本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法。
背景技术：
结球甘蓝(brassicaoleraceal.var.capitatal.，2n＝18)简称甘蓝，属十字花科芸薹属甘蓝种，是我国重要的蔬菜作物，在全国各地均有栽培，年栽培面积达到9×105hm2左右。甘蓝的杂种优势比较明显。ogura细胞质雄性不育系的材料表现为母体遗传、花粉败育和雌蕊正常，容易被恢复系材料的显性核恢复基因恢复育性，但无法进行正常的自交分离和进一步种质资源的创新。
结球甘蓝和甘蓝型油菜都是十字花科中的重要栽培作物，该油菜材料又为恢复系材料，结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交，大大促进两种作物间的优异基因交流，将油菜的恢复系基因转到结球甘蓝雄性不育系材料上，恢复甘蓝的育性，为甘蓝的遗传育种与种质资源的创新奠定了基础。但两者由于受精后杂种胚、胚乳和子房之间缺乏协调性，导致幼胚不发育或中途停止发育，是远缘杂交育种工作的瓶颈。
在十字花科蔬菜育种过程中胚挽救技术虽有一些报道。例如：diederichsen.采用远缘杂交结合胚挽救技术获得了西兰花与大白菜杂交的f1代，连续回交之后将a基因组cr基因转移到c基因组中。snowdon等将抗黑胫病基因从白芥转移到了甘蓝型油菜；胡大为等以黑芥为母本、诸葛菜为父本的正交组合获得了1株真杂种；李俊等以白菜和芥蓝进行正反杂交，研究结果显示，白菜×芥蓝的平均杂种获得率(2.32％)；但到目前为止，国内外几乎没有利用幼胚挽救离体培养技术实现亲缘关系相对较远的十字花科结球甘蓝与甘蓝型油菜种间杂交并获得杂交后代植株的案例，而且培养周期长、技术复杂。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，克服甘蓝与甘蓝型油菜栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种植株的问题，将油菜的优良恢复基因转入结球甘蓝胞质雄性不育栽培种中，恢复甘蓝的育性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，包括以下步骤：
1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；
2)剪取步骤1)所述人工授粉后15～18d的子房，消毒后得消毒子房；
3)剥离步骤2)所述消毒子房的胚珠接种于诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述诱导培养基以ms为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/l的ga、0.1～0.5mg/l的naa、25～35g/l的蔗糖、6～10g/l的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，ph值为5.5～6.5；
4)将步骤3)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得f1代幼苗；所述分化培养基以ms为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/l的6-ba、20～35g/l的蔗糖和6～10g/l的琼脂，ph值为5.8；
5)分离步骤4)所述f1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以ms为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/l的naa、20～35g/l的蔗糖和6～8g/l的琼脂，ph值为5.8。
优选的，步骤1)所述母本为秦甘58，父本为rfo-46。
优选的，步骤1)所述人工授粉，包括：杂交前2～3d摘除母本已开放的花朵，对未开放花朵挂牌并套袋隔离；取套袋父本开花当天花药，对母本花蕾进行剥蕾授粉，授粉后套袋隔离。
优选的，步骤2)所述消毒，包括乙醇浸泡10～50s后升汞消毒10～30min。
优选的，步骤3)所述诱导培养的条件包括：温度22～26℃，光照强度1100～2000lux，光照10～14h/d。
优选的，步骤4)所述分化培养的条件包括：26～30℃，光照强度1100～2000lux，光照10～14h/d。
优选的，步骤5)所述生根培养的条件包括：25～27℃，光照强度1500～2000lux，光照10～12h/d。
