本发明涉及一种组织培养高效快速繁殖方法和培养基，尤其是一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法和培养基。二、
背景技术：
：苹果栽培生产所用苗木都是采用嫁接繁殖方式繁殖的，即把优良品种的接穗嫁接在适宜的优良砧木上，这种嫁接繁殖方式一方面可保持接穗品种的优良特性及树体的一致性，另一方面又利用砧木对接穗品种的一些特殊的影响作用。砧木可有效的影响树体的大小、果实的质量和产量及对不良环境条件的抵抗能力(如抗寒、抗逆)等，在苹果上应用最多的是矮化或半矮化砧木，目的是使接穗品种树体矮化，矮化可提高种植密度，提高单产，方便管理，因此矮化砧木的选育与繁殖和接穗品种的培育与繁殖对苹果的生产具有同等的重要作用，组织培养的方法是实现快速育苗的重要技术手段，短期内可实现苗木的大量繁殖，组培苗还具有防止病害扩散、保持母本优良特性、实现无病毒苗繁育等特点，并且组培苗都是无性繁殖，有利于获得生长整齐一致的苗木，因此组织培养在果树砧木的无性快繁中是一项实用性很强的技术，‘m9t337’是荷兰木本植物苗圃检测服务中心从苹果矮化砧木m9中选出的一个矮化程度比m9更大的优良无性系，这个砧木矮化程度好，早丰产，适应性广，但该砧木常规扦插生根率低，压条繁殖繁殖倍数低，组培困难，不能满足生产用苗的需求，现在还没有一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法和培养基，本发明的目的就是实现工厂化育苗，为果园生产提供优质苗木，满足市场对苗木生产的需求。基于申请人于2018年3月15日的技术交底书和
背景技术：
中现有的技术问题、技术特征和技术效果，做出本发明的申请技术方案。三、技术实现要素：本发明的客体是一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法，本发明的客体是一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖培养基。为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法和培养基，因此实现了对苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖。为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖培养基，包含有以1/2ms基本培养基为基本成份和以ms的基本培养基为基本成份的两组增殖培养基。由于设计了两组增殖培养基和生根培养基，通过两组增殖培养基的先后培养，得到对增殖和伸长生长性能好的增殖试管苗，因此实现了对苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖。本发明设计了，1/2ms基本培养基和ms的基本培养基为两级增殖培养基的组份。本发明设计了，苹果矮化砧木的品种设置为m9t337或g41。本发明设计了，还包含有以蔗糖为基本成份的生根培养基。本发明设计了，第一增殖培养基：1/2ms+ba+tdz+山梨醇+iba+琼脂粉，第二增殖培养基：ms+ba+kt+iba+山梨醇+琼脂粉，生根培养基:1/2ms+iba+蔗糖，本发明设计了，还包含有芽启动培养基:ms+ba+iba+蔗糖+琼脂粉。本发明设计了，包含有芽启动培养基ms+0.5～2mg/lba+0.05～0.3mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉、第一增殖培养基：1/2ms+0.5～1.2mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.05～0.5mg/liba+6g/l琼脂粉、第二增殖培养基：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.3mg/lkt+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉、生根培养基:1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。本发明设计了，ms基本培养基组成无机成分大量元素工作浓度(mg/l)nh4no31650kno31900kh2po4170mgso4·7h2o370cacl2·2h2o440无机成分微量元素feso4·7h2027.8edta37.3ki0.83h3bo36.2mnso4·4h2o22.3znso4·7h2o8.6na2moo4·2h2o0.25cuso4·5h2o0.025cocl2·6h2o0.025有机成分烟酸0.5vb10.5vb60.5甘氨酸2.0肌醇1001/2ms基本培养基组成植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤(ba)，6-糖基氨基嘌呤(kt),噻苯隆(tdz),吲哚丁酸(iba)，碳源：蔗糖，山梨醇，无离子水，培养基凝固剂：琼脂粉。