本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种突变体斑马鱼在制备变异型免疫缺陷病的动物模型中的应用。
背景技术：
：runx蛋白家族是一类具有高度保守蛋白序列的转录因子家族，包括dna结合结构域和蛋白互作结构域。runx家族成员在动物进化中出现很早，并保持着广泛的结构相似性。runx相关转录因子1(runt-relatedtranscriptionfactorl，runxl，也称aml1/cbfa2)，是runx家族中重要成员之一。在个体发育过程中，runx1在与hscs起始相关的组织和器官中都有表达，是造血细胞基因表达的主要调控因子之一，也是人类白血病中多种染色体易位的常见靶位点，对造血细胞的增殖和分化起到至关重要的作用。作为转录激活因子，runx1独自或协同其他转录因子、直接或间接地调节大量造血相关基因的表达。在runx1条件性敲除小鼠中，小鼠的b淋巴造血细胞发育被阻断，导致igm(immunoglobulinm)阳性的b淋巴数量减少，b淋巴细胞的vdj重排缺陷，其通过靶因子ebf1调控b淋巴细胞发育；另一小鼠模型中，runx1基因缺失导致造血干细胞发育到t淋巴细胞和b淋巴细胞过程受阻，同时抑制了巨核细胞成熟；在人类临床病例中，runx1作为造血发育调控重要基因，表达发生异常如点突变后丧失基因功能导致造血发育缺陷，同时可通过基因重排和和易位，导致骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome，mds)，骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasm,mpn)，急性髓系白血病(acutemyeloidleukaemia，aml)等免疫功能障碍白血病(imai,y.,kurokawa,m.,izutsu,k.,hangaishi,a.,takeuchi,k.,maki,k.,ogawa,s.,chiba,s.,mitani,k.,andhirai,h.(2000).mutationsoftheaml1geneinmyelodysplasticsyndromeandtheirfunctionalimplicationsinleukemogenesis.blood96,3154-3160.ichikawam,asait,saitot,etal.aml-1isrequiredformegakaryocyticmaturationandlymphocyticdifferentiation,butnotformaintenanceofhematopoieticstemcellsinadulthematopoiesis[j].naturemedicine,2004,10(3):299-304.)。因此，runx1基因在维持造血细胞正常发育中起到不可替代的重要作用，但在关于runx1基因对b淋巴细胞发育成熟的许多机制仍不清楚，需要进一步深入研究。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种突变体斑马鱼在制备变异型免疫缺陷病的动物模型中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种突变体斑马鱼在制备变异型免疫缺陷病(cvid)的动物模型中的应用，其中，所述突变体斑马鱼为runx1w84x/w84x突变体斑马鱼。所述的变异型免疫缺陷病(cvid)是由runx1基因异常表达引起，即由runx1w84x/w84x突变引起。所述的runx1w84x/w84x突变体斑马鱼为斑马鱼runx1基因runt结构域中第84位氨基酸trp的密码子中碱基g突变为a的突变体斑马鱼。所述的变异型免疫缺陷病(cvid)在通过骨髓血细胞移植治疗后症状缓解。所述的变异型免疫缺陷病(cvid)的症状为b淋巴细胞减少，b淋巴细胞免疫应答功能缺陷，b淋巴细胞重排缺陷和b淋巴细胞凋亡增加中的至少一种。所述的b淋巴细胞免疫应答的诱导药物包括钥孔戚血蓝素、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。一种突变体斑马鱼在制备用于筛选骨髓血细胞移植对变异型免疫缺陷病(cvid)有效的动物模型中的应用，其中所述突变体斑马鱼为runx1w84x/w84x突变体斑马鱼。所述的变异型免疫缺陷病(cvid)是由runx1w84x/w84x突变引起。所述变异型免疫缺陷病(cvid)在通过骨髓血细胞移植治疗后症状缓解。所述的变异型免疫缺陷病(cvid)的症状为b淋巴细胞减少，b淋巴细胞免疫应答功能缺陷，b淋巴细胞重排缺陷和b淋巴细胞凋亡增加中的至少一种。所述的b淋巴细胞免疫应答的诱导药物包括钥孔戚血蓝素、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。