优选的，步骤5)得到所述完整杂交苗后，还包括炼苗、移栽。
优选的，所述炼苗的方法包括将所述完整杂交苗置于室内自然光下培养1～4d。
优选的，所述移栽的基质包括体积比为(4～8):1:(1～5)的泥炭、珍珠岩和硅石。
本发明提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，利用胚挽救的方式克服了结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交时由于染色体数目、结构不对等，受精后杂种胚、胚乳和子房之间缺乏协调性，导致幼胚不发育或中途停止发育无法获得杂一代植株的问题，同时甘蓝型油菜含有恢复系基因，将其转到结球甘蓝雄性不育材料上，恢复结球甘蓝的育性；选择授粉15～18d的幼胚培养，可大大提高出胚率，获得92.73％的杂种后代。
附图说明
图1为添加杂交授粉套袋隔离图；
图2为胚珠离体诱导直接萌发成幼苗图；
图3为亲本与杂交种f1代植株叶型对比图，其中3-1-1、3-1-2为结球甘蓝，3-2-1、3-2-2为杂交种f1代，3-3-1、3-3-2为甘蓝型油菜；
图4为花朵对比图，4-1为结球甘蓝，4-2为杂交种f1代，4-3为甘蓝型油菜；
图5为亲本与杂交种f1代植株的流式细胞仪检测结果图，其中a为结球甘蓝，b为甘蓝型油菜，c为杂交种f1代；
图6为亲本与杂种植物的ssr标记鉴定电泳图，其中m1、m2为dnamarker，1～4为结球甘蓝，5～7为甘蓝型油菜，8～35为杂交种f1代。
具体实施方式
本发明提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，包括以下步骤：
1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；
2)剪取步骤1)所述人工授粉后15～18d的子房，消毒后得消毒子房；
3)剥离步骤2)所述消毒子房的胚珠接种于诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述诱导培养基以ms为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/l的ga、0.1～0.5mg/l的naa、25～35g/l的蔗糖、6～10g/l的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，ph值为5.5～6.5；
4)将步骤3)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得f1代幼苗；所述分化培养基以ms为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/l的6-ba、20～35g/l的蔗糖和6～10g/l的琼脂，ph值为5.8；
5)分离步骤4)所述f1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以ms为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/l的naa、20～35g/l的蔗糖和6～8g/l的琼脂，ph值为5.8。
本发明选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离。在本发明中，所述结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种优选的为结球甘蓝ogura胞质雄性不育系栽培种，更优选的为秦甘58(2n＝2x＝18)。本发明对母本甘蓝雄性不育系材料的来源没有特殊限定，优选来源于西北农林科技大学园艺学院种子库，公众可以得到。本发明对父本甘蓝型油菜恢复系栽培种的品种及来源没有特殊限定，优选来源于陕西省杂交油菜研究中心种子库，公众可以得到。本发明所述人工授粉，优选的包括：杂交前2～3d摘除母本已开放的花朵，对未开放母本花朵挂牌并套袋隔离；取套袋父本开花当天花药，对母本花蕾进行剥蕾授粉，授粉后套袋隔离。本发明所述杂交优选的在初花期进行，摘除母本已开放的花朵，可最大限度隔绝授粉对杂交的影响。本发明所述授粉时优选的对母本4mm左右的花蕾进行剥蕾授粉，授粉后套袋隔离，可严格控制父本以外的花粉污染，本发明对所述套袋的方法没有特殊限定，授粉套袋后效果如图1所示。
