一种紫丁香蘑菌株及其子实体栽培方法与流程

本发明属于微生物技术领域，涉及一种紫丁香蘑菌株及其子实体栽培方法。

背景技术

紫丁香蘑lepistanuda(bull.)cooke又称裸口蘑，紫晶蘑，隶属于伞菌目、口蘑科、香蘑属，因为蕈柄呈紫丁香色并具有非常浓郁的独特菇香,故称紫丁香蘑。紫丁香蘑色泽宜人,香味浓郁,鲜嫩甜美,口味极佳,素有“一家食其味,十家闻其香”的美誉，在欧洲受欢迎程度与松露及牛肝菌齐名，在法国被视为上等的食材。

紫丁香蘑作为珍稀的食药用菌,具有较高的研究开发价值，但是目前为止主要来源为野外采集，其天然资源有限，且质量不能保证。虽然有些单位开展了紫丁香蘑的驯化栽培，但是未见有子实体栽培成功的报道。专利“一种基于黄酒糟的紫丁香蘑培养基以及紫丁香蘑液体菌种制备方法(cn201610552378.1)”提供了一种基于黄酒糟的紫丁香蘑培养基以及紫丁香蘑液体菌种制备方法，但是没有得到子实体；“一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法cn201510877093.0”公开了一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法，同样没有得到子实体。延边大学硕士学位论文《紫丁香蘑菌丝体培养特性及人工驯化栽培研究》(赵婷，2010)研究了紫丁香蘑菌丝体培养特性，并对其进行了驯化研究，但是结果没有获得子实体。姚志伟等对紫丁香蘑原基诱导合成进行研究，结果也没有得到子实体(姚志伟；袁阳波；高君伟，紫丁香蘑原基诱导合成培养基初探化学与生物工程，2010，27(1):59-62.)。1994曾经有报道茶园自生食用菌紫丁香蘑的驯化栽培(戴彩云和崔晓明，1994贵州茶叶1：24)报道在茶园露地栽培，经过7个月的时间出菇，该报道所用方法为露地栽培，不可控因素较多，而且出菇时间漫长，至今未见有推广。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供紫丁香蘑(lepistanuda)dch560菌株。

本发明提供的紫丁香蘑(lepistanuda)dch560菌株，其保藏号为cgmccno.15376。

上述紫丁香蘑在作为亲本进行杂交育种中的应用也是本发明保护的范围。

栽培上述的紫丁香蘑得到的子实体也是本发明保护的范围。

培养上述的紫丁香蘑得到的菌丝体也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供所述子实体的栽培方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述的紫丁香蘑的菌丝体依次进行原种制备、栽培种制备、接种及发菌、覆土、出菇管理和出菇，得到子实体。

上述方法中，所述原种制备的方法包括如下步骤：为将权利要求1所述的紫丁香蘑的菌丝体接种到原种培养基中，15-25℃避光培养，空气相对湿度为60％-70％至菌丝长满培养基，得到原种；

或，所述栽培种制备的方法包括如下步骤：将所述原种接种到栽培培养基中，15-25℃避光培养，空气相对湿度为60％-70％至菌丝长满培养基，得到栽培种；

或，所述接种及发菌的方法包括如下步骤：将所述栽培种接入栽培料，15-25℃避光培养，空气相对湿度为65％-75％至菌丝长满栽培料；

或，所述覆土的方法包括如下步骤：在所述接种及发菌步骤中待菌丝长满料面后在所述栽培料的料面上覆土，15-25℃避光培养，空气相对湿度为70％-75％，空气中二氧化碳相对浓度0.1％-0.5％，至菌丝生长到土层表面；

或，所述出菇管理的方法包括如下步骤：待所述覆土步骤得到的菌丝生长到土层表面时，补一层细土，维持温度15-23℃，光照强度为500-800lux，空气相对湿度为85％-95％，空气中二氧化碳相对浓度0.05％-0.15％，培养5-10天得到蘑菇原基；

或，所述出菇的方法包括如下步骤：将所述出菇管理步骤得到的蘑菇原基转移至环境温度为18-20℃，空气相对湿度为75％-90％，二氧化碳相对浓度为0.05％-0.15％的条件下培养，得到子实体。