一种利用骨髓血细胞移植来治疗突变体斑马鱼变异型免疫缺陷病(cvid)的方法，其中所述突变体斑马鱼为runx1w84x/w84x突变体斑马鱼。所述变异型免疫缺陷病(cvid)是由runx1w84x/w84x突变基因引起。所述变异型免疫缺陷病(cvid)在通过骨髓血细胞移植治疗后症状缓解。本发明总体构思为：(1)在斑马鱼runx1w84x/w84x突变体成年时期，我们将runx1w84x/w84x基因缺失的斑马鱼纯合突变体和已经用绿色荧光蛋白egfp标记了的b淋巴细胞以及已经用红色荧光蛋白dsred标记了的t淋巴细胞的转基因家系鱼进行杂交，所得杂交子代再进行自交得到具有荧光标记背景的纯合突变体，利用流式细胞术(facs)观察其3个月及1年纯合突变体骨髓、血液循环系统中b、t淋巴细胞的数量、分化阶段的情况，观察cvid的特征是否会在这些鱼中出现；(2)利用钥孔戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)作为免疫原，鉴定runx1w84x/w84x突变体中淋巴细胞免疫反应情况，确定t、b淋巴细胞免疫应答功能；(3)利用b淋巴细胞v(d)j重排检测引物，通过巢式pcr方法，检测runx1w84x/w84x突变体肾脏血中b细胞重排(igm，igz)情况；(4)用brdu增殖实验、tunel凋亡实验确定b淋巴细胞分化过程中增殖和凋亡的改变；(5)利用骨髓移植，治疗及拯救该斑马鱼疾病，该治疗方法与人类疾病的治疗效果相似；(6)根据模型的骨髓中b、t淋巴细胞数量及功能，以及b淋巴细胞发育情况和自然病程，与临床进行cvid疾病详细比对，确定是否具有人cvid疾病具有类似病症。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明是首次发现斑马鱼上runx1突变与b淋巴细胞发育有关，该斑马鱼runx1w84x/w84x突变体具有与人类似的cvid疾病的症状，并证明该runx1w84x/w84x突变体斑马鱼b淋巴细胞免疫应答功能缺陷，该斑马鱼模型可能成为研究cvid疾病及药物筛选的新载体。(2)本发明中的runx1w84x/w84x斑马鱼模型，纯合突变体可以存活至成年并可繁殖下一代，而小鼠runx1纯合突变体出生后不久致死，因此我们可以探索幼年至成年时期runx1突变与该疾病的致病机理。另外，该斑马鱼可以实现：①新突破：尚未出现有效的人类cvid疾病斑马鱼模型；②高通量：斑马鱼产卵数量多，养殖方便容易，且可以同时进行多种药物筛选，可进行多批次同时进行药物筛选；③低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于老鼠，平均每天每只消费约为老鼠的1/100；④给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至成年斑马鱼吸收，所需化合物的量仅为老鼠的1/100～1/1000。(3)在以往的研究中，由于小鼠runx1基因突变在发育早期累及造血干细胞的发育，所以会导致各个造血谱系的缺陷。在临床中，该基因的异常主要与mds与aml相关。由于小鼠runx1纯合突变体出生后不久致死，无法监测到成年期runx1突变后的血液表型，即无法建立runx1基因相关的人类疾病模型。斑马鱼由于自身的特点，runx1纯合突变以后依然有部分可以存活至成年期(与小鼠不同)，给了我们监测青年至成年期runx1突变后的血液表型的机会。利用runx1w84x/w84x突变体斑马鱼，我们首次发现并建立了b淋巴细胞发育障碍，igm和igz重排缺陷，而t细胞发育不受影响或影响很小的人类cvid疾病模型。(4)本发明中runx1w84x/w84x突变体成鱼具有以下表型：①成鱼骨髓血、外周血中b淋巴细胞大量减少；②突变体中b淋巴细胞发育障碍，igm和igz重排缺陷，同时对外源蛋白免疫应答功能缺陷，这说明runx1基因缺失后，b淋巴细胞发育缺陷，不能有效产生免疫球蛋白进行免疫，总体情况类似人cvid疾病；③突变体骨髓血中b淋巴细胞凋亡增多，增殖情况正常；④利用骨髓移植实验，确定该斑马鱼疾病模型与人类疾病的治疗效果相似。附图说明图1是runx1基因突变体和其同胞野生型基因组dna和cdna测序结果和对应形成的蛋白图；其中，rd(runtdomain)为runt结构域；tad(transactivationdomain)为转录激活结构域；id(inhibitiondomain)为抑制结构域。图2是wt和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的外周血(peripheralblood，pb)、肾脏血(kidneymarrow，km)细胞分析结果图；其中，图a和b为wt和runx1w84x/w84x突变体中的外周血、肾脏血细胞may-grunwald/giemsa染色结果(三角箭头：红细胞；闪电箭头：淋巴细胞：星号：前体细胞；直线箭头：髓系细胞；原始图片放大100x)；图c和d为wt和runx1w84x/w84x突变体中的外周血、肾脏血细胞各谱系所占比例人工计数统计表(t-检验，p<0.05；均数±标准误，n表示相应组别中斑马鱼的样本量)。