本发明属于小麦育种技术领域，涉及一种小麦三位点表达hmw-gs数目变异全套近等基因系的创制方法。
背景技术：
小麦种子贮藏蛋白包括：高分子量谷蛋白(highmolecularweightgluteninsubunits，hmw-gs)、低分子量谷蛋白和醇溶蛋白三种。小麦hmw-gs仅占成熟种子蛋白的10％左右，在面粉加水形成面团的揉混过程中，其通过分子间或分子内二硫键结合形成谷蛋白聚合体，这种网络状的“骨架”结构在小麦面筋形成过程中具有重要作用(shewryandhalford2002；shewryetal.2003；yangetal.2014；wieserandkieffer.2001)。因此，小麦hmw-gs的数量和质量是影响小麦加工品质的重要因素。
普通小麦的hmw-gs基因位于第1同源群染色体长臂上，编码这类蛋白的基因位点统称为glu-1,其对应于a、b和d基因组的基因位点分别为glu-a1、glu-b1和glu-d1，每1位点内有2个紧密连锁的基因，分别编码分子量较大的x和较小的y亚基且为共显性遗传(shewryetal.1992，2003；rasheedetal.2014)。普通小麦的3个hmw-gs基因位点在理论上可表达6个亚基，但因部分基因沉默而仅表达3-5个亚基(shewryetal.1992，2003)。这3-5个亚基可由glu-a1,glu-b1和glu-d13个位点上每个表达1-2个hmw-gs，也称3位点表达型；也可由其中2个位点表达(通常为glu-b1和glu-d1表达1-2个,而glu-a1表达0个)，也称2位点表达型。
近等基因系(near-isogenicline，nil)是指除目标性状基因不同，而其他遗传背景完全相同的一组遗传材料(品系)，是研究单个基因(对)遗传效应的理想研究材料。构建小麦近等基因系的方法主要有：多代回交转育法、基于目标性状位点杂合个体自交法(tuinstraetal.1997)以及从突变体中分离等(李希锋和董娜2012)。小麦加工品质受多个品质基因编码的多种蛋白共同影响，小麦hmw-gs近等基因系是研究hmw-gs组成和数目变化导致加工品质发生变异的理想研究材料。目前，绝大多数小麦hmw-gs近等基因系都是通过杂交并多代回交转育方式创制。如，采用这种方法分别构建了遗传背景sicco的1dxnull,1dynull和1bynull(rogersetal.1991)、龙辐麦19glu-a1的1和2*(刘伟等,2005)、龙辐麦3号glu-a1的null和1、龙97-586glu-b1的7和7+8(张莉丽等,2007,2009)、龙麦20glu-b1的7+8和7+8*分别与17+18(高丹丹等.2008；张延滨等.2008)、小偃54glu-b1的14+18和14+15(庞斌双等，2007)以及hd2329为背景的涉及glu-a1的1和null,glu-b1的7+8,7+8*,17+18和20以及glu-d1的5+10和2.2等(goeletal.2015,2017)以及西农1718背景的ax1与null,西农2208背景的dx2亚基缺失与不缺失(gaoetal.2018)等多个hmw-gs近等基因系。应用hmw-gs全缺失突变体，利用回交并结合分子标记技术，构建了glu-1位点近等渗入系(张星星等,2016)。也有从突变体中选育小麦hmw-gs近等基因系的报道。如，在小麦冀92-3235的无性系变异材料中发现了glu-d12+12亚基缺失体，从而选育了glu-d12+12和null亚基的近等基因系(温之雨等,2003)。
综上所述，现有创制小麦hmw-gs近等基因系的方法主要采用杂交后并多次回交转育，其在创制hmw-gs组成不同，数目变化不大(一般为1个或1对亚基的差异)的4个以下近等基因系具有优势，但这种方法由于需要多代回交，也存在纯合稳定时间相对偏长，不能快速获得目标近等基因系。
为了快速获得hmw-gs组成有差异，同时数目上梯度变化(可在3个glu-1位点的5或4个hmw-gs有差异，即0-4/5个变化)的全套近等基因系(最少4个，可多达8个)，本发明应用3个glu-1位点表达0个hmw-gs的普通小麦作母本，而在3个基因组的glu-1位点上表达3-5个hmw-gs的普通小麦为父本，通过1次杂交，并在后代通过生化标记连续选择3位点hmw-gs基因杂合型单株连续多代自交和选择,获得了在hmw-gs基因组成和表达数目上都有很大差异的全套小麦hmw-gs近等基因系。