所述方法还包括采收子实体步骤，具体为待子实体长至八成熟，菌盖尚未完全展开，即可采收菇。

上述方法中，所述原种培养基和所述栽培种培养基均为麦粒培养基或麦粒牛粪培养基；所述原种培养基和所述栽培种培养基相同。

所述麦粒培养基为由质量分数98％小麦粒、1％石膏和1％石灰组成的原料用水调制水分质量份数为65％得到的培养基；

所述麦粒牛粪培养基为由小麦粒93％，牛粪5％，石膏1％和石灰1％组成的原料用水调制水分质量份数为65％得到的培养基。

上述方法中，所述原种制备的方法中，所述15-25℃避光培养为22℃避光培养。上述栽培料为粪草发酵料，由农作物秸秆、牛粪、豆粕和石膏发酵而成。

上述栽培料可由如下栽培原料经二次发酵后得到：所述栽培原料由农作物秸秆(稻草、麦草)、动物粪便(如干牛粪和/或鸡粪)、豆箔和石膏粉混合而成。农作物秸秆、动物粪便、豆箔和石膏粉的质量(干重)配比为55：45：1.2：4。

在本发明中，所述二次发酵分为前发酵和后发酵。所述前发酵为：堆制前3-4天将农作物秸秆和牛粪预湿，水分含量为65％-70％，南北走向堆制发酵，监测堆体温度，只要堆体内部温度达到70℃以上后开始下降时进行一次翻堆，经过3-4次翻堆后，完成所述前发酵。所述后发酵为：将经过所述前发酵的栽培料进行再次发酵，将堆体内部温度升至58-62℃并保持12-24h，然后通风将堆体温度降至50-52℃保持4-6d，再将堆体温度降至常温(25-28℃)。完成所述后发酵，所述二次发酵即告结束。经过所述二次发酵的栽培原料应无氨味，无粪臭味，可以看到料面明显的白色放线菌层，将经过所述二次发酵的栽培原料的含水量调整到65％(质量分数)，ph值调整到7.0-7.5，即得到所述栽培料。

在所述方法中，栽培方式具体可为层架栽培。

所述层架栽培为：层架规格为3-5层，层高0.6m，宽1.5m，底层距离地面0.3m(长度依据需要而定)；所述栽培料平铺于每层床架进行栽培出菇。

上述子实体在食品加工中的应用也是本发明保护的范围。

本发明所提供的紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)是采自中国辽宁丹东宽甸满族自治县的标本分离得到的菌株，该菌株经过人工驯化后可以得到子实体。该菌株栽培得到的子实体菌盖为紫色，菌肉较厚，菌褶紫色，具有浓郁的香气，与野生子实体一致。本发明驯化得到了紫丁香蘑子实体，开发了珍稀食用菌新品种，对于保护该物种的种质资源，丰富食用菌品种资源，丰富菜篮子等具有重要意义，同时该菌为典型的草腐菌，可以利用农作物秸秆，具有生态意义。

保藏说明

建议分类命名：紫丁香蘑

拉丁名：lepistanuda

参据的生物材料：dch560

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：cgmcc

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年4月17日

保藏中心登记入册编号：cgmccno.15376

附图说明

图1为野外采集的紫丁香蘑标本。

图2紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)菌株试管菌种(母种)。

图3为紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)在pda平板培养20d天后菌丝的生长状况。

图4为紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)菌株接种在3种不同配方的原种培养基中的生长状况。

图5为紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)菌株播种30天后发满菌的状况。

图6为紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)菌株原基分化状况。

图7为紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)菌株子实体出菇状况。

图8为紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)菌株栽培得到的子实体担子和担孢子。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)的获得及鉴定

本发明菌株dch560分离自天然紫丁香蘑标本(紫丁香蘑标本于2016年采集自中国辽宁丹东宽甸满族自治县)，通过对其菌落、菌丝形态特征的观察，结合细胞核rdna-its测序，对该菌株进行分类鉴定。

一、形态学特征

将菌株dch560在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)20℃培养2周，菌落直径5cm左右，菌落正面淡紫色棉絮状，菌丝疏松，背面颜色稍深，幼嫩菌丝较老菌丝颜色深(见图1和图2)。菌丝有隔，透明，具锁状联合，直径1.2-5μm，未有观察到无性孢子产生。

二、分子生物学特征

rdna-its序列作为条形码(schoch,c.l.etal.nuclearribosomalinternaltranscribedspacer(its)regionasauniversaldnabarcodemarkerforfungi.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2012.109:6241-6246)，广泛用于真菌物种鉴定。本发明对菌株dch560进行dna提取和rdna-its扩增测序(所用引物为its4和its5组成的引物对)，其测序结果如序列表中序列1所示。将该序列在ncbi数据库中进行blast在线比对，结果显示该序列与紫丁香蘑(lepistanuda)相应序列(genbank：kj577474)相比，其同源相似性为99％。

its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’；

its5：5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’。

鉴于上述形态特征及rdna-its序列的分类鉴定研究，确定本发明菌株dch560为紫丁香蘑(lepistanuda)。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.15376。