图3是q-pcr检测wt和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的肾脏淋巴细胞中淋巴细胞相关基因表达图(t-检验，p<0.05；均数±标准误)。图4是流式细胞术检测b淋巴细胞数量在wt(tg(cau.ighv-ighm:egfp)runx+/+)和runx1w84x/w84x(tg(cau.ighv-ighm:egfp)runx1w84x/w84x)突变体肾脏淋巴细胞中百分比结果图；其中，图a和b为流式细胞术检测wt和runx1w84x/w84x突变体肾脏淋巴细胞中igm:gfp+细胞百分比(方框圈出igm:gfp荧光阳性细胞群)；图c和d为流式细胞术检测wt(tg(rag2:dsred)；runx+/+)和runx1w84x/w84x(tg(rag2:dsred)；runx1w84x/w84x)突变体肾脏淋巴细胞中rag2:dsred+细胞百分比(方框圈出rag2:dsred荧光阳性细胞群；t-检验，p<0.05；均数±标准误)；n表示斑马鱼的样本量。图5是wt(tg(cau.ighv-ighm:egfp)runx+/+)和runx1w84x/w84x(tg(cau.ighv-ighm:egfp)runx1w84x/w84x)突变体斑马鱼的肾脏b淋巴细胞免疫效应功能检测结果图；其中，图a～d为流式细胞术检测wt和runx1w84x/w84x突变体b淋巴细胞功能实验的各组中igm:gfp+荧光细胞群占肾脏淋巴细胞群体示意图(方框圈出igm:gfp+荧光阳性细胞群)；图e为流式细胞术检测wt和runx1w84x/w84x突变体b淋巴细胞功能实验的各组中igm:gfp+荧光细胞占肾脏淋巴细胞群体的比例均值比较图(ipbs：注射pbs，iklh：注射钥孔戚血蓝素；one-wayanova，p<0.05；均数±标准误)；n表示斑马鱼的样本量。图6是巢式pcr检测野生型wt和runx1w84x/w84x突变体igz和igm的vj重排结果图；其中，nc(negativecontrol)为阴性对照。图7是wt(runx+/+)和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的肾脏b淋巴细胞增殖实验结果图；其中，图a为wt和runx1w84x/w84x突变体肾脏b淋巴细胞igm:gfp和brdu双染实验(左边：rag2染色，中间：brdu染色，右边：合成图)，箭头显示igm:gfp染色，brdu染色，igm:gfp与brdu共染阳性细胞；图b为wt和runx1w84x/w84x突变体肾脏中igm:gfp+b淋巴细胞中增殖细胞比例统计图(t-检验，ns：无统计学意义；均数±标准误)；图c为wt和runx1w84x/w84x突变体肾脏b淋巴细胞igm:gfp和tunel双染实验(左边：rag2荧光，中间：tunel染色，右边：合成图)，箭头显示igm:gfp染色，tunel染色，igm:gfp与tunel共染阳性细胞；图d为wt和runx1w84x/w84x突变体肾脏中igm:gfp+b淋巴细胞中凋亡细胞比例统计图(t-检验，p<0.05；均数±标准误)。图8是移植后受体造血重建检测图；其中，图a为移植实验流程示意图；图b～g为头肾组织扩展观测(椭圆代表斑马鱼头肾区域)；图h～j为观察受体肾脏血液循环中igm:gfp阳性b淋巴细胞；图k～m为流式细胞术分析移植后受体肾脏血细胞组成以及受体中igm:gfp+荧光细胞群占肾脏淋巴细胞群体比例示意图(方框圈出igm:gfp荧光阳性细胞群)。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。本发明中所使用的术语“野生型”或者“wt”都是指野生型斑马鱼。本发明中所使用的术语“同胞鱼(sibling)”是指由同一双亲的后代个体。实施例11、材料和方法：(1)斑马鱼养殖斑马鱼的养殖如文献(westerfieldm:thezebrafish:guideforthelaboratoryuseofzebrafish(brachdaniorerio).editionbyeugene,or,m.westerfield，1993)所述。本发明中用到如下的品系：ab野生型斑马鱼、runx1w84x/w84x突变体斑马鱼、tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼、tg(rag2:dsred)转基因斑马鱼、tg(lck:loxp-dsred-loxp-gfp)转基因斑马鱼。