授粉完成后，本发明剪取所述人工授粉后15～18d的子房，消毒后得消毒子房。在本发明中，所述子房的获取时间优选的为9～18d，更优选的为15～18d，最优选的为17d。在本发明中，所述消毒优选的包括乙醇浸泡10～50s后升汞消毒10～30min。在本发明中，所述乙醇优选的为体积浓度为60～75％的乙醇，更优选的为65～72％，最优选的为70％。在本发明中，所述乙醇浸泡的时间优选的为15～40s，更优选的为20～35s，最优选的为30s。本发明所述升汞优选的为质量浓度0.02～0.5％的hgcl2，更优选的为0.06～0.2％的hgcl2，最优选的为0.1％的hgcl2。在本发明中，所述升汞消毒的时间优选的为12～25min，更优选的为14～20min，最优选的为15min。本发明所述浓度乙醇浸泡可保护幼胚不被伤害，所述升汞消毒可大大减少接种幼胚后期免受细菌侵染，提高幼胚成活率。
本发明所述消毒后优选的还包括用无菌水冲洗子房，所述冲洗的次数优选为3～5次，更优选的为4次，所述冲洗的时间优选的为每次3～8min，更优选的为每次4～6min，最优选的为每次5min。
得消毒子房后，本发明剥离所述消毒子房的胚珠接种于诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠。本发明对所述剥离的方法没有特殊限定，优选的将所述子房置于无菌滤纸上剥离。本发明所述诱导培养基以ms为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/l的ga、0.1～0.5mg/l的naa、25～35g/l的蔗糖、6～10g/l的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，ph值为5.5～6.5；在本发明中，添加适宜浓度ga解除了细胞核中-淀粉酶的抑制剂，促进幼胚萌发；所述ga的含量优选的为0.1～0.5mg/l，更优选的为0.1～0.3mg/l，最优选的为0.1mg/l；低浓度的naa促进子房膨大、刺激细胞分裂和组织分化的同时还促进植物生根；所述naa的含量优选的为0.1～0.5mg/l，更优选的为0.1～0.3mg/l，最优选的为0.1mg/l。离体组织培养中种胚缺乏自养能力，需要外源碳源蔗糖提供其生长发育所需的碳骨架和能量，同时维持培养基的渗透压；所述蔗糖的含量优选的为26～32g/l，更优选的为30g/l；添加适宜浓度的琼脂促进培养基在常温下固化形成固体培养基；所述琼脂的含量优选的为7～9g/l，更优选的为8g/l。添加合适的活性炭和水解酪蛋白对种胚萌发过程中释放的抑制剂等有吸附作用，促进幼胚萌发；所述活性炭的质量浓度优选的为0.3～0.8％，更优选的为0.4～0.6％，最优选的为0.5％；所述水解酪蛋白的质量浓度优选的为0.4～1％，更优选的为0.45～0.6％，更优选的为0.5％。本发明对所述诱导培养基的各组分来源没有特殊限定。
本发明所述诱导培养的温度优选的为22～26℃，更优选的为23～25℃，最优选的为24℃。在本发明中，所述诱导培养优选在光暗交替环境中培养，所述诱导培养的光照强度优选的为1100～2000lux，更优选的为1200～1800lux，最优选的为1500lux。在本发明中，所述诱导培养的光照时间优选的为10～14h/d，更优选的为11～13h/d，最优选的为12h/d；所述诱导培养的时间优选的为9～11d，最优选的为10d，萌发的胚珠如图2-1所示。
得到萌发的胚珠后，本发明将所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得f1代幼苗；所述分化培养基优选的以ms为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/l的6-ba、20～35g/l的蔗糖和6～10g/l的琼脂，ph值为5.8。在本发明中，添加适宜浓度的6-ba促进细胞分离和组织分化，促进茎、叶、根的伸长生长；所述6-ba的含量优选的为0.3～0.7mg/l，更优选的为
0.4～0.6mg/l，最优选的为0.5mg/l。离体幼胚缺乏自养能力，添加蔗糖为其提供生长所需的能量物质，维持培养基的渗透压；所述分化培养基中蔗糖的含量优选的为优选的为25～32g/l，更优选的为38～31g/l，最优选的为30g/l；添加一定量的琼脂促进培养基固化形成固体培养基；所述分化培养基中琼脂的含量优选的为7～9g/l，更优选的为8g/l。本发明对所述分化培养基的各组分来源没有特殊限定。