技术实现要素：
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种小麦三位点表达的hmw-gs数目变异全套近等基因系的创制方法，仅通过一次杂交，结合应用生化标记鉴定后代hmw-gs组成选择后代自交，鉴定获得一套表达不同数目(0-4或5)hmw-gs小麦近等基因系。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种小麦三位点表达的hmw-gs数目变异全套近等基因系的创制方法，包括以下操作：
1)以a、b和d3个基因组glu-1位点所有hmw-gs均不表达的小麦为母本，以glu-a1,glu-b1和glu-d13个glu-1位点均表达、表达数目为3-5个hmw-gs的小麦为父本，进行杂交得到f1种子；
2)将f1种子分单粒种植于大田，开花前套袋自交，然后分别收获单株f2种子，选取其中两株种子数100粒以上的f2种子用于sds-page鉴定hmw-gs组成，在所选的每个单株中选择hmw-gs组成与原父本hmw-gs蛋白表现型相同的所有含胚大半粒种子继续种植，其余舍掉；
3)将选中的f2种子分单粒种植成f3株系，开花前套袋自交，单株收获f3种子；
4)每个f3单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成；选择单株内a、b和d3个基因组的glu-1位点hmw-gs都在分离的单株为目标单株，目标单株内所有种子分单粒鉴定hmw-gs组成，选择与原父本具有相同hmw-gs蛋白组成的所有单粒种子继续种植；
5)重复步骤4)的自交步骤从f4到f5,从f5的目标单株中鉴定所有种子的组成，并按hmw-gs表现型进行归类种植，在f6代鉴定出hmw-gs基因型纯合稳定的全套近等基因系。
f3单株中的目标单株的选择及种植为：
若f3单株在a、b和d三个基因组glu-1位点上均出现hmw-gs有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在任意1个glu-1位点上hmw-gs组成在10粒种子间表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本hmw-gs蛋白表现型相同的全部种子，分单粒种植成f4株系，开花前套袋自交，分单株收获f4种子。
f4、f5单株中的目标单株的选择及种植为：
每个f4单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成；若f4单株在a、b和d三个基因组glu-1位点上均出现有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在任意1个glu-1位点上10粒种子hmw-gs组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本hmw-gs表现型相同的全部种子，分单粒种植成f5株系，开花前套袋自交，分单株收获f5种子；
每个f5单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成；若f5单株在a、b和d三个基因组的glu-1位点上均均出现有、无分离则为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在任意1个glu-1位点上10粒种子hmw-gs组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，鉴定所有种子的hmw-gs组成，根据hmw-gs组成进行归类；将具有相同hmw-gs组成的种子，分单粒种植成f6株系，开花前套袋自交，分单株收获f6种子。
f6单株中的近等基因系为：