其中，将各个转基因斑马鱼系与runx1w84x/w84x突变体斑马鱼杂交后再自交获得不同转基因背景的runx1w84x/w84x突变体斑马鱼和野生型斑马鱼(runx1+/+对照鱼)，如tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1+/+和tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x，tg(rag2:dsred)；runx+/+和tg(rag2:dsred)；runx1w84x/w84x，tg(lck:loxp-dsred-loxp-gfp)；runx+/+和tg(lck:loxp-dsred-loxp-gfp)；runx1w84x/w84x。转基因斑马鱼tg(cau.ighv-ighm:egfp)又称tg(igm:egfp)，来源于traver实验室(page,d.m.,wittamer,v.,bertrand,j.y.,lewis,k.l.,pratt,d.n.,delgado,n.,schale,s.e.,mcgue,c.,jacobsen,b.h.anddoty,a.etal.(2013).anevolutionarilyconservedprogramofb-celldevelopmentandactivationinzebrafish.blood122,e1-11.)；tg(rag2:dsred)zf411又称tg(rag2:dsred)，来源于sureshjesuthasan实验室(fengbo.astudyoftherecombinationactivatinggene1inthezebrafishnervoussystem[j].phd,2006.)；tg(lck:loxp-dsred-loxp-egfp)又称tg(lck:dsred)，来源于zilongwen实验室(tian,y.,xu,j.,feng,s.,he,s.,zhao,s.,zhu,l.,jin,w.,dai,y.,luo,l.andqu,j.y.etal.(2017).thefirstwaveoftlymphopoiesisinzebrafisharisesfromaortaendotheliumindependentofhematopoieticstemcells.j.exp.med.214,3347-3360.)；runx1w84x/w84x又称runx1w84x，来源于p.paulliu实验室(jin,h.,sood,r.,xu,j.,zhen,f.,english,m.a.,liu,p.p.andwen,z.(2009).definitivehematopoieticstem/progenitorcellsmanifestdistinctdifferentiationoutputinthezebrafishvdaandpbi.development136,647-54.)。runx1w84x/w84x突变体斑马鱼是一个runx1基因runt结构域中第84位氨基酸trp，由于密码子中碱基g变为a，进而提前出现终止密码子tga，产生无义突变，导致runx1蛋白形成截短的蛋白，正常runx1蛋白不能表达，丧失runx1基因正常功能的突变体斑马鱼。(2)造血细胞的分离斑马鱼用三卡因麻醉，外周血(pb)通过用肝素化过的微量血细胞吸管从鳃中获取。肾脏血(km)细胞从肾脏中分离。分离出的pb和km用含5％的fbs重悬，接着将重悬的细胞400转3分钟离心至玻片上。最后用姬姆萨(merck,germany；1.09204.0500)，瑞士姬(merck:1.01424.0500)染色。根据细胞形态对pb和km细胞进行计数。结果如图2所示，对比wt发现，在runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的肾脏血和外周血中，淋巴细胞数量增多，髓系细胞数量减少。这提示了runx1基因在调节淋巴细胞发育中的起着重要作用。(3)实时荧光定量pcr检测t/b细胞变化总rna利用rnaeasykit(qiagen,maryland,usa；74004)提取，继而利用反转录试剂盒(promega,madison,usa,m1701)合成cdna。实时荧光定量pcr利用sybrgreenreal-timepcrmastermix(appliedbiosystems,austin,usa；4472908)染料在lightcyclernanosw1.0机器上进行。具体操作步骤参照说明书。