本发明所述分化培养的温度优选的为26～30℃，更优选的为27～29℃，最优选的为28℃。在本发明中，所述分化培养的光照强度优选的为1100～2000lux，更优选的为1200～1800lux，最优选的为1500lux。在本发明中，所述分化培养的光照时间优选的为10～14h/d，更优选的为11～13h/d，最优选的为12h/d。在本发明中，所述分化培养的时间优选的为7～14d，更优选的为10～13d，最优选的为12d，得到的f1代幼苗如图2-2所示。
得到f1代幼苗后，本发明分离所述f1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以ms为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/l的naa、20～35g/l的蔗糖和6～8g/l的琼脂，ph值为5.8。在本发明中，所述侧芽的分离优选的在无菌条件下进行，分离时从分化培养基中取出f1代幼苗，把幼苗新生出来的侧芽保留生长点与母体分开，将分出的侧芽置于生根培养基中培养6～14d，直至形成完整的杂交苗。
在本发明的所述生根培养基中，所述naa的含量优选的为0.08～0.12mg/l，更优选的为0.09～0.11mg/l，最优选的为0.1mg/l；所述蔗糖的含量优选的为22～34g/l，更优选的为28～32g/l，最优选的为30g/l；所述琼脂的含量优选的为8g/l。在本发明中，所述生根培养基还具有一定的扩繁作用。本发明所述生根培养的温度25～27℃，所述生根培养的光照1500～2000lux，所述生根培养的时间优选的为6～14d，更优选的为7～10d，最优选的为8d。
得到完整杂交苗后，本发明优选的还包括炼苗、移栽。所述炼苗的方法优选的包括：将所述完整杂交苗置于室内自然光下培养1～4d，更优选的为培养1.5～3d，最优选的为培养2d。
炼苗完成后，本发明在移栽前，优选的洗净所述炼苗后的杂交苗上的培养基，再蘸取多菌灵溶液，所述多菌灵溶液的浓度优选的为0.3％，所述蘸取的时间优选的为7～10s，本发明对所述多菌灵的来源没有特殊限定。
本发明所述移栽用的基质优选的包括体积比为(4～8):1:(1～5)的泥炭、珍珠岩和硅石，更优选的比为(5～7)：1：(2～4)，最优选的比为6:1:3。在本发明中，所述移栽的培养温度优选的为26～30℃，更优选的为27～29℃，最优选的为28℃。在本发明中，所述移栽的培养湿度优选的为50～90％，更优选的为60～80％，最优选的为70％。在本发明中，所述移栽的培养时间优选的为10～20d，更优选的为12～18d，最优选的为15d。
本发明所述移栽培养完成后即可大田种植，所述种植时优选的带基质种植。
下面结合实施例对本发明提供的结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
母本选用结球甘蓝ogura胞质雄性不育系栽培种秦甘58(2n＝2x＝18)，父本选用油菜优良恢复系栽培种(2n＝4x＝38)；精选无病饱满的父母本种子以备种植，常规管理；
在初花期于杂交前3d摘除母本花序上已开放的花朵，对未开放花朵挂牌并套袋隔离，在套袋父本开花当天取花药，同时对母本植株上4mm的花蕾进行剥蕾授粉；
剪取授粉后16d的子房，用70％乙醇浸泡30s，再用0.1％hgcl2消毒15min，然后用无菌水冲洗4次，每次5min；
将消毒子房，在无菌条件下于无菌滤纸上剥出幼胚接种至胚珠诱导固体培养基上培养10d；
将萌发的幼胚接种到分化培养基中，在温度28℃、光照强度1500lux、光照12h/d培养条件下直至幼胚发育成杂交种f1代幼苗；
无菌条件下，从分化培养基中取出杂交种f1代幼苗，把幼苗新生出来的侧芽保留生长点与母体分开，将分出来的侧芽置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种植株进行扩繁，直至诱导生根形成完整的杂种植株；
完整的杂种植株在室内自然光下炼苗，取出植株并洗净附着在其表面的培养基，再蘸取配置好的多菌灵溶液，将其移栽到泥炭：珍珠岩：蛙石为6：1：3的穴盘中，置于温度28℃、相对湿度70％的环境下，培养15d后带土移栽，下地种植，种植成活后叶片如图3所示。
实施例2
母本选用结球甘蓝ogura胞质雄性不育系栽培种秦甘68(2n＝2x＝18)，父本选用油菜优良恢复系栽培种rfo-46(2n＝4x＝38)；精选无病饱满的父母本种子以备种植，常规管理；
在初花期于杂交前2d摘除母本花序上已开放的花朵，对未开放花朵挂牌并套袋隔离，在套袋父本开花当天取花药，同时对母本植株上4mm的花蕾进行剥蕾授粉；
剪取授粉后15～18d的子房，用70％乙醇浸泡30s，再用0.1％hgcl2消毒15min，然后用无菌水冲洗4次，每次5min；