本发明设计了，一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法，其步骤是：把无菌试管苗先期在第一增殖培养基：1/2ms+ba+tdz+山梨醇+iba+琼脂粉中进行快速增殖培养，然后在第二增殖培养基：ms+ba+kt+iba+山梨醇+琼脂粉中进行增殖和伸长生长培养，得到增殖试管苗，把增殖试管苗在生根培养基:1/2ms+iba+蔗糖中进行进行生根诱导培养，得到生根植株。本发明设计了，其步骤是：一、培养基制备和培养条件：a、培养基制备：实验中所用的所有培养基在灭菌前调节ph值到5.8，把培养基分装到100ml三角瓶内，每瓶装45～55ml培养基，用耐高压高温塑料膜封好瓶口，在121℃和一个大气压下高压蒸汽灭菌20分钟。b、培养室培养条件：培养温度为25℃±2℃，光照周期为16小时/天，光照强度为3200勒克斯(lx)。二、无菌试管苗建立：从试验基地果园种植的‘m9t337’接穗上剪取生长健壮无病虫害的当年生半木质化枝条，剪掉叶片，叶柄保留0.3～0.6cm，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后由流动的水流冲洗30分钟以上，把冲洗的芽段放入超净台上预先灭好菌的无菌烧杯内，倒入70％酒精杀菌一分钟，倒掉酒精后再加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌八至十二分钟，期间摇动三至五次，倒出有效氯为5％的次氯酸钠后用无菌水洗外植体四至六次，把杀菌的芽段取出放置在无菌吸水纸上吸去杀菌的芽段的表面水分，把杀菌的芽段接种到装有芽启动培养基ms+0.5～2mg/lba+0.05～0.3mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉的试管内，把试管置培养室进行腋芽萌发启动培养得到无菌试管苗，三、试管苗增殖：无菌试管苗生长成绿苗，转移到第一增殖培养基：1/2ms+0.5～1.2mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.05～0.5mg/liba+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的快速增殖培养，然后转移到第二增殖培养基：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.3mg/lkt+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的增殖和伸长生长培养，得到增殖试管苗，四、试管苗生根：切取生长健壮且苗高在1.5厘米以上的增殖试管苗转移到生根培养基:1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖上，进行生根诱导培养，培养条件为先连续暗培养三天，然后转到培养室进行二十八天至三十五天的培养得到生根植株。五、试管苗移栽：生根小植株移出瓶外前，把培养瓶从培养室移出放置于有散射自然光照的环境中进行炼苗三至五天，然后打开瓶盖，在自然通风的环境中再炼苗一至三天，用镊子从瓶内取出生根小植株，洗净根部残留的培养基，移栽入装有育苗基质：按照重量比例为4:1:1的泥炭土：珍珠岩：蛭石的穴盘内，栽后用0.1％多菌灵溶液弥雾喷透，然后用透光性好的塑料薄膜覆盖保湿，每隔三至五天喷一次0.1％多菌灵溶液，待小苗长出一至两片新叶表明小苗已长出新根，此时可以揭去薄膜，小苗已移栽成活，生长至三片新叶以上适时移入田间。本发明设计了，ms基本培养基组成无机成分大量元素工作浓度(mg/l)nh4no31650kno31900kh2po4170mgso4·7h2o370cacl2·2h2o440无机成分微量元素feso4·7h2027.8edta37.3ki0.83h3bo36.2mnso4·4h2o22.3znso4·7h2o8.6na2moo4·2h2o0.25cuso4·5h2o0.025cocl2·6h2o0.025有机成分烟酸0.5vb10.5vb60.5甘氨酸2.0肌醇1001/2ms基本培养基组成植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤(ba)，6-糖基氨基嘌呤(kt),噻苯隆(tdz),吲哚丁酸(iba)，碳源：蔗糖，山梨醇，无离子水，培养基凝固剂：琼脂粉。本发明的技术效果在于：针对推广应用前景好的一个苹果矮化砧木‘m9t337’常规扦插繁殖困难、不能满足生产用苗的问题，通过组织培养快速繁殖技术，快速繁殖优良种苗，在试管内诱导生根，把生根植株移栽到田间，觖决常规扦插繁繁殖困难、繁殖效率低的技术问题，为生产提供优质种苗，有效克服苗木不足的问题。本专利技术可用于苹果砧木的无性繁殖、试管工厂化育苗等。在本技术方案中，1/2ms基本培养基和ms的基本培养基为两级增殖培养基的组份为重要技术特征，在用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法和培养基的