实施例2、紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)子实体栽培的方法

一、栽培流程

紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)子实体的栽培流程具体如下：母种制备→原种制备→栽培种制备→接种及发菌→覆土→出菇管理→出菇→采收。

(1)母种的制备：将组织分离驯化后的紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)的菌丝，接种到母种培养基(试管斜面)上，15-25℃(如20-23℃)避光培养，培养至菌丝长满培养基，得到的菌丝体作为母种(图3)。

(2)原种的制备：将步骤(1)所得的母种转接到原种培养基上，其接种量为每750ml体积的原种培养基中均匀接入6-10个直径为1.0cm大小的母种菌种块，空气相对湿度为60％-70％，15-25℃(如20-23℃)避光培养至菌丝长满培养基，得到原种。

(3)栽培种的制备：将步骤(2)所得的原种转接到栽培种培养基上，其每750ml原种瓶接种30瓶750ml的栽培种，15-25℃(如20-23℃)避光培养，空气相对湿度为60％-70％，培养至菌丝长满培养基，得到栽培种。

(4)接种及发菌：将步骤(3)所得的栽培种接入栽培料，其接入比例为每平米栽培面积的栽培料接种2瓶栽培种(750ml)，接种方法为层播，将栽培种均匀地撒在料面，再铺一层料，覆上薄膜保湿，15-25℃(如20-23℃)避光培养，空气相对湿度为65％-75％(图5)。

(5)覆土：步骤(4)菌丝长满料面后在上述栽培料的料面上覆土，15-25℃(如20-23℃)避光培养，空气相对湿度为70％-75％，每天通风1次维持空气中二氧化碳相对浓度0.1％-0.5％(体积分数)；

覆土的土壤为草炭土，要求透气性好、持水力强。

(6)出菇管理：步骤(5)培养的菌丝生长到土层表面时，补一层细土，开始降温，以及光照强度为500-800lux的弱光刺激，空气相对湿度为85％-95％，每天通风2-3次，使二氧化碳相对浓度下降至0.05％-0.15％(体积分数)，培养5-10天。

(7)出菇：发现大量蘑菇原基(图6)后，转移至环境温度为18-20℃，空气相对湿度为75％-90％，二氧化碳相对浓度为0.05％-0.15％(体积分数)的条件下培养(图7)。

(8)采收：待子实体长至八成熟，菌盖尚未完全展开，即可采收第一潮菇。采摘后进行清理残留菇根、补土菇穴，待菌丝恢复后重新上述操作进行出菇，采收下一潮菇。

上述母种培养基可为pda培养基、加富pda培养基或麸皮浸汁培养基；

每升pda培养基按照如下方法配制得到：将马铃薯200g放入900ml水中煮沸20min，取滤液加入琼脂20g加热使之完全溶化，再加水补足至1000ml，121℃灭菌30min，获得1lpda培养基。

每升加富pda培养基按照如下方法配制得到：将马铃薯200g放入900ml水中煮沸20min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g，加热使之完全溶化，再加水补足至1000ml，121℃灭菌30min，获得1l加富pda培养基。

每升麸皮浸汁培养基按照如下方法配制得到：将麸皮100g放入900ml水中煮沸20min，取滤液加入琼脂20g、蔗糖或葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g，加热使之完全溶化，再加水补足至1000ml，获得1l所述麸皮浸汁培养基；

上述原种培养基和上述栽培种培养基为麦粒培养基或麦粒牛粪培养基。

麦粒培养基配方：小麦粒98％，石膏1％，石灰1％(质量分数)。配制方法为小麦粒浸泡12-24小时，煮沸20min左右，注意防止麦粒胀裂。煮好后捞出，清水冲洗，沥干水分，加入其余成分，溶解搅匀即成。

麦粒牛粪培养基为小麦粒93％，牛粪5％，石膏1％，石灰1％(质量分数)。配制方法为小麦粒浸泡12-24小时，煮沸20min左右，注意防止麦粒胀裂。煮好后捞出，清水冲洗，沥干水分，加入其余成分，搅匀即成。

上述栽培料为粪草发酵料，由农作物秸秆、牛粪、豆粕和石膏发酵而成，具体由如下栽培原料经二次发酵后得到：

上述栽培原料由农作物秸秆(稻草、麦草)、动物粪便(如干牛粪和/或鸡粪)、豆箔和石膏粉混合而成，农作物秸秆、动物粪便、豆箔和石膏粉的质量(干重)配比为55：45：1.2：4。

