本发明涉及食用菌培育领域，具体涉及一种高温型香菇l16的杂交育种工艺。
背景技术：
香菇lentinulaedodes(berk.)pegler.又名香蕈、香菰、花菇、冬菇、花冬菇、明花、天白花菇、暗花、茶花、椎茸、香信、板栗菇、椎菇等[1,2]，是中国传统的著名食用菌并最早人工驯化栽培。香菇l808中大型，形态好，肉厚，质地致密，耐贮运。自2009年起成为华北地区香菇主栽品种，并逐渐向其它地区扩散，成为各主产区主栽品种。但l808也有明显的缺点：菌丝不耐高温，菌棒越夏期间容易烧菌，导致烂棒。
技术实现要素：
本发明提供了一种高温型香菇l16的杂交育种工艺，本试验用香菇l808单孢杂交育种方式选育出一株新菌株，取亲本l808之l及各位数字之和命名为香菇l16，既具有亲本的优良性状，又一定程度上提高其菌丝抗高温能力，选育出的香菇菌株主要栽培特性及产量与亲本相当，菌丝耐高温能力优于亲本。示范推广表明，选育出的香菇菌株适合多种气候条件，可以夏季反季节出菇，适应区域广，品质好，产量高。
本发明的技术方案如下：
一种高温型香菇l16的杂交育种工艺，包括以下步骤：
（1）亲本选择：从香菇l808中选择生长健壮，菌肉厚，形态完整，7分成熟的子实体作为亲本；
（2）单孢分离：亲本采后立即于无菌条件下孢子印法收集孢子；
（3）单核体菌丝确认：将孢子放入无菌水中，稀释至一定浓度，用接种环醮取孢子液涂于平板培养基上，将培养皿密封，避光培养，待出现众多直径3mm～6mm菌落时，从每独立菌落挑取一小块菌丝于斜面培养基中央培养，挑取菌丝体生长最快的，即将长满斜面时对各菌落镜检，挑出单核体菌丝；
（4）配对杂交组合：选取菌丝形态、色泽、生长速度各异的偶数个单核体菌丝于斜面培养基上进行交互配对，待两菌落接触后挑取交接处菌株块于斜面培养基中央培养，3d、13d后分别测量菌丝两生长端之间的距离，对生长速度大于等于4.0mm/d的进行镜检，小于4.0mm/d的淘汰，镜检后有锁状联合的移植扩大繁殖；
（5）初步筛选：将选出的菌株进行示范栽培，选出菌盖大朵、菌肉厚、菌柄短、质地硬的菌株；
（6）区别性鉴定：将选出的菌株与亲本进行耐高温试验及拮抗试验，选出耐高温的香菇菌株,命名为香菇l16。
作为优选的技术方案：将初步筛选出的菌株进行二次筛选，以优中选优。
本发明的优点在于：采用本发明选育的菌株既具有亲本的优良性状，又一定程度上提高其菌丝抗高温能力，选育出的香菇菌株主要栽培特性及产量还与亲本相当，菌丝耐高温能力优于亲本。示范推广表明，选育出的香菇菌株适合多种气候条件，可以夏季反季节出菇，适应区域广，品质好，产量高。
附图说明
图1为本发明选出的l16型菌株与亲本l808做拮抗反应的正面示意图。
图2为本发明选出的l16型菌株与亲本l808做拮抗反应的反面示意图。
具体实施方式
一种高温型香菇l16的杂交育种工艺，包括以下步骤：
（1）亲本选择：从香菇l808中选择生长健壮，菌肉厚，形态完整，7分成熟的子实体作为亲本。
（2）单孢分离：亲本采后立即于无菌条件下孢子印法收集孢子。
（3）单核体菌丝确认：将孢子放入无菌水中，稀释至一定浓度，用接种环醮取孢子液涂于平板培养基上，将培养皿密封，于22℃～25℃避光培养，待出现众多直径3mm～6mm菌落时，从每独立菌落挑取一小块菌丝于斜面培养基中央，25℃培养，挑取菌丝体生长最快的，即将长满斜面时对各菌落镜检，挑出单核体菌丝。
（4）配对杂交组合：选取菌丝形态、色泽、生长速度各异的偶数个单核体菌丝于斜面培养基上进行交互配对，待两菌落接触后挑取交接处菌株块于斜面培养基中央，25℃培养，3d、13d后分别测量菌丝两生长端之间的距离，对生长速度大于等于4.0mm/d的进行镜检，小于4.0mm/d的淘汰，镜检后有锁状联合的移植扩大繁殖。
（5）初步筛选：将选出的菌株进行示范栽培，选出菌盖大朵、菌肉厚、菌柄短、质地硬的菌株。
（6）区别性鉴定：将选出的菌株与亲本进行耐高温试验及拮抗试验，选出高温型的香菇菌株l16。
作为优选的技术方案：将初步筛选出的菌株进行二次筛选。初步筛选具有不确定的因素，进行二次筛选是为了减少偶然性对试验结果的影响，全面考察各试验菌株的性状，确保选中的菌株最优秀。
具体实施方法：
1.从香菇l808中选择生长健壮，菌肉厚，形态完整，7分成熟的子实体作亲本。亲本采后立即于无菌条件下孢子印法收集孢子。14.5h后取适量担孢子放入无菌水中，稀释至一定浓度，用接种环醮取孢子液涂于平板培养基上，将培养皿密封，于24℃避光培养。待出现众多直径3mm～6mm菌落时，每独立菌落挑取一小块菌丝于斜面培养基中央，25℃培养。待挑取菌丝体生长最快的即将长满斜面时对各菌落镜检，挑出单核体菌丝。