技术领域：
中，具有新颖性、创造性和实用性，在本技术方案中的术语都是可以用本
技术领域：
中的专利文献进行解释和理解。四、附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明的苹果砧木‘m9t337’腋芽萌发生长的效果图，a：接种后3周腋芽已开始萌发，b：接种后5周腋芽开始伸长生长，图2为本发明的苹果砧木‘m9t337’试管苗的增殖和生根的效果图，a：1/2ms+0.5～1.2mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+0.05～0.5mg/liba+30g/l山梨醇；b：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.3mg/lkt+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇；c：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇；d：ql+0.5～1.2mg/lba+0.1～0.5mg/liba+30g/l蔗糖；e：ql+0.5～1.2mg/lba+0.1～0.5mg/liba+30g/l山梨醇；f：在培养基1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖上生根。五、具体实施方式根据审查指南，对本发明所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语应当理解为不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为一般表述的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法，第一个实施例之一，其步骤是：一、培养基制备和培养条件：a、培养基制备：实验中所用的所有培养基在灭菌前调节ph值到5.8，把培养基分装到100ml三角瓶内，每瓶装45～55ml培养基，用耐高压高温塑料膜封好瓶口，在121℃和一个大气压下高压蒸汽灭菌20分钟。b、培养室培养条件：培养温度为25℃±2℃，光照周期为16小时/天，光照强度为3200勒克斯(lx)。二、无菌试管苗建立：从试验基地果园种植的‘m9t337’接穗上剪取生长健壮无病虫害的当年生半木质化枝条，剪掉叶片，叶柄保留0.3～0.6cm，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后由流动的水流冲洗30分钟以上，把冲洗的芽段放入超净台上预先灭好菌的无菌烧杯内，倒入70％酒精杀菌一分钟，倒掉酒精后再加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌八至十二分钟，期间摇动三至五次，倒出有效氯为5％的次氯酸钠后用无菌水洗外植体四至六次，把杀菌的芽段取出放置在无菌吸水纸上吸去杀菌的芽段的表面水分，把杀菌的芽段接种到装有芽启动培养基ms+0.5～2mg/lba+0.05～0.3mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉的试管内，把试管置培养室进行腋芽萌发启动培养得到无菌试管苗，三、试管苗增殖：无菌试管苗生长成绿苗，转移到第一增殖培养基：1/2ms+0.5～1.2mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.05～0.5mg/liba+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的快速增殖培养，然后转移到第二增殖培养基：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.3mg/lkt+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的增殖和伸长生长培养，得到增殖试管苗，四、试管苗生根：切取生长健壮且苗高在1.5厘米以上的增殖试管苗转移到生根培养基:1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖上，进行生根诱导培养，培养条件为先连续暗培养三天，然后转到培养室进行二十八天至三十五天的培养得到生根植株。五、试管苗移栽：生根小植株移出瓶外前，把培养瓶从培养室移出放置于有散射自然光照的环境中进行炼苗三至五天，然后打开瓶盖，在自然通风的环境中再炼苗一至三天，用镊子从瓶内取出生根小植株，洗净根部残留的培养基，移栽入装有育苗基质：按照重量比例为4:1:1的泥炭土：珍珠岩：蛭石的穴盘内，栽后用0.1％多菌灵溶液弥雾喷透，然后用透光性好的塑料薄膜覆盖保湿，每隔三至五天喷一次0.1％多菌灵溶液，待小苗长出一至两片新叶表明小苗已长出新根，此时可以揭去薄膜，小苗已移栽成活，生长至三片新叶以上适时移入田间。