通过wt和runx1w84x/w84突变体斑马鱼的肾脏血淋巴细胞荧光定量pcr分析发现，引物序列如下所示：结果如图3所示，在runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中，淋巴细胞特异性基因rag1/2(recombination-activatinggene1/2)，以及b淋巴细胞发育特异性基因igz(immunoglobulinheavyconstantzeta)，igm(immunoglobulinheavyconstantmu)，igd(immunoglobulinheavyconstantdelta)，iglc3(igiv1s1immunoglobulinlightiotavariable1,s1)表达明显降低，淋巴细胞特异性基因ikaros(ikarosfamilyzincfinger1,ikzf1)表达升高但并无统计学差异，而t淋巴细胞发育特异性基因lck(lckproto-oncogene,srcfamilytyrosinekinase)，tcrα(tcellreceptoralpha)，tcrβ(tcellreceptorbeta)表达均升高。(4)流式细胞术检测b细胞利用成年转基因系斑马鱼tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx+/+和tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x，tg(rag2:dsred)；runx+/+和tg(rag2:dsred)；runx1w84x/w84x肾脏血进行流式细胞术进行检测，通过fitc-a和pe-texasred-a通道分别检测淋巴细胞群体中绿色荧光蛋白gfp和红色荧光蛋白dsred荧光强度，计算wt和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的rag2:dsred+细胞占淋巴细胞群体的百分比以及igmgfp+细胞占淋巴细胞群体的百分比，进行统计学分析。结果如图4所示，与取血计数结果一致，对比wt，在runx1w84x/w84x突变体斑马鱼肾脏血和外周血中，淋巴细胞数量增多，髓系细胞数量减少。这提示了runx1基因在调节b淋巴细胞发育中的起着重要作用。(5)t、b淋巴免疫应答功能鉴定选取成年tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼，runx1+/+对照鱼(野生型斑马鱼)，tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼，分为四组：①runx1+/+野生型斑马鱼腹腔注射pbs组，3条tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼；②runx1+/+野生型腹腔注射klh(钥孔戚血蓝素)组，3条tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼；③runx1w84x/w84x突变体斑马鱼腹腔注射pbs组，3条tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼；④runx1w84x/w84x突变体斑马鱼腹腔注射klh组，3条tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼；每组注射1ulpbs缓冲液和1ulklh(5ug)；每组首次分别腹腔注射1ulpbs和5ugklh/cfa(弗氏完全佐剂)后14天，再次分别腹腔注射1ulpbs和5ugklh/ifa(弗氏不完全佐剂)，28天后进行检测，分别检测每组鱼肾脏中igm:gfp+荧光细胞所占淋巴细胞群体比例；每次实验独立进行重复3次方法，同样方法，以tg(lck:loxp-dsred-loxp-gfp)；runx+/+对照鱼和tg(lck:loxp-dsred-loxp-gfp)；runx1w84x/w84x为对象，分别检测每组鱼肾脏中lck；dsred+荧光细胞所占淋巴细胞群体比例。wt和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的肾脏b淋巴细胞免疫效应功能检测结果如图5所示。通过klh免疫转基因系斑马鱼tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1+/+和tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x突变体，进行成熟b淋巴细胞免疫功能鉴定实验发现，runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的b淋巴细胞免疫功能缺陷，不能有效产生免疫球蛋白进行正常免疫效应，而t淋巴细胞能产生正常的免疫效应，免疫功能正常。