本发明属于植物组织培养技术领域，尤其是一种蝴蝶兰组织培养基及其制备方法。
背景技术：
蝴蝶兰属兰科植物，有“兰中皇后”之美誉，其花姿婀娜、花色高雅，花期长达3～4个月，观赏价值和经济价值较高，备受消费者青睐。在自然条件下，蝴蝶兰主要靠分株、种子繁殖，繁殖率低，而且由于长期进行有性繁殖，带病毒株增多，逐渐使种性降低，影响生长。如今组织培养已经成为蝴蝶兰无性繁殖最常用的方法，既可以保持母本的优良性状，避免变异植株的产生，又以快速繁殖子代，不受季节限制周年生产，容易去病毒等优点来适应了市场需求，因此，利用外植体组织培养已成为蝴蝶兰快速繁殖的最有效手段。
近年来，国内外有以利用外植体诱导原球茎的研究的报道，但增殖速度和增殖系数都不太理想，而且还存在着技术复杂，容易产生变异，在培养时会发生褐变现象。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的问题，提供一种蝴蝶兰组织培养基及其制备方法，它简化了培养步骤，花梗成活率高，植株变异率低，有效地解决了蝴蝶兰组培过程中植株容易褐化的技术难题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种蝴蝶兰组织培养基，它包括诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基，其特征在于：
所述诱导培养基包括以下组分:1/4ms培养基粉剂1339mg/l、噻重氮苯基脲2～4mg/l、蛋白胨1900～2300mg/l、柠檬酸25～35mg/l、糖25000～35000mg/l、琼脂5500～6500mg/l、6-苄氨基嘌呤2～4mg/l、椰汁80～120mg/l；
所述增殖培养基包括以下组分:花宝1号400～600mg/l、花宝2号1200～1800mg/l、肌醇80～120mg/l、善存片280～320mg/l、蛋白胨900～1100mg/l、西红柿汁16000～20000mg/l、胡萝卜泥16000～20000mg/l、苹果泥16000～20000mg/l、香蕉泥16000～20000mg/l、椰汁80～120mg/l、迷迭香提取物7～9mg/l、聚乙烯吡咯烷酮800～1200mg/l、腺嘌呤0.8～1.2mg/l、6-苄氨基嘌呤0.8～1.2mg/l、萘乙酸0.8～1.2mg/l、糖18000～22000mg/l、琼脂5500～6500mg/l；
所述壮苗培养基包括以下组分:1/2ms培养基粉剂2471mg/l、肌醇80～120mg/l、柠檬酸25～35mg/l、蛋白胨900～1100mg/l、善存片280～320mg/l、西红柿汁16000～20000mg/l、胡萝卜泥16000～20000mg/l、苹果泥16000～20000mg/l、香蕉泥16000～20000mg/l、椰汁80～120mg/l、迷迭香提取物7～9mg/l、聚乙烯吡咯烷酮800～1200mg/l、活性炭800～1200mg/l、糖16000～20000mg/l、琼脂550～650mg/l；
所述生根培养基包括以下组分:1/2ms培养基粉剂2471mg/l、柠檬酸25～35mg/l、蛋白胨900～1100mg/l、水解乳蛋白900～1100mg/l、善存片280～320mg/l、西红柿汁16000～20000mg/l、胡萝卜泥16000～20000mg/l、苹果泥16000～20000mg/l、香蕉泥16000～20000mg/l、椰汁80～120mg/l、迷迭香提取物7～9mg/l、聚乙烯吡咯烷酮800～1200mg/l、活性炭800～1200mg/l、萘乙酸2～4mg/l、吲哚丁酸0.4～0.6mg/l、糖16000～20000mg/l、琼脂5000～7000mg/l。
本发明在上述蝴蝶兰组织培养基配方的基础上，还提供了一种蝴蝶兰组织培养基的制备方法，它包括诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基的制备方法，其特征在于：
所述诱导培养基的制备方法，按配方比例称取噻重氮苯基脲、蛋白胨、柠檬酸、糖、琼脂于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按配方比例加入1/4ms培养基粉剂、6-苄氨基嘌呤、椰汁搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在20个小三角瓶中，用封口膜封紧瓶口，在高温121～126℃，高压0.1～0.14兆帕，灭菌15～20分钟，取出趁热摇匀冷却制得诱导培养基；