在本实施例中，ms(murashigeandskoog)培养基,组成如下：ms基本培养基组成1/2ms培养基,组成如下：1/2ms基本培养基组成无机成分大量元素工作浓度(mg/l)nh4no3800kno3950kh2po480mgso4·7h2o180cacl2·2h2o220无机成分微量元素feso4·7h2027.8edta37.3ki0.83h3bo36.2mnso4·4h2o22.3znso4·7h2o8.6na2moo4·2h2o0.25cuso4·5h2o0.025cocl2·6h2o0.025有机成分vb10.4肌醇100植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤(ba)，6-糖基氨基嘌呤(kt),噻苯隆(tdz),吲哚丁酸(iba)，碳源：蔗糖，山梨醇，无离子水，培养基凝固剂：琼脂粉。第一个实施例之二，其步骤是：一、培养基制备和培养条件：a、培养基制备：实验中所用的所有培养基在灭菌前调节ph值到5.8，把培养基分装到100ml三角瓶内，每瓶装45ml培养基，用耐高压高温塑料膜封好瓶口，在121℃和一个大气压下高压蒸汽灭菌20分钟。b、培养室培养条件：培养温度为23℃，光照周期为16小时/天，光照强度为3200勒克斯(lx)。二、无菌试管苗建立：从试验基地果园种植的‘m9t337’接穗上剪取生长健壮无病虫害的当年生半木质化枝条，剪掉叶片，叶柄保留0.3cm，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后由流动的水流冲洗30分钟以上，把冲洗的芽段放入超净台上预先灭好菌的无菌烧杯内，倒入70％酒精杀菌一分钟，倒掉酒精后再加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌八分钟，期间摇动三次，倒出有效氯为5％的次氯酸钠后用无菌水洗外植体四次，把杀菌的芽段取出放置在无菌吸水纸上吸去杀菌的芽段的表面水分，把杀菌的芽段接种到装有芽启动培养基ms+0.5mg/lba+0.05mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉的试管内，把试管置培养室进行腋芽萌发启动培养得到无菌试管苗，三、试管苗增殖：无菌试管苗生长成绿苗，转移到第一增殖培养基：1/2ms+0.5mg/lba+0.01mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.05mg/liba+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的快速增殖培养，然后转移到第二增殖培养基：ms+0.05mg/lba+0.01mg/lkt+0.01mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的增殖和伸长生长培养，得到增殖试管苗，四、试管苗生根：切取生长健壮且苗高在1.5厘米的增殖试管苗转移到生根培养基:1/2ms+0.1mg/liba+20g/l蔗糖上，进行生根诱导培养，培养条件为先连续暗培养三天，然后转到培养室进行二十八天的培养得到生根植株。五、试管苗移栽：生根小植株移出瓶外前，把培养瓶从培养室移出放置于有散射自然光照的环境中进行炼苗三天，然后打开瓶盖，在自然通风的环境中再炼苗一天，用镊子从瓶内取出生根小植株，洗净根部残留的培养基，移栽入装有育苗基质：按照重量比例为4:1:1的泥炭土：珍珠岩：蛭石的穴盘内，栽后用0.1％多菌灵溶液弥雾喷透，然后用透光性好的塑料薄膜覆盖保湿，每隔三天喷一次0.1％多菌灵溶液，待小苗长出一至两片新叶表明小苗已长出新根，此时可以揭去薄膜，小苗已移栽成活，生长至三片新叶以上适时移入田间。第一个实施例之三，其步骤是：一、培养基制备和培养条件：a、培养基制备：实验中所用的所有培养基在灭菌前调节ph值到5.8，把培养基分装到100ml三角瓶内，每瓶装55ml培养基，用耐高压高温塑料膜封好瓶口，在121℃和一个大气压下高压蒸汽灭菌20分钟。b、培养室培养条件：培养温度为27℃，光照周期为16小时/天，光照强度为3200勒克斯(lx)。二、无菌试管苗建立：从试验基地果园种植的‘m9t337’接穗上剪取生长健壮无病虫害的当年生半木质化枝条，剪掉叶片，叶柄保留0.3～0.6cm，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后由流动的水流冲洗30分钟以上，把冲洗的芽段放入超净台上预先灭好菌的无菌烧杯内，倒入70％酒精杀菌一分钟，倒掉酒精后再加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌十二分钟，期间摇动五次，倒出有效氯为5％的次氯酸钠后用无菌水洗外植体六次，把杀菌的芽段取出放置在无菌吸水纸上吸去杀菌的芽段的表面水分，把杀菌的芽段接种到装有芽启动培养基ms+2mg/lba+0.3mