本发明属于人工授精技术领域，特别是涉及一种兔精液冷冻保存稀释液及使用方法。
背景技术
养兔业投资省、见效快、风险小，是农民脱贫致富的一条好路子，被专家称为“前途光明的新兴产业”和“农村新的经济增长点”。近几年来，随着我国精准扶贫政策的深入贯彻落实和西部大开发战略的实施，广大群众，特别是贫困农户和西部地区农牧民，把养兔业列为首选项目，国家每年投入大量扶贫资金帮助农牧民发展养兔生产，全国各种家兔的饲养量已超过4亿只，年兔毛产量达到8000余吨，年产兔肉超过45万吨，整个养兔产业产值超百亿元。
目前，人工授精技术已经应用到大多数家畜中，在国内，牛、羊、猪等的冷冻精液已经商品化大规模生产，但兔的人工授精技术还没有得到广泛应用，其中一个重要的因素是精液的保存问题。精液的保存可分为常温、低温和冷冻保存，其中常温和低温保存受地域和时间的限制，使兔的品种改良问题得不到根本的解决。精液的冷冻保存可以解决公兔“夏季不育”的现象，也可避免因其它原因造成公兔暂时精液质量不佳的问题。因此，兔精液的冷冻保存对兔的品质改良及大规模商品化生产具有十分重要的意义。
冷冻保护剂是影响兔冻精质量的重要因素。自从人们发现甘油的冷冻保护特性后，迅速促进了家畜冷冻精液的发展。但是，甘油作为一种渗透性冷冻保护剂，能够渗入精子细胞内部，浓缩或结合细胞内水分，降低溶液中盐的浓度和稀释液的渗透压。一方面对精子有保护作用，另一方面又对精子具有一定的毒害作用，部分精子经脱水后冷冻效果较好，但解冻后却无运动力和受精能力。近年来人们致力于研究非渗透性冷冻保护剂，并结合向稀释液中添加其他成分以改善冻后精子质量。对于非渗透性冷冻保护剂，透明质酸引起了研究人员的高度关注，这主要是由于透明质酸能够在生物活性细胞脱水的情况下在细胞膜外面形成一层保护膜，从而在冷冻过程中发挥保护活性细胞的作用。此外，精液在平衡及冷冻处理过程中，易受到自由基的损害，因此，在冷冻稀释液中添加抗氧化剂有利于保护精子。
本发明在传统稀释液的基础上，以冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整率等为质量评定指标，探索非渗透性冷冻保护剂透明质酸、抗氧化剂超氧化物歧化酶和肌醇对兔精液冷冻的保护效果，本发明对生产中进一步提高兔冻精质量具有重要的指导作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种兔精液冷冻保存稀释液及使用方法。本发明能够有效解决兔精液冷冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整率低的问题，有利于精液冷冻保存技术在养兔业中的推广，有利于提高兔的繁殖效率和育种速度。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种兔精液冷冻保存稀释液，所述冷冻保存稀释液的每100ml纯化水中包括如下组分：葡萄糖4-5g，柠檬酸钠0.2-0.4g，透明质酸1-3g，超氧化物歧化酶3500-4000iu，肌醇0.4-0.6g，新鲜卵黄5-6ml。
优选的，所述兔精液冷冻保存稀释液通过将葡萄糖、柠檬酸钠、透明质酸、超氧化物歧化酶、肌醇加入纯化水后充分搅拌，混合均匀制得。
优选的，所述冷冻保存稀释液的每100ml纯化水中包括如下组分：葡萄糖4.54g、柠檬酸钠0.38g、透明质酸2g、超氧化物歧化酶4000iu、肌醇0.5g、新鲜卵黄5ml。
本发明还提供上述兔精液冷冻保存稀释液的使用方法，包括如下步骤：
(1)将冷冻保存稀释液水浴加热至37℃，然后将冷冻保存稀释液缓慢倒入兔精液中，边加边轻轻摇晃，使冷冻保存稀释液与兔精液充分混合；
(2)将步骤(1)得到的稀释后的兔精液用细管分装，置于5℃平衡30～60min；
