毛轻轻搅动含有精液和卵子的生理盐水20秒，使其充分混合均匀，并将20ml的葡萄糖用水挤入盆中精卵上，再用羽毛轻轻搅拌25混合均匀，使精子充分激活并使卵子受精；
d、30秒后往上述盛有精液和卵子的塑料盆中加入1kg清水，搅拌10s左右后静置1分钟，最后用大量清水清洗受精卵2次，再放到天平上进行称量，计算所得鱼卵为0.6万粒，然后将其移到自制孵化篓中进行流水孵化，孵化水温为22.5℃。
e、采取同样的方法进行第二组亲鱼的人工授精，计数获卵0.75万粒。
(4)受精率统计
经过8小时的孵化，受精卵发育到原肠中期。随机用鱼苗捞网捞取少量鱼卵进行受精率统计(2组各随机捞样3次取平均值)。
统计结果为：
第一组第一次取卵115粒、其中受精卵98粒，受精率85.22％；第二次取卵318粒、受精卵270粒，受精率84.91％；第三次取卵284粒、受精卵242粒，受精率85.21％，平均值85.08％。
第二组第一次取卵166粒、其中受精卵141粒、受精率84.94％；第二次取卵189粒、其中受精卵162粒、受精率85.71％；第三次取卵336粒、其中受精卵285粒、受精率84.82％，平均为85.09％。
两组的平均受精率为85.085％。
二、对照组
长薄鳅的干法人工授精方法，其步骤是：
1、受精前的试剂及工具准备：
a、准备ms222麻醉剂一袋、内壁光滑的塑料盆2个、鱼夹2个、20ml注射器2个、毛巾4条、容量70kg的方形塑料盒2个、5根羽毛；
b、将塑料盆用毛巾擦干水分；将2个塑料盒装上与鱼催产池水温一致的清水，水量控制在塑料盒总容积的1/2左右，并按50ppm浓度往其中一个塑料盒中加入ms222，将药物混合均匀备用；准备一台增氧泵，包括电源、插线板和相关氧管、气石。
2、人工授精操作：
a、挑选能顺利挤出精卵的雌雄亲鱼1组(雌雄鱼各1尾)放到盛有麻醉剂的溶液中麻醉；
b、亲鱼完全被麻醉后，一人将1尾雌鱼放到鱼夹中提出，用干毛巾擦干鱼体、鱼夹和操作人身上各部位的水分(保证含有麻醉剂的水不要滴到盆里)，将卵挤到准备好的的擦干水分的塑料盆中。另一人同时将雄鱼采用上述方法(放入鱼夹、擦干水分、挤精)将1尾雄鱼的精液挤到装有卵的塑料盆中，然后用羽毛轻轻搅动20秒，之后加入少量清水并用羽毛轻轻搅拌30s激活精子使卵子受精；
c、1min后用大量清水清洗受精卵2次，再用天平秤称量共获卵0.65万粒，称量后将鱼卵移到另一个自制孵化篓中进行循环水孵化，孵化水温为22.5℃；
d、接着用上述方法进行另外1组亲鱼的人工授精，获卵1.2万粒，并移到另外的孵化篓中孵化，孵化水温也为也为22.5℃。
3、受精率统计
经过8小时的孵化受精卵发育到原肠中期。随机用鱼苗捞网捞取少量鱼卵进行受精率统计(2组各随机捞取3次取平均值)。
统计结果为：
第1组：第一次取卵145粒、受精卵43粒，受精率29.66％；第二次取卵248粒、受精卵74粒，受精率29.84％；第三次取卵176粒、受精卵53粒，受精率30.11％，平均值29.88％；
第二组：第一次取卵214粒、受精卵64粒，受精率29.9％；第二次取卵237粒、受精卵72粒，受精率30.38％；第三次取卵302粒、受精卵91粒，受精率30.13％，平均值30.15％；
两组平均受精率为30.02％。
应当指出，以上所述具体实施方式可以使本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。因此，本领域技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或者等同替换；而一切不脱离本发明的精神和技术实质的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明专利的保护范围当中。