所述增殖培养基的制备方法，按配方比例称取花宝1号、花宝2号、肌醇、善存片、蛋白胨、迷迭香提取物、聚乙烯吡咯烷酮、糖、琼脂于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按配方比例加入西红柿汁、胡萝卜泥、苹果泥、香蕉泥、椰汁、腺嘌呤、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在12个蝴蝶兰专用培养瓶中，用胶塞塞紧瓶口，再用封口膜封紧瓶口，在高温121～126℃，高压0.1～0.14兆帕，灭菌15～20分钟，取出趁热摇匀冷却制得增殖培养基；
所述壮苗培养基的制备方法，按配方比例称取肌醇、柠檬酸、蛋白胨、善存片、迷迭香提取物、聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、糖、琼脂、于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按配方比例加入1/2ms培养基粉剂、西红柿汁、胡萝卜泥、苹果泥、香蕉泥、椰汁搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在12个蝴蝶兰专用培养瓶中，用胶塞塞紧瓶口，再用封口膜封紧瓶口，在高温121～126℃，高压0.1～0.14兆帕，灭菌15～20分钟，取出趁热摇匀冷却制得壮苗培养基；
所述生根培养基的制备方法，按配方比例称取柠檬酸、蛋白胨、水解乳蛋白、善存片、迷迭香提取物、聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、糖、琼脂于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按配方比例加入1/2ms培养基粉剂、西红柿汁、胡萝卜泥、苹果泥、香蕉泥、椰汁、萘乙酸、吲哚丁酸搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在12个蝴蝶兰专用培养瓶中，用胶塞塞紧瓶口，再用封口膜封紧瓶口，在高温121～126℃，高压0.1～0.14兆帕，灭菌15～20分钟，取出趁热摇匀冷却制得生根培养基。
所述的1/2ms培养基粉剂在市场上有按标准比例配制好的产品，下面是配制1l1/2ms培养基营养液各成分的用量：硝酸钾kno3950mg、硝酸铵nh4no3825mg、磷酸二氢钾kh2po485mg、硫酸镁mgso4·7h2o185mg、氯化钙cacl2·2h2o220mg、碘化钾ki0.83mg、硼酸h3bo36.2mg、硫酸锰mnso4·4h2o22.3mg、硫酸锌znso4·7h2o8.6mg、钼酸钠na2moo4·2h2o0.25mg、硫酸铜cuso4·5h2o0.025mg、氯化钴cocl2·6h2o0.025mg、乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.25mg、硫酸亚铁feso4·7h2o27.85mg、肌醇100mg、甘氨酸2mg、盐酸硫胺素0.1mg、盐酸吡哆醇0.5mg、烟酸0.5mg。
所述的1/4ms培养基粉剂在市场上有按标准比例配制好的产品，下面是配制1l1/2ms培养基营养液各成分的用量：硝酸钾kno3475mg、硝酸铵nh4no3412.5mg、磷酸二氢钾kh2po442.5mg、硫酸镁mgso4·7h2o92.5mg、氯化钙cacl2·2h2o110mg、碘化钾ki0.83mg、硼酸h3bo36.2mg、硫酸锰mnso4·4h2o22.3mg、硫酸锌znso4·7h2o8.6mg、钼酸钠na2moo4·2h2o0.25mg、硫酸铜cuso4·5h2o0.025mg、氯化钴cocl2·6h2o0.025mg、乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.25mg、硫酸亚铁feso4·7h2o27.85mg、肌醇100mg、甘氨酸2mg、盐酸硫胺素0.1mg、盐酸吡哆醇0.5mg、烟酸0.5mg。