将消毒子房，在无菌条件下于无菌滤纸上剥出幼胚接种至胚珠诱导固体培养基上培养10d；
将萌发的幼胚接种到分化培养基中，在温度28℃、光照强度1500lux、光照12h/d培养条件下直至幼胚发育成杂交种f1代幼苗；
无菌条件下，从分化培养基中取出杂交种f1代幼苗，把幼苗新生出来的侧芽保留生长点与母体分开，将分出来的侧芽置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种植株进行扩繁，直至诱导生根形成完整的杂种植株；
完整的杂种植株在室内自然光下炼苗，取出植株并洗净附着在其表面的培养基，再蘸取配置好的多菌灵溶液，将其移栽到泥炭：珍珠岩：蛙石为6：1：3的穴盘中，置于温度28℃、相对湿度70％的环境下，培养15d后带土移栽，下地种植。
实验例
对实施例1及实施例2共得到的55株杂交植株进行杂交验证：
(1)细胞学鉴定：用sysmexcyflowcube8流式细胞仪对杂交后代进行倍性鉴定。
配置溶液：溶液i是柠檬酸4.2g，0.5％吐温20，定容至200ml，4℃下保存备用；溶液ii是磷酸二氢钠28.65g，pi20mg，定容至200ml。
取20mg洗净去除中脉的亲本及杂交种f1代幼苗的新叶置于塑料培养皿中，用双面刀片将叶片切碎，用1ml移液枪吸取切好的样品经350目尼龙筛网过滤到1.5ml的eppendorf管中，加入新鲜的i溶液400μl悬浮沉淀，用流式细胞仪测样时再向样品中加入800μl溶液ii，根据亲本峰值对应的荧光强度横坐标位置来判断杂交种f1代植株的倍性，结果如图4所示，以甘蓝(2c)为标准，g1期荧光强峰值位于180位置，甘蓝型油菜g1期荧光强峰值位于320位置，杂种单株g1期荧光强度峰值对应的位置位于两亲本荧光峰值位置之间，峰值位置近双亲峰值位置的平均值250，推测51株f1代杂种植株为三倍体植株，符合aac染色体组成；其余4株假杂种的荧光峰值位置均位于甘蓝亲本位置。
(2)分子鉴定：分别提取母本结球甘蓝雄性不育系栽培种、父本油菜优良恢复系栽培种以及杂交种f1代植株材料的基因组dna，将其分别作为模板，ssr引物boe-134引物序列为boe134-f：5’-ctcttatttcttgtagggctttta-3’，boe134-r：5’-ccgttggagatgactgactg-3’进行pcr反应：pcr反应体系：100ng/μldna模板1μl，10×buffer1μl，mg2+为0.8μl，dntp(2.5mmol/l)0.8μl，上下游引物(10μmol/l)各0.4μl，taqdna酶(5u/μl)0.1μl，加无菌超纯水5.5μl至反应体积为10μl；将上述成分混合离心，pcr扩增仪上扩增，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，合适退火温度30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸7min，对反应产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，凝胶成像仪上观察照相并标记，结果如图5所示。根据在杂种植株的凝胶电泳带型上有无亲本的特异扩增条带，在早期鉴定杂种植株是否为真杂种，若f1代植株的电泳条带上均有父母本的特异性扩增条带，则可判断其为真杂种，若无则为假杂种。
结果显示，杂交种f1代植株有51株带型上均扩增到了父母本的特异性条带，鉴定结果表明其为真杂种，其余4株为假杂种。与此同时还扩增到了父母本特异性条带以外的条带，这正是远缘杂交种同近缘杂交种相比，除了具有双亲的遗传特性产生基因重组的同时还会产生新的基因型。
(3)经过细胞学鉴定和分子鉴定的51株杂交种f1代植株，经过种植后，形态如图4所示，均介于父母本之间，生长旺盛，叶基部纵向排列2～3对翅状小叶，叶色呈现黄绿色，叶表部蜡粉较少，叶表和叶背都有刺毛，叶缘有锯齿，叶脉多且明显，有叶耳、叶裂，后代出现性状分离。花朵大小、形状介于双亲之间。整体偏像父本甘蓝型油菜，呈超亲优势。
由以上实施例可知，本发明提供的一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，解决了亲缘关系较远的甘蓝型油菜与甘蓝胞质雄性不育系在进行远缘杂交时的解释绿地，杂种胚败育，难以获得杂交种f1代植株等问题，且杂种率达92.73％，并且还可以产生新的基因型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。