f6单株中将每类hmw-gs组成单株均分单粒检测10粒，只有当单株内10粒种子hmw-gs组成相同时，则认为其在glu-1位点基因组成已纯合并再检测20粒确认，直至从所有类型中均鉴定到目标单株，这些单株互相为hmw-gs组成不同的近等基因系。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过连续选择glu-1的3位点杂合基因型的个体(通过下一代hmw-gs表型分离情况推断其上一代的基因型是否为所有位点杂合)进行连续自交，从自交3代后代中选择hmw-gs组成稳定而不发生分离的全套近等基因系，避免了连续回交导致hmw-gs纯合稳定时间过长的问题；更为明显的是，通过该方法可以获得hmw-gs近等基因系数目从0-4/5个梯度变化的全套(8个)近等基因系，实现了hmw-gs组成不同、数目梯度变异的全套近等基因系。
附图说明
图1为本发明的构建流程示意图；
图2是以g0为母本，3位点hmw-gs表达型小麦品种作父本杂交f2代(及后代全杂合基因型)hmw-gs的分离情况。其中，g0表示3个glu-1位点(glu-a1,glu-b1和glu-d1)的所有hmw-gs均不表达(0个)的普通小麦，基因型nn,nn,nn,蛋白表型n,n,n。父本:在3个glu-1位点均表达hmw-gs蛋白，基因型aa,bb,dd,蛋白表型a,b,d；基因a,b,d相对n均为显性，即基因型an,bn,dn分别与aa,bb,dd的蛋白表型一致，均为a,b和d。下划线示3位点杂合基因型，暗色示基因型组成为纯合的8种近等基因系类型。
图3是以3位点表达型小麦品种川农16(1,20,5+10)为父本创制的表达0-4个hmw-gs的近等基因系的sds-page电泳图。母本g0:表达0个hmw-gs(n,n,n)；父本川农16:表达4个hmw-gs(1,20,5+10)；a-h:表达0-4个hmw-gs的8种近等基因系。其表达的hmw-gs,a:(n,n,n)；b:(n,20,n)；c(1,n,n)；d:(n,n,5+10)；e:(1,20,n)；f:(1,n,5+10)；g:(n,20,5+10)；h:(1,20,5+10)。
图4是以3位点表达型小麦品种蜀麦969(1,6+8,3.1t+11*t)为父本创制的表达0-5个hmw-gs的近等基因系的sds-page电泳图。母本g0:表达0个hmw-gs(n,n,n)；父本蜀麦969:表达5个hmw-gs(1,6+8,3.1t+11*t)；a-h:表达0-5个hmw-gs的8种近等基因系。其表达的hmw-gs,a:(n,n,n)；b:(1,n,n)；c(n,6+8,n)；d:(n,n,3.1t+11*t)；e:(1,6+8,n)；f(1,n,3.1t+11*t)；g:(n,6+8,3.1t+11*t)；h:(1,6+8,3.1t+11*t)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对在创制表达hmw-gs组成有差异，数目变化幅度大的一整套近等基因系过程中存在的问题和不足，本发明提供了小麦三位点表达的hmw-gs数目变异全套近等基因系的创制方法。本方法仅通过一次杂交，结合应用生化标记鉴定后代hmw-gs组成，依据父本所具有的hmw-gs由3个glu-1位点编码的情况，在后代选择3个glu-1位点均为杂合基因型的单株连续自交，在自交4代的基因型杂合目标单株中，鉴定获得一套表达不同数目(0-4或5)hmw-gs小麦近等基因系的方法。
以3个基因组glu-1表达hmw-gs为0个的普通小麦为母本,表达4个(如，川农16，其glu-a1,glu-b1和glu-d1hmw-gs组成为ax1,bx20,dx5+dy10,即1,20,5+10)或5个hmw-gs(如，蜀麦969，其glu-a1,glu-b1和glu-d1hmw-gs组成为ax1,bx6+by8,dx3.1t+dy11*t,即1,6+8,3.1t+11*t)的普通小麦为父本通过一次杂交，后代通过连续自交鉴定筛选，最终获得hmw-gs组成不同，数目梯度变化的的一整套(8个)近等基因系。