上述二次发酵分为前发酵和后发酵，前发酵为：堆制前3-4天将农作物秸秆和牛粪预湿，水分含量为65％-70％，南北走向堆制发酵，监测堆体温度，只要堆体内部温度达到70℃以上后开始下降时进行一次翻堆，经过3-4次翻堆后，完成前发酵。

上述后发酵为：将经过前发酵的栽培料进行再次发酵，将堆体内部温度升至58-62℃并保持12-24h，然后通风将堆体温度降至50-52℃保持4-6d，再将堆体温度降至常温(25-28℃)。完成后发酵，二次发酵即告结束。

经过二次发酵的栽培原料应无氨味，无粪臭味，可以看到料面明显的白色放线菌层，将经过二次发酵的栽培原料的含水量要调整到65％(质量分数)，ph值调整到7.0-7.5，即得到栽培料。

上述步骤(4)栽培方式具体可为层架栽培。

上述层架栽培为：层架规格为3-5层，层高0.6m，宽1.5m，底层距离地面0.3m(长度依据需要而定)；上述栽培料平铺于每层床架进行栽培出菇。

二、条件优化

分别对栽培过程中的如下因素进行了优化：原种培养温度摸索和原种培养基配方。

1、原种培养温度的确定

将组织分离得到的紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)的菌丝通过打孔的方式，按照直径为1.0cm的接种块量，接种于pda培养基上，放在不同的温度(15、20、22、25、30℃)下避光培养，培养过程中测定菌丝的生长速度，并观察菌丝的生长情况。

实验重复三次，定量数据结果取平均值。

结果如表1所示，可见紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)在22℃条件下，菌丝生长速度较快，显著高于其他温度条件。

表1为不同温度下菌丝生长速度的测定结果(单位：mm/d)

注：同一栏内相同的字母表示多重检验没有显著性差异(p＝0.05)。

2、原种培养基的确定

将相同条件下培养的同一批次的紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)的母种，接种于不同原种培养基(配方见下文)750ml培养瓶中，放在22℃恒温培养箱中避光连续培养，空气相对湿度为60％-70％，观察统计菌丝萌发时间以及菌丝长满瓶时间。

供试的原种培养基为如下三种(图4，a麦粒牛粪培养基，b麦粒培养基，c木屑培养基)：

配方1：棉籽壳木屑培养基

棉籽壳40％，木屑50％，麦麸8％，石膏1％，蔗糖1％；

配方2：麦粒培养基

麦粒98％，石膏1％、生石灰1％；

配方3：麦粒牛粪培养基

麦粒93％，牛粪5％，石膏1％、生石灰1％；

以上配方中各物质的份数均为重量份数(干重)。在以上各配方的基础上加水调湿至水分质量份数为65％，即得到供试的三种原种培养基。

生石灰和石膏粉为天津市致远化学试剂有限公司生产。

结果显示(图4)，紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)在配方2和配方3对应的原种培养基(命名为麦粒培养基和麦粒粪草培养基)中，萌发时间较早、菌丝生长速度较快、菌丝粗壮、生长状况较好。而在配方1木屑培养基上菌丝生长速度较慢并逐渐停止生长。

三、紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)栽培得到的子实体特征

按照一的方法，得到子实体。

紫丁香蘑dch560(cgmccno.15376)不仅成功栽培得到了子实体，而且观察到了担子和担孢子(图8，ab：担孢子，c长在担子上的担孢子)。栽培得到的子实体菌盖直径3-12cm，菌盖紫色，边缘内卷，菌肉较厚，淡紫色，成熟后色变淡，菌褶紫色，具有浓郁的香气。菌丝薄壁至略厚壁，中度分枝，弯曲，有些菌丝膨胀，交织排列，直径通常为4-10μm，膨胀菌丝直径达15μm。菌褶中菌髓菌丝无色，薄壁，少分枝，频繁分隔，略弯曲，规则排列，直径为2.5-6μm；子实层中无囊状体；担子近棍棒状，具2-4个小梗，大小为(24.0-26.0)×(5.0-7.0)μm。担孢子长椭圆形，无色，薄壁至略厚壁，大小为(6.7-9.0)×(4.0-5.5)μm。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种紫丁香蘑菌株及其子实体栽培方法

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>649

<212>dna

<213>紫丁香蘑lepistanuda(bull.)

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