2.选取菌丝形态、色泽、生长速度各异的16个单核体菌丝于斜面培养基上进行交互配对，两菌种块相距20mm，共120个组合。两菌落接触后挑取交接处菌种块于斜面培养基中央，25℃培养。3d、13d后分别测量菌丝两生长端之间的距离，生长速度大于等于4.0mm/d的进行镜检，小于4.0mm/d的淘汰。镜检后有锁状联合的移植扩大繁殖。
3.初步筛选：将所有选出的杂交菌株每个菌株分为3组，每组10棒，做重复实验，亲本作对照。每棒重量2175g±25g，三层无纺布封口，108℃～110℃蒸汽灭菌5h，种源为原种，每棒3个接种口，套袋，接种后14d剥去套袋。培养条件：菌温25℃，避光，co2浓度≦0.3%，相对湿度60%～70%。记录菌丝长满菌棒需要的天数，所有菌棒长满后，白天给予300lx光照，其它培养条件不变。瘤状物较多时用6.67cm铁钉刺孔增氧，每棒54个孔，刺孔后10d内保持相对湿度90%～95%。培养120d后搬至菇棚，再7天脱袋出菇。每潮菇出完养菌15d后注水。菇棚环境条件：全出菇期温度5℃以上，26℃以下，晴天日夜温差约10℃；湿度80%～90%；光照100lx～300lx；co2浓度≦0.1%。选出选出菌盖大朵、菌肉厚、菌柄短、质地硬的菌株。
4.二次筛选：初筛选出4个菌株进行复筛，每个菌株分为3组，每组30棒，做重复实验，亲本作对照，按初步筛选的方法进行。
5.区别性鉴定：选出的菌株与亲本进行耐高温试验及拮抗试验。耐高温试验：25℃条件下培养14d的斜面菌种于40℃条件下放置1h、3h、5h、7h、9h后，于25℃条件下培养2d，每处理移接5支试管，观察能否萌发。
6.中间试验：将最终选出的香菇l16菌株1000棒，按复筛的方法进行中间试验。
7.龙岩市新罗区绿态食用菌专业合作社示范推广香菇l16菌株20万袋，每袋干料980g～1000g，按花菇高棚层架培育方法。
结果与分析
单核体菌丝确认：共挑取56个独立菌落，经镜检确认有51个单核体菌丝。另5个有锁状联合或无，由两个能亲合的单核体菌丝发生交配或两个不能亲合的单核体菌丝混杂在一起。单核体菌丝粗细不一；有的生长端整齐，有的不整齐；颜色有白，灰白，淡黄；生长速度差异大，0.25mm/d～0.99mm/d有7株；1.00mm/d～1.99mm/d有15株；2.00mm/d～2.99mm/d有23株；3.00mm/d～3.14mm/d有6株。
配对杂交组合：配对杂交组合中生长速度大于等于4.0mm/d的有18个，经镜检其中13个有锁状联合，另5个没有锁状联合。香菇为双因子四极性，品种内单核体菌丝间亲合概率为1/4，本试验只获得13个杂交菌株有两方面原因：入试单核体菌丝极性分布不均匀，两个不亲合极性的单核体菌丝较多，而另两个极性的单核体菌丝较少；有的杂交菌株生长速度小于4.0mm/d。
小试初筛：如表1，13个杂交菌株栽培性状分化明显，3个菌株能扭结原基，但原基不能分化成子实体，表明菌棒远未达到生理成熟，为超晚熟菌株；06、09两菌株有少部分原基不能分化成子实体，菌棒未达完全生理成熟；其它菌株原基都能正常分化成子实体，菌棒已达完全生理成熟；各菌株菌盖圆整。
表1小试初筛菌株栽培表现
小试复筛：如表2，各菌株与初筛时表现一致，11号菌株明显优于其它菌株，取亲本l808之l及各位数字之和命名为香菇l16。
表2复筛菌株栽培表现
区别性鉴定：选出高温型的香菇菌株，其菌丝体及子实体均比亲本耐高温，菌棒越夏安全性好于亲本，夏季出菇也好于亲本。如表3，可知l16比亲本明显耐高温。由图1和图2可知，l16与亲本l808之间有一定的拮抗反应。两者在生理特性及遗传特性上有明显差异。
表3香菇l16菌丝与亲本耐高温对比
中间试验：采收香菇819.37kg，平均每袋产量819g。子实体形态好，菌肉厚，质地致密。
示范推广：采收香菇103419kg，平均每袋产量517g，生物学效率≥51.7%。子实体形态好，菌肉厚，质地致密；菌棒越夏安全性好。
小结
本方案在我所进行的部分都是人工控制环境条件的培养，香菇l16的耐高温优势与亲本相比显现不出来。从示范推广的结果看，由于是自然气候培养，经越夏管理的，两者差异就很大，海拔越低，差异越大。相同条件下，香菇l16比l808越夏安全性好，表现为前者正常出菇，后者常常第一潮爆发性出菇，菇多、小、质量差，随后菌棒解体。香菇l16也可以反季节栽培。
在杂交过程中发现同一极性的单核体菌丝在形态、生长速度上有差异，这表明杂交后代的性状分离明显，同时也意味着在香菇单孢杂交育种中，应选择形态好、生长端整齐、生长速度较快的单核体菌丝进行配对。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。