首先，通过常规杂交产生f1种子。f1自交产生f2种子并利用半粒法sds-page分单粒鉴定hmw-gs组成，即1粒种子1分为2，仅含胚乳的小半粒种子用于鉴定hmw-gs组成，含胚的大半粒种子用于种植繁种。在f2选择hmw-gs组成与父本相同的单粒种子继续种植，自交产生f3种子。f3分单株收获后，每个单株分单粒鉴定10粒种子的hmw-gs组成，选择单株内a、b和d3个基因组的glu-1位点hmw-gs都在分离(即上一代每个glu-1位点都为杂合基因型，这一代都出现有、无带的表现型分离)的单株为目标单株，据此推测其上一代的hmw-gs基因在a、b和d3个基因组的glu-1位点都为杂合基因型类型。目标单株内所有种子分单粒鉴定hmw-gs组成，选择与原父本具有相同hmw-gs蛋白组成的所有单粒种子继续种植。重复以上自交步骤到f5,从f5的目标单株中鉴定所有种子的组成，并按hmw-gs表现型(即hmw-gs类型，非基因型，一整套含有8种hmw-gs表现型)进行归类种植，在f6代鉴定出hmw-gs基因型纯合稳定的全套近等基因系。
进一步的，一种小麦三位点表达的hmw-gs数目变异全套近等基因系的创制方法，包括以下操作：
1)以a、b和d3个基因组glu-1位点所有hmw-gs均不表达的小麦为母本，以glu-a1,glu-b1和glu-d13个glu-1位点均表达、表达数目为3-5个hmw-gs的小麦为父本，进行杂交得到f1种子；
2)将f1种子分单粒种植于大田，开花前套袋自交，然后分别收获单株f2种子，选取其中两株种子数100粒以上的f2种子用于sds-page鉴定hmw-gs组成，在所选的每个单株中选择hmw-gs组成与原父本hmw-gs蛋白表现型相同的所有含胚大半粒种子继续种植，其余舍掉；
3)将选中的f2种子分单粒种植成f3株系，开花前套袋自交，单株收获f3种子；
4)每个f3单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成；若f3单株在a、b和d三个基因组glu-1位点上均出现hmw-gs有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在任意1个glu-1位点上hmw-gs组成在10粒种子间表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本hmw-gs蛋白表现型相同的全部种子，分单粒种植成f4株系，开花前套袋自交，分单株收获f4种子；
5)每个f4单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成；若f4单株在a、b和d三个基因组glu-1位点上均出现有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在任意1个glu-1位点上10粒种子hmw-gs组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本hmw-gs表现型相同的全部种子，分单粒种植成f5株系，开花前套袋自交，分单株收获f5种子；
6)每个f5单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成；若f5单株在a、b和d三个基因组的glu-1位点上均均出现有、无分离则为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在任意1个glu-1位点上10粒种子hmw-gs组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，鉴定所有种子的hmw-gs组成，根据hmw-gs组成进行归类；将具有相同hmw-gs组成的种子，分单粒种植成f6株系，开花前套袋自交，分单株收获f6种子；
7)f6单株中将每类hmw-gs组成单株均分单粒检测10粒，只有当单株内10粒种子hmw-gs组成相同时，则认为其在glu-1位点基因组成已纯合并再检测20粒确认，直至从所有类型中均鉴定到目标单株，这些单株互相为hmw-gs组成不同的近等基因系。
所述的半粒法鉴定hmw-gs组成采用sds-page电泳法，具体实施方案如下：
(1)用刀片在种子远离胚端刮少量胚乳并研磨成细粉，按照每4mg样品加入100μl蛋白提取液的比例加入提取液[含62.5mmtris-hcl(ph6.8),10％(v/v)甘油，2％(w/v)sds，0.002％(w/v)溴酚蓝，3.0％(v/v)β-巯基乙醇]，于室温下振荡1.5h，沸水中变性3-5min，8000rpm4℃离心5min。
分离胶缓冲液(1l):溶解151.2gtris，10gsds，38g硼酸，加水定容至1l，ph值为8.9。
浓缩胶缓冲液：1.0mtris-hcl(ph6.8)，10％(w/v)sds。