(3)将步骤(2)平衡后的兔精液液氮冷冻保存。
优选的，所述冷冻保存稀释液与兔精液的体积比为1:1。
优选的，所述兔精液为将采集的兔精液中含有的凝胶成分清除后得到。
优选的，所述兔精液的活率为0.65以上。
本发明具有以下技术特点：
1)本发明的冷冻保存稀释液采用透明质酸作为非渗透性冷冻保护剂，能够避免对精子的毒害作用，在冷冻过程中发挥保护活性细胞的作用。
2)本发明在冷冻保存稀释液中添加抗氧化剂超氧化物歧化酶和肌醇，有利于避免精子收到自由基的损害。
3)本发明通过透明质酸、超氧化物歧化酶和肌醇联合使用，大大提高了冷冻后精子的活率，质膜完整率和顶体完整率，有利于提高兔的繁殖效率和育种速度。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
一、冷冻保存稀释液的配制
准确称取葡萄糖4.54g、柠檬酸钠0.38g、透明质酸2g、超氧化物歧化酶4000iu、肌醇0.5g、新鲜卵黄5ml，加入100ml纯化水中，搅拌均匀，制成兔精液冷冻保存稀释液。
二、精液采集及活率评价
用假阴道法采集公兔精液。在显微镜下，目测法检测精子的活率达0.65以上的，供冷冻保存试验用。一般每次可采精液0.2～2ml，精液中含有凝胶成分，在冻精实验前需清除。
三、精液冷冻程序
在室温下，把冷冻保存液预先水浴加热到37℃，按稀释液与精液1:1比例缓慢倒入经过活率评定的精液，边加边轻轻摇晃，使精子与稀释液充分混合。稀释后的精液用0.25ml细管分装，置于5℃平衡30～60min。将液氮倒入准备好的泡沫箱中，放入量好刻度的铁架距液氮面2～5cm，再将平衡后的细管放到铁架上，盖上盖子熏蒸15min，之后迅速投入液氮中保存。
四、冻精解冻
解冻时，将液氮中的细管快速取出，投入37℃水中，轻轻摇晃30s后拿出，立即用干纱布吸干包好。剪开细管两头，滴到预先加温至37℃的载玻片上镜检，并记录精液的活率。
五、相关指标检测
精子活率：取兔精液冷冻细管，37℃、30s水浴解冻后，取10μl精液于载玻片上，加盖玻片，在400×倒置显微镜下主观评定精子活率。
精子质膜完整率：采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗膨胀检测。将解冻的精液用低渗液稀释，调整精子密度为1×106ml，37℃孵育30min，取20μl精子悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次计算至少200个精子。
精子顶体完整率：利用fitc-pna染液染色精子后，荧光显微镜观察精子顶体形态。将解冻后的精液铺在pvp液面上，800转离心6min，弃上清液；将沉淀精子用pbs重悬，调整精子密度为1×106/ml，从中取30μl涂片，空气中自然干燥，甲醇固定10min后，再加入30μlfitc-pna染液，37℃黑暗潮湿环境下孵育30min，再用pbs溶液冲洗，自然干燥后加少量增光剂，无色指甲油封片，立即在荧光显微镜下观察。
六、试验结果
稀释液中添加透明质酸、超氧化物歧化酶和肌醇显著提高了冷冻后精子活率、质膜完整率和顶体完整率，具体结果参见表1。
对照组稀释液按如下组成配制：葡萄糖4.54g、柠檬酸钠0.38g、新鲜卵黄5ml，加入100ml纯化水中，搅拌均匀。
表1：稀释液中添加透明质酸、超氧化物歧化酶和肌醇对兔精液冷冻的影响
注：同一列数字上标不同表示差异显著(p﹤0.05)。
从表中可以看出，本实施例的冷冻保存稀释液相对于对照组，兔精液的平衡后和冻后精子活率，质膜完整率和顶体完整率都有了明显提高，有利于提高兔繁殖效率和育种速度。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。