(6)巢式pcr检测runx1w84x/w84x突变体免疫球蛋白重链v(d)j重排首先选取tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼；runx1w84x/w84x突变体斑马鱼和其同胞野生型斑马鱼，取出肾脏，利用流式细胞仪，通过绿色荧光通道分选出igm：gfp绿色荧光阳性的b淋巴细胞；再各选取100个igm绿色荧光阳性的b淋巴细胞，利用基因组dna扩增试剂盒，进行基因组dna扩增；利用等量的tg(cau.ighv-ighm:egfp)转基因斑马鱼、runx1w84x/w84x突变体斑马鱼和其同胞野生型斑马鱼的b淋巴细胞dna为模板进行igz和igm巢式pcr，检测v(d)j重排情况，如发生重排，会检测到v(d)j重排的巢式pcr产物，如未发生重排，则检测不到v(d)j重排的巢式pcr产物。其中，引物序列如下所示：引物序列5′-3′igz(firstround)-fp(上游引物)gatggacgtgttacaatttggigz(firstround)-rp(下游引物)aaggtctattactaacagatcacigz(secondround)-fp(上游引物)cctcctcagactctgtggtgaigz(secondround)-rp(下游引物)aaggtctattactaacagatcacigm(firstround)-fp(上游引物)gatggacgtgttacaatttggigm(firstround)-rp(下游引物)gttccytthccccagtagtcaaaigm(secondround)-fp(上游引物)cctcctcagactctgtggtgaigm(secondround)-rp(下游引物)gttccytthccccagtagtcaaa巢式pcr检测野生型斑马鱼和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的igz和igm的vj重排后的结果如图6所示，通过对tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x突变体斑马鱼和其同胞野生型斑马鱼的基因组dna进行v(d)j重排特异性引物进行巢式pcr，发现在野生型斑马鱼和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中都可检测到igz的vj重排pcr产物，igz的v(d)j重排正常，而runx1w84x/w84x突变体中并未发现igm的v(d)j重排pcr产物，这表明runx1w84x/w84x突变体斑马鱼缺少v(d)j重排。(7)增殖及凋亡实验溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)标记实验如说明书所述。用10mm的brdu(sigma-aldrich；b5002)对tg(rag2:dsred):runx1w84x/w84x和同胞鱼对照组进行孵育4小时，然后利用流式细胞仪分选其肾骨髓血细胞红色荧光阳性细胞，再用鼠源性的anti-brdu抗体(roche，germany；10875400)山羊源性的anti-rfp抗体(abcam)孵育，最后用抗鼠的488(invitrogen,ca,usa；a21202)以及抗山羊的555(invitrogen,ca,usa；a21432)荧光染色并观察。末端脱氧核苷酰转移酶介导的dutp缺口末端标记(tunel)实验利用insitucelldeathdetectionkittmrred(roche；12156792910)试剂盒进行。接着使用鼠源性anti-gfp(abcam，ab1218)以及抗鼠的488(invitrogen,ca,usa；a21202)染色。图像利用奥林巴斯fluoview1000共聚焦显微镜进行拍摄。结果如图7所示，tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x中凋亡情况与野性型相似，这说明，在runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中b淋巴细胞减少并不是由于b淋巴细胞凋亡增加；而通过brdu增殖检测实验发现，在tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x中增殖减少，结合tunel凋亡检测结果表明，runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中b淋巴细胞发育减少是由于b淋巴细胞增殖能力减弱。