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉的试管内，把试管置培养室进行腋芽萌发启动培养得到无菌试管苗，三、试管苗增殖：无菌试管苗生长成绿苗，转移到第一增殖培养基：1/2ms+1.2mg/lba+0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.5mg/liba+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的快速增殖培养，然后转移到第二增殖培养基：ms+0.5mg/lba+0.3mg/lkt+0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的增殖和伸长生长培养，得到增殖试管苗，四、试管苗生根：切取生长健壮且苗高在1.9厘米的增殖试管苗转移到生根培养基:1/2ms+1mg/liba+20g/l蔗糖上，进行生根诱导培养，培养条件为先连续暗培养三天，然后转到培养室进行三十五天的培养得到生根植株。五、试管苗移栽：生根小植株移出瓶外前，把培养瓶从培养室移出放置于有散射自然光照的环境中进行炼苗五天，然后打开瓶盖，在自然通风的环境中再炼苗三天，用镊子从瓶内取出生根小植株，洗净根部残留的培养基，移栽入装有育苗基质：按照重量比例为4:1:1的泥炭土：珍珠岩：蛭石的穴盘内，栽后用0.1％多菌灵溶液弥雾喷透，然后用透光性好的塑料薄膜覆盖保湿，每隔五天喷一次0.1％多菌灵溶液，待小苗长出两片新叶表明小苗已长出新根，此时可以揭去薄膜，小苗已移栽成活，生长至三片新叶以上适时移入田间。第一个实施例之四，其步骤是：一、培养基制备和培养条件：a、培养基制备：实验中所用的所有培养基在灭菌前调节ph值到5.8，把培养基分装到100ml三角瓶内，每瓶装50ml培养基，用耐高压高温塑料膜封好瓶口，在121℃和一个大气压下高压蒸汽灭菌20分钟。b、培养室培养条件：培养温度为25℃，光照周期为16小时/天，光照强度为3200勒克斯(lx)。二、无菌试管苗建立：从试验基地果园种植的‘m9t337’接穗上剪取生长健壮无病虫害的当年生半木质化枝条，剪掉叶片，叶柄保留0.45cm，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣粉水清洗，而后由流动的水流冲洗33分钟，把冲洗的芽段放入超净台上预先灭好菌的无菌烧杯内，倒入70％酒精杀菌一分钟，倒掉酒精后再加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌十分钟，期间摇动四次，倒出有效氯为5％的次氯酸钠后用无菌水洗外植体五次，把杀菌的芽段取出放置在无菌吸水纸上吸去杀菌的芽段的表面水分，把杀菌的芽段接种到装有芽启动培养基ms+1.25mg/lba+0.17mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉的试管内，把试管置培养室进行腋芽萌发启动培养得到无菌试管苗，三、试管苗增殖：无菌试管苗生长成绿苗，转移到第一增殖培养基：1/2ms+0.85mg/lba+0.09mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.17mg/liba+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的快速增殖培养，然后转移到第二增殖培养基：ms+0.17mg/lba+0.19mg/lkt+0.19mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉上，完成无菌试管苗的增殖和伸长生长培养，得到增殖试管苗，四、试管苗生根：切取生长健壮且苗高在1.7厘米的增殖试管苗转移到生根培养基:1/2ms+0.5mg/liba+20g/l蔗糖上，进行生根诱导培养，培养条件为先连续暗培养三天，然后转到培养室进行三十一天的培养得到生根植株。五、试管苗移栽：生根小植株移出瓶外前，把培养瓶从培养室移出放置于有散射自然光照的环境中进行炼苗四天，然后打开瓶盖，在自然通风的环境中再炼苗二天，用镊子从瓶内取出生根小植株，洗净根部残留的培养基，移栽入装有育苗基质：按照重量比例为4:1:1的泥炭土：珍珠岩：蛭石的穴盘内，栽后用0.1％多菌灵溶液弥雾喷透，然后用透光性好的塑料薄膜覆盖保湿，每隔四天喷一次0.1％多菌灵溶液，待小苗长出两片新叶表明小苗已长出新根，此时可以揭去薄膜，小苗已移栽成活，生长至三片新叶以上适时移入田间。