所述的糖最好为蔗糖。
所述的西红柿汁是将西红柿洗净，使用捣碎钵或者组织捣碎机捣碎，过滤掉西红柿皮和种子得到的汁液。
所述迷迭香提取物采用如下方法制备：取干燥迷迭香的茎和叶，粉碎，用40～95%乙醇浸提1～3次，每次1～3小时，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；将浓缩液加水静置沉淀，过滤，取滤液进行超滤膜过滤，将超滤液减压浓缩，干燥，即为迷迭香提取物。迷迭香提取物是一种抗氧化剂，具有杀菌作用，有利于培养基保鲜保质。
所述的善存片为维生素及矿物质类非处方药药品，它含有多种维生素和矿物质元素，用于预防和治疗因维生素与矿物质缺乏所引起的各种疾病。目前国内市场上的善存片有善存多维元素片(29)、善存佳维片、小儿善存片、善存小佳维、善存银片。本发明选用的善存片为善存多维元素片(29)、善存佳维片、小儿善存片、善存小佳维和善存银片中的一种；优选善存多维元素片(29)。
所述的苹果泥是将苹果去皮去核，使用捣碎钵或者组织捣碎机捣碎得到苹果泥。
所述的胡萝卜泥是将胡萝卜洗净去头去尾，使用捣碎钵或者组织捣碎机捣碎得到胡萝卜泥。
所述的香蕉泥是将香蕉去皮，使用捣碎钵或者组织捣碎机捣碎得到香蕉泥。
所述的椰汁是新鲜椰子内部的汁液。
本发明和现有技术相比的优点为：
（1）利用外植体直接接种到诱导培养基中进行丛生芽的诱导，将丛生芽切下接种到增殖培养基中进行继代增殖培养，最后壮苗生根培育出符合移栽标准的组培瓶苗。其优势在于跨越了原球茎阶段，直接从丛生芽长出小苗，简化了培养步骤，降低了生产成本，再生植株变异率低，能很好的保持母株的优良特性。
（2）应用本发明的培养基进行蝴蝶兰组织培养，成活率为94～98%，污染率为2～3%，繁殖系数为8～10倍。
（3）本发明使用了含有天然、合成添加物的培养基对蝴蝶兰组培中常见的褐化问题起到行之有效的抑制作用，形成了一种复合防褐化的方法。具体措施是：采用在外植体消毒中用抗坏血酸和硫代硫酸钠浸泡10分钟；在培养基中添加多酚氧化酶抑制剂柠檬酸、醌类物质吸附剂活性炭和聚乙烯吡咯烷酮；诱导培养基中添加噻重氮苯基脲；增殖、壮苗、生根培养基中添加迷迭香提取物和善存片。较目前使用的蝴蝶兰组培培养基褐化程度低20～30%。
（4）本发明采用的培养基中添加的有机物如椰子汁、水解酪蛋白、蛋白胨、香蕉泥、胡萝卜泥、西红柿汁、苹果泥可提高蝴蝶兰快繁过程中的繁殖系数、促使长出的小苗整齐、健壮，解决现有方法中蝴蝶兰工厂化生产的商品苗生产量低、花期不一致问题，具有极大的现实应用意义。
（5）使用本发明优化后的培养条件，如切取外植体的大小、消毒的过程、时间长短、培养时暗培天数、光照强度、光照时间、温湿度的控制等，可以进一步提高蝴蝶兰外植体的出芽率、增殖率和生根率。
（6）本发明用于蝴蝶兰组培具有激素用量少、繁殖快、数量大、出苗齐、品种纯、成本低、适应性广等优点，可提高市场竞争力，促进蝴蝶兰产业发展。优化后的蝴蝶兰组织培养条件，适用于蝴蝶兰大规模工厂化生产。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1：一种蝴蝶兰组织培养基，它包括诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基；
所述诱导培养基具体配方如下:1/4ms培养基1339mg/l、噻重氮苯基脲3mg/l、蛋白胨2000mg/l、柠檬酸30mg/l、蔗糖30000mg/l、琼脂6000mg/l、6-苄氨基嘌呤3mg/l、椰汁100mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述增殖培养基由以下成分组成:花宝1号500mg/l、花宝2号1500mg/l、肌醇100mg/l、多维元素片(29)300mg/l、蛋白胨1000mg/l、西红柿汁18000mg/l、胡萝卜泥18000mg/l、苹果泥18000mg/l、香蕉泥18000mg/l、椰汁100mg/l、迷迭香提取物8mg/l、聚乙烯吡咯烷酮1000mg/l、腺嘌呤1mg/l、6-苄氨基嘌呤1mg/l、萘乙酸1mg/l、蔗糖20000mg/l、琼脂6000mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述壮苗培养基由以下成分组成