(8)成年斑马鱼肾脏移植首先将0.015％tricane/pbs麻醉的受体野生型斑马鱼(120条)和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼(60条)进行γ射线照射，总剂量为25gy，照射后放入无菌斑马鱼缸和高压灭菌后的斑马鱼系统水中培养，禁止喂食，等待移植；培养2天后，进行移植实验，具体方法如下：①取出供体tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1+/+和tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的肾脏放入5％fbs/1×pbs中，利用40μm滤膜进行全肾脏血液过滤3次；②过滤后在4℃条件下进行离心，800g×5min，离心后轻轻去掉上清，加入1ml肾脏血细胞移植注射液重悬，取10μl进行细胞计数，计算出细胞总数：25格×16格的细胞计数板细胞总数/ml＝80小格内血细胞个数/80×400×104×稀释倍数；③计算出细胞总数之后在4℃条件下进行离心，800g×5min，离心后轻轻去掉上清，加入肾脏血细胞移植注射液，注射时候每条鱼注射3μl含肾脏血细胞移植注射液，使得3μl里面含有106个肾脏血细胞；④玻璃毛细管针用拉针仪进行拉针后，修整针头直径为60μm；⑤调整显微注射仪，使得注射压力约为10，平衡压力约为0.1，实际压力大小根据实际情况进行调整；⑥利用0.015％tricane/pbs麻醉照射后的受体斑马鱼，将受体斑马鱼进行置于浸水的海绵中固定；⑦用无菌刀片在受体斑马鱼心脏处轻轻划开约50mm左右划口，将显微注射针头插入心脏或心脏周围血液中，进行注射；⑧以tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1+/+和tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x突变体斑马鱼为供体，进行肾脏血细胞移植；将野生型转基因鱼tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1+/+供体肾脏血细胞通过注射心脏位置分别移植入无转基因背景的受体wt(wt>wt，wt肾脏血细胞移植入wt中；受体wt命明为hwt-wt)和无转基因背景的受体runx1w84x/w84x突变斑马鱼中(wt>runx1w84x/w84x，wt肾脏血细胞移植入runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中；受体runx1w84x/w84x突变体斑马鱼命名为hrunx1w84x/w84x-wt)，以证明runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的造血微环境(hematopoieticmicroenvironment)是否正常；将供体tg(cau.ighv-ighm:egfp)；runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的肾脏血细胞同样方法移植入受体wt(runx1w84x/w84x>wt，runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的肾脏血细胞移植入wt中；受体wt命名为hwt-runx1w84x/w84x)，以检测runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中b淋巴细胞缺陷是否存在细胞自主性；⑨注射后转入新鲜的高压灭菌处理过的系统水中培养，禁食一周，第二周开始喂食，以防止感染；⑩每天早晚更换培养受体斑马鱼的系统水，及时清除死亡鱼；第二周后开始喂鱼食，直至检测；第四周后通过体式荧光显微镜及流式细胞仪观察受体肾脏血液循环中是否存在供体igm:gfp阳性淋巴细胞，检测igm:gfp阳性细胞占淋巴细胞群体的百分比，进行统计学分析。wt和runx1w84x/w84x突变体斑马鱼的头肾重建结果如图8所示，发现受体的头肾在经照射进行移植后头肾造血重建，头肾组织扩展；同时，利用提示荧光显微镜观察受体肾脏血细胞中确实存在igm:gfp阳性细胞，这表明供体肾脏血已在供体中进行重建。同时，利用流式细胞术检测igm:gfp阳性细胞占淋巴细胞群体的百分比发现，受体hrunx1w84x/w84x(wt)中igm：gfp阳性细胞占淋巴细胞群体的百分比与受体hwt(wt)比例相似，这说明runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中肾脏造血微环境并无异常，可以重建造血并且显现wt斑马鱼血液表型，这也从另一方面说明runx1w84x/w84x突变体斑马鱼肾脏中淋巴细胞增多，髓系减少，b淋巴细胞减少而t淋巴细胞增多的表型并不是由于造血微环境的异常引起，同时受体hwt(runx1w84x/w84x)中igm:gfp阳性细胞占淋巴细胞群体的百分比较受体hwt(wt)明显减少，产生了供体的肾脏造血表型，这说明了成年runx1w84x/w84x突变体斑马鱼中，runx1调控肾脏造血发育和淋巴细胞发育、b淋巴细胞发育具有细胞自主性。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12