一种用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖培养基，第一个实施例之一，包含有芽启动培养基ms+0.5～2mg/lba+0.05～0.3mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉、第一增殖培养基：1/2ms+0.5～1.2mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.05～0.5mg/liba+6g/l琼脂粉、第二增殖培养基：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.3mg/lkt+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉、生根培养基:1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。第一个实施例之二，包含有芽启动培养基ms+1.25mg/lba+0.42mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉、第一增殖培养基：1/2ms+0.85mg/lba+0.10mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.27mg/liba+6g/l琼脂粉、第二增殖培养基：ms+0.27mg/lba+0.15mg/lkt+0.15mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉、生根培养基:1/2ms+0.5mg/liba+20g/l蔗糖。第一个实施例之三，包含有芽启动培养基ms+0.5mg/lba+0.05mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉、第一增殖培养基：1/2ms+0.5mg/lba+0.01mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.05mg/liba+6g/l琼脂粉、第二增殖培养基：ms+0.05mg/lba+0.01mg/lkt+0.01mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉、生根培养基:1/2ms+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。第一个实施例之四，包含有芽启动培养基ms+2mg/lba+0.3mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉、第一增殖培养基：1/2ms+1.2mg/lba+0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.5mg/liba+6g/l琼脂粉、第二增殖培养基：ms+0.5mg/lba+0.3mg/lkt+0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉、生根培养基:1/2ms+1mg/liba+20g/l蔗糖。本发明的第二个实施例，1/2ms基本培养基和ms的基本培养基为两级增殖培养基的组份。在本实施例中，苹果矮化砧木的品种设置为m9t337。在本实施例中，还包含有以蔗糖为基本成份的生根培养基。在本实施例中，第一增殖培养基：1/2ms+ba+tdz+山梨醇+iba+琼脂粉，第二增殖培养基：ms+ba+kt+iba+山梨醇+琼脂粉，生根培养基:1/2ms+iba+蔗糖，在本实施例中，还包含有芽启动培养基:ms+ba+iba+蔗糖+琼脂粉。本发明的第二个实施例是以第一个实施例为基础。在本实施例中，ms基本培养基组成无机成分大量元素工作浓度(mg/l)nh4no31650kno31900kh2po4170mgso4·7h2o370cacl2·2h2o440无机成分微量元素feso4·7h2027.8edta37.3ki0.83h3bo36.2mnso4·4h2o22.3znso4·7h2o8.6na2moo4·2h2o0.25cuso4·5h2o0.025cocl2·6h2o0.025有机成分烟酸0.5vb10.5vb60.5甘氨酸2.0肌醇1001/2ms基本培养基组成植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤(ba)，6-糖基氨基嘌呤(kt),噻苯隆(tdz),吲哚丁酸(iba)，碳源：蔗糖，山梨醇，无离子水，凝固剂：琼脂粉。本发明的实施例对苹果砧木品种为g41也实现了组织培养高效快速繁殖，得到了生根植株。实验结果1.腋芽的萌发生长苹果矮化砧木‘m9t337’的芽段成功诱导腋芽萌发生长形成绿芽梢(图1，a和b)，说明培养基ms+0.5～2mg/lba+0.05～0.3mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉对‘m9t337’腋芽的启动培养是有效的，图1苹果砧木‘m9t337’腋芽萌发生长：a：接种后3周腋芽已开始萌发；b：接种后5周腋芽开始伸长生长2.