:1/2ms培养基2471mg/l、肌醇100mg/l、柠檬酸30mg/l、蛋白胨1000mg/l、多维元素片(29)300mg/l、西红柿汁18000mg/l、胡萝卜泥18000mg/l、苹果泥18000mg/l、香蕉泥18000mg/l、椰汁100mg/l、迷迭香提取物8mg/l、聚乙烯吡咯烷酮1000mg/l、活性炭1000mg/l、蔗糖18000mg/l、琼脂600mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述生根培养基由以下成分组成:1/2ms培养基2471mg/l、柠檬酸30mg/l、蛋白胨1000mg/l、水解乳蛋白1000mg/l、多维元素片(29)300mg/l、西红柿汁18000mg/l、胡萝卜泥18000mg/l、苹果泥18000mg/l、香蕉泥18000mg/l、椰汁100mg/l、迷迭香提取物8mg/l、聚乙烯吡咯烷酮1000mg/l、活性炭1000mg/l、萘乙酸3mg/l、吲哚丁酸0.5mg/l、蔗糖18000mg/l、琼脂6000mg/l、定容至1l所需的蒸馏水。
实施例2：一种蝴蝶兰组织培养基的制备方法，采用实施例1的配方比例，分别按如下步骤和方法制备诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基；
诱导培养基的制备方法，按比例称取噻重氮苯基脲、蛋白胨、柠檬酸、蔗糖、琼脂于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按比例加入1/4ms培养基、6-苄氨基嘌呤、椰汁搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在20个小三角瓶中，用封口膜封紧瓶口，在高温123℃，高压0.12兆帕，灭菌18分钟，取出趁热摇匀冷却制得诱导培养基；
增殖培养基的制备方法，按比例称取花宝1号、花宝2号、肌醇、多维元素片(29)、蛋白胨、迷迭香提取物、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、琼脂于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按比例加入西红柿汁、胡萝卜泥、苹果泥、香蕉泥、椰汁、腺嘌呤、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在12个蝴蝶兰专用培养瓶中，用胶塞塞紧瓶口，再用封口膜封紧瓶口，在高温123℃，高压0.12兆帕，灭菌18分钟，取出趁热摇匀冷却制得增殖培养基；
壮苗培养基的制备方法，按比例称取肌醇、柠檬酸、蛋白胨、多维元素片(29)、迷迭香提取物、聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、蔗糖、琼脂、于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按比例加入1/2ms培养基、西红柿汁、胡萝卜泥、苹果泥、香蕉泥、椰汁搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在12个蝴蝶兰专用培养瓶中，用胶塞塞紧瓶口，再用封口膜封紧瓶口，在高温123℃，高压0.12兆帕，灭菌18分钟，取出趁热摇匀冷却制得壮苗培养基；
生根培养基的制备方法，按比例称取柠檬酸、蛋白胨、水解乳蛋白、多维元素片(29)、迷迭香提取物、聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、蔗糖、琼脂于容器中，加蒸馏水，加热溶解；再按比例加入1/2ms培养基、西红柿汁、胡萝卜泥、苹果泥、香蕉泥、椰汁、萘乙酸、吲哚丁酸搅拌均匀；加蒸馏水定容至1l；然后调ph值为5.8；最后分装在12个蝴蝶兰专用培养瓶中，用胶塞塞紧瓶口，再用封口膜封紧瓶口，在高温123℃，高压0.12兆帕，灭菌18分钟，取出趁热摇匀冷却制得生根培养基。
实施例3：一种蝴蝶兰组织培养基，它包括诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基；