电泳缓冲液：将分离胶缓冲液稀释10倍
聚丙烯酰胺凝胶组成如下:
(2)取上清液2.5μl点样，恒流20ma电泳，待溴酚蓝走出分离胶30min后，电泳结束，取下胶用染色液(500ml染色液组成：325ml蒸馏水、0.5g考马斯亮蓝r-250、125ml异丙醇、50ml冰醋酸)染色1-2h，清水漂洗脱色至凝胶背景清晰后，照相保存结果，结果如图3、图4所示。
下面结合图1-图4及具体实施例对本发明作进一步描述。
小麦三位点表达的hmw-gs数目变异全套近等基因系的创制方法，包括以下操作：
1)以3个glu-1位点表达0个hmw-gs的普通小麦为母本，3个glu-1位点表达4个(如，小麦品种川农16，其hmw-gs组成为1,20,5+10)或5个(如，小麦品种蜀麦969，其hmw-gs组成为1,6+8,3.1t+11*t)的普通小麦(均为3位点表达型)为父本，常规杂交产生杂交f1种子。
2)种植杂交f1种子，开花前套袋自交，结实、收获f2种子。
3)f2种利用半粒法(不含胚的小半粒)分单粒鉴定hmw-gs组成，选择hmw-gs组成与原父本川农16或蜀麦969一致的单粒种子种植(含胚的大半粒),开花前套袋自交，分单株收获f3种子。
4)每个单株选择10粒f3种子鉴定hmw-gs组成，如某1个单株内10粒种子在a、b和d3个glu-1位点的hmw-gs都出现有带和无带的分离，则推测其上一代(f2)hmw-gs的基因组成在3个位点都为杂合基因型，则为目标单株,选择3位点杂合基因型有2个重要原因,一是通过连续选择glu-1位点杂合基因型从而使其在除glu-1位点外的其它位点形成连续自交,二是保证在最后一步的近等基因系选择过程中能具有全部8种类型,否则类型将不完整。
目标单株内所有种子分单粒sds-page鉴定hmw-gs组成，选择与原父本(川农16或蜀麦969)hmw-gs组成相同的所有种子，如川农16的hmw-gs组成为1,20,5+10，则选择hmw-gs蛋白表现型全部为1,20,5+10的种子，表现型为其它类型的均不选；如蜀麦969的hmw-gs组成为1,6+8,3.1t+11*t，则选择hmw-gs蛋白表现型全部为1,6+8,3.1t+11*t的种子，表现型为其它类型的均不选(如图2所示)，分单粒种植，开花前套袋自交，分单株收获f4种子。
5)每个单株选择10粒f4种子鉴定hmw-gs组成，如某1个单株内10粒种子在a、b和d3个glu-1位点的hmw-gs都出现有带和无带的分离，则推测其上一代(f3)hmw-gs的基因组成在3个位点都为杂合型，则为目标单株。
目标单株内所有种子分单粒sds-page鉴定hmw-gs组成，选择与原父本(川农16或蜀麦969)hmw-gs组成相同的所有种子分单粒种植，开花前套袋自交，分单株收获f5种子。
6)每个单株选择10粒f5种子鉴定hmw-gs组成，如某1个单株内10粒种子在a、b和d3个glu-1位点的hmw-gs都出现有和无的分离，则推测其上一代(f4)hmw-gs的基因组成在3个位点都为杂合基因型，则为目标单株。目标单株内所有种子分单粒sds-page鉴定hmw-gs组成，以川农16为父本的为例,分成8类，其蛋白表型分别为a(n，n,n)、b(1,n,n)、c(n,20,n)、d(n,n,5+10)、e(1,20,n)、f(1,n,5+10)、g(n,20,5+10)和h(1,20,5+10)。以蜀麦969为父本的为例,其8种蛋白表型分别为a(n，n,n)、b(1,n,n)、c(n,6+8,n)、d(n,n,3.1t+11*t)、e(1,6+8,n)、f(1,n,3.1t+11*t)、g(n,6+8,3.1t+11*t)和h(1,6+8,3.1t+11*t)。
上述种子分类分单粒种植，开花前套袋自交，分单株收获f6种子。
7)每个单株选择10粒f6种子鉴定hmw-gs组成，如果10粒种子hmw-gs组成一致，则该单株可能为hmw-gs稳定的目标单株并再鉴定10粒进行确认，直至选择到8种hmw-gs表现纯合稳定(即在基因组成上表现纯合)的类型，由此构成了一套hmw-gs数目0-4(川农16为父本)或0-5(蜀麦969为父本)的近等基因系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。