试管苗的增殖生长腋芽萌发获得的无菌绿苗转移到增殖培养基上继代增殖，先在①1/2ms+0.5～1.2mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇+0.05～0.5mg/liba+6g/l琼脂粉培养基上实现试管苗的高效快速增殖(图2，a)，然后转移到②ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.3mg/lkt+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉上实现试管苗的伸长壮苗培养(图2，b)，经过①和②两步培养获得了增殖效率高且伸长生长良好的健壮无根绿苗，是增殖和壮苗最有效的培养基和培养方法。而在培养基ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉(图2，c)或培养基ql+0.5～1.2mg/lba+0.1～0.5mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂粉(图2，d)或培养基ql+0.5～1.2mg/lba+0.1～0.5mg/liba+30g/l山梨醇+6g/l琼脂粉(图2，e)上虽然也都可以产生丛生芽，表现有良好的增殖，但伸长生长较差，且叶片产生黄化现象，不是继代增殖的最佳培养基，图2苹果砧木‘m9t337’试管苗的增殖和生根：a：1/2ms+0.5～1.2mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+30g/l山梨醇；b：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.3mg/lkt+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇；c：ms+0.05～0.5mg/lba+0.01～0.2mg/ltdz+0.01～0.3mg/liba+30g/l山梨醇；d：ql+0.5～1.2mg/lba+0.1～0.5mg/liba+30g/l蔗糖；e：ql+0.5～1.2mg/lba+0.1～0.5mg/liba+30g/l山梨醇；f：在培养基1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖上生根。3.试管苗的生根及移栽健壮绿苗在生根培养基1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖+6g/l琼脂粉上培养四周，生根率在85％以上(图2，f)，表明所选用生根培养基能有效诱导苹果砧木‘m9t337’试管苗获得生根植株，而在生根培养基1/2ms+0.1～1mg/liba+20g/l山梨醇+6g/l琼脂粉上，没有获得生根植株，生根试管苗经过散射自然光照下炼苗三至五天，然后打开瓶盖，自然通风炼苗一至三天，移栽入装有基质：按照重量比例为4:1:1的泥炭土：珍珠岩：蛭石(4:1:1)的穴盘内，栽后用0.1％多菌灵溶液喷雾喷透水，然后用透光性好的塑料薄膜覆盖保湿，这一移栽方法，成活率在85％以上。其中：ql基本培养基组成本发明具有下特点：1、由于设计了两组增殖培养基和生根培养基，通过两组增殖培养基的先后培养，得到对增殖和伸长生长性能好的增殖试管苗，通过生根培养基，得到生根植株，因此实现了对苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖。2、由于设计了通过第一增殖培养基和第二增殖培养基，通过先后增殖培养，得到的增殖和伸长生长效果最好。3、由于设计了生根培养基，使用蔗糖不再使用山梨醇，生根效果最好。4、由于设计了芽启动培养基,对芽启动进行处理，提高了试管苗增殖的效果。5、由于设计了对结构形状进行了数值范围的限定，使数值范围为本发明的技术方案中的技术特征，不是通过公式计算或通过有限次试验得出的技术特征，试验表明该数值范围的技术特征取得了很好的技术效果。6、由于设计了本发明的技术特征，在技术特征的单独和相互之间的集合的作用，通过试验表明，本发明的各项性能指标为现有的各项性能指标的至少为1.7倍，通过评估具有很好的市场价值。还有其它的与1/2ms基本培养基和ms的基本培养基为两级增殖培养基的组份相同或相近似的技术特征都是本发明的实施例之一，并且以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为满足专利法、专利实施细则和审查指南的要求，不再对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合的实施例都进行描述。因此在用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法和培养基
技术领域：
内，凡是包含有内层1设置为化学肥料与植物秸秆或植物叶体的高压形成的混合体的技术内容都在本发明的保护范围内。上述实施例只是本发明所提供的用于优良苹果矮化砧木‘m9t337’的组织培养高效快速繁殖方法和培养基的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的
技术领域：
，均属于本发明的保护范围。当前第1页12