所述诱导培养基具体配方如下:1/4ms培养基1339mg/l、噻重氮苯基脲2mg/l、蛋白胨1950mg/l、柠檬酸30mg/l、蔗糖32000mg/l、琼脂6300mg/l、6-苄氨基嘌呤2mg/l、椰汁120mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述增殖培养基由以下成分组成:花宝1号420mg/l、花宝2号1300mg/l、肌醇120mg/l、多维元素片(29)320mg/l、蛋白胨900mg/l、西红柿汁20000mg/l、胡萝卜泥16000mg/l、苹果泥17000mg/l、香蕉泥19000mg/l、椰汁80mg/l、迷迭香提取物9mg/l、聚乙烯吡咯烷酮900mg/l、腺嘌呤1.2mg/l、6-苄氨基嘌呤0.8mg/l、萘乙酸1.2mg/l、蔗糖19000mg/l、琼脂5800mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述壮苗培养基由以下成分组成:1/2ms培养基2471mg/l、肌醇80mg/l、柠檬酸25mg/l、蛋白胨1100mg/l、多维元素片(29)310mg/l、西红柿汁20000mg/l、胡萝卜泥16000mg/l、苹果泥17000mg/l、香蕉泥19000mg/l、椰汁120mg/l、迷迭香提取物7mg/l、聚乙烯吡咯烷酮900mg/l、活性炭1100mg/l、蔗糖17000mg/l、琼脂580mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述生根培养基由以下成分组成:1/2ms培养基2471mg/l、柠檬酸35mg/l、蛋白胨900mg/l、水解乳蛋白1100mg/l、多维元素片(29)290mg/l、西红柿汁16000mg/l、胡萝卜泥20000mg/l、苹果泥19000mg/l、香蕉泥17000mg/l、椰汁120mg/l、迷迭香提取物7mg/l、聚乙烯吡咯烷酮900mg/l、活性炭1100mg/l、萘乙酸4mg/l、吲哚丁酸0.4mg/l、蔗糖17000mg/l、琼脂5500mg/l、定容至1l所需的蒸馏水。
实施例4：一种蝴蝶兰组织培养基，它包括诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基；
所述诱导培养基具体配方如下:1/4ms培养基1339mg/l、噻重氮苯基脲4mg/l、蛋白胨2100mg/l、柠檬酸25mg/l、蔗糖28000mg/l、琼脂5700mg/l、6-苄氨基嘌呤4mg/l、椰汁80mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述增殖培养基由以下成分组成:花宝1号580mg/l、花宝2号1700mg/l、肌醇80mg/l、多维元素片(29)280mg/l、蛋白胨1100mg/l、西红柿汁16000mg/l、胡萝卜泥20000mg/l、苹果泥19000mg/l、香蕉泥17000mg/l、椰汁120mg/l、迷迭香提取物7mg/l、聚乙烯吡咯烷酮1100mg/l、腺嘌呤0.8mg/l、6-苄氨基嘌呤1.2mg/l、萘乙酸0.8mg/l、蔗糖21000mg/l、琼脂6200mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述壮苗培养基由以下成分组成:1/2ms培养基2471mg/l、肌醇120mg/l、柠檬酸35mg/l、蛋白胨900mg/l、多维元素片(29)290mg/l、西红柿汁16000mg/l、胡萝卜泥20000mg/l、苹果泥19000mg/l、香蕉泥17000mg/l、椰汁80mg/l、迷迭香提取物9mg/l、聚乙烯吡咯烷酮1100mg/l、活性炭900mg/l、蔗糖19000mg/l、琼脂620mg/l、定容至1l所需的蒸馏水；
所述生根培养基由以下成分组成:1/2ms培养基2471mg/l、柠檬酸25mg/l、蛋白胨1100mg/l、水解乳蛋白900mg/l、多维元素片(29)310mg/l、西红柿汁20000mg/l、胡萝卜泥16000mg/l、苹果泥17000mg/l、香蕉泥19000mg/l、椰汁80mg/l、迷迭香提取物9mg/l、聚乙烯吡咯烷酮1100mg/l、活性炭900mg/l、萘乙酸2mg/l、吲哚丁酸0.6mg/l、蔗糖19000mg/l、琼脂6500mg/l、定容至1l所需的蒸馏水。