本发明属于细胞工程组织培养
技术领域：
，特别是指一种黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法。
背景技术：
：黑果枸杞(lyciumruthenicummurr)属茄科(solanaceae)枸杞属(lycium)落叶多棘刺灌木，分布于我国青海、甘肃、宁夏、新疆、西藏、陕西、内蒙古等西北干旱地区，中亚、高加索和欧洲等地区亦有分布(袁海静等，2013)。黑果枸杞抗旱、抗寒、耐盐碱、根蘖性强，常以群落形式在干旱、盐碱的荒漠与半荒漠地区分布(甘青梅等，1997)。除了强抗盐碱干旱性之外，其成熟浆果中富含花色苷等多酚类物质，鲜果含量约386.9mg/100g，干果中花青素的含量最高达到3690mg/100g，是迄今为止发现花青素含量最高的天然野生果实，具有抗氧化、潜在预防和治疗心血管系统疾病等作用(zhengj,2011)。就目前市面上流传的黑果枸杞的果型较小，干果产量低，无法满足市场需求，浪费大量劳动力，且黑果枸杞大部分为正在逐渐消失的野生资源。众所周知，多倍体植株的特性多表现为：巨大性、果实无籽茎秆粗壮无刺、营养成分及生化成分含量增多，针对黑果枸杞现存的不完美状态及其开发价值，多倍体研究是打造提升黑果枸杞营养价值及含量比较适宜的途径，同时对大规模生产和工业化生产也具有重要意义。黑果枸杞干果中花青素的含量最高达到3690mg/100g，是迄今为止发现花青素含量最高的天然野生果实，许多关于黑果枸杞的研究均针对于它的保健养生功能，使得黑果枸杞需求量大大增加，且对提升黑果枸杞中花青素含量的研究较少，目前已无法满足市场的需求。营养成分及生化成分含量增多是多倍体植株的其中一种普遍特性，针对黑果枸杞现存的开发价值，也证实了多倍体研究是提升黑果枸杞营养价值及含量的适宜途径。目前对于黑果枸杞叶片离体多倍体诱导最佳处理时期的相关研究还未见报道，已有多倍体研究多用种子获得，无法同时保留同基因型的二倍体对照，而叶片愈伤获得法嵌合体较高，无法高效获得纯四倍体材料。参考文献：1.袁海静，安巍，李立会，等.中国枸杞种质资源主要形态学性状调查与聚类分析[j].植物遗传资源学报，2013(4):627-633.2.zhengj,dingcx,wangls,ligl.shijy,lih,wanghl,suoyr.anthocyaninscompositionandantioxidantactivityofwildlyciumruthenicummurr.fromqinghai-tibetplateau.foodchemistry,2011,126(3):859-865.3.甘青梅，骆桂法，普衍，等.藏药黑果枸杞开发利用的研究[j].青海科技，1997(1):17-19。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法，以解决现有方法不易获得纯合四倍体及获得四倍体诱导率低的问题。为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案予以实现：一种黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法，包括如下步骤：s1、剪取黑果枸杞无菌苗从上至下第4-5片幼嫩叶片，剪去叶片两端获得伤口后接种于叶片分化培养基中预培养，至叶片膨大生长出少量绿色愈伤组织；其中，叶片分化培养基的成分为：ms基本培养基+0.1mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+0.5mg/lkt；s2、将获得的带愈伤组织的叶片转移至含1％(v/v)的dmso和秋水仙碱的液体叶片分化培养基中进行多倍体浸泡诱导，秋水仙碱浓度为50-150mg/l，避光黑暗条件处理1-2天；然后使用无菌水清洗叶片后转入上述叶片分化培养基，继续22-26℃光照培养至长出不定芽；s3、将加倍过后的不定芽转入生根培养基中，22-26℃生长至不定芽高度达到3cm时进行多倍体检测，以获得多倍体再生植株；其中，生根培养基的成分为：1/2ms基本培养基+0.1mg/liba。优选地，所述步骤s1中，预培养时间为8-11天。优选地，所述步骤s3中，不定芽的生根培养的时间为10天。优选地，所述步骤s3中，多倍体检测用流式细胞仪和根尖染色体计数法实现。优选地，流式细胞仪检测用染液为10μg/ml的dapi染液，流式细胞仪所用的裂解液配方为：裂解液成分配置1l含量mgcl2·6h2o9.14gmops4.19gna3c6h5o77.74gtritonx-1005mlpvp-4010g优选地，所述根尖染色体计数方法的具体步骤为：1)预处理：植株根长至1-1.5cm时剪取0.5cm根尖置于对二氯苯水溶液4℃处理4h；2)固定：将根尖用卡诺固定液固定24h后用蒸馏水洗3次；3)解离：在60℃条件下用1mhcl处理根尖12-15min，清水洗4次；4)压片：取出根尖，切去根冠和伸长区，用解剖针轻戳根尖，滴一滴改良苯酚品红，染色10-15min后盖上盖玻片，施加少量压力使细胞舒展，100x物镜观察获得的变异株组培苗根尖细胞的中期染色体数目。本发明中缩略语、英文和关键术语定义列表：1、6-ba：6-苄氨基腺嘌呤2、iba：吲哚丁酸3、naa：萘乙酸4、kt：激动素5、dmso：二甲基亚砜6、mops：3-吗啉丙磺酸7、tritonx-100：聚乙二醇辛基苯基醚8、pvp-40：聚乙烯吡咯烷酮9、na3c6h5o7：柠檬酸钠本发明根据秋水仙碱处理浓度和处理时期，直接利用组培无菌苗的幼嫩叶片再生出不定芽进行多倍体诱导，不仅操作方便简易，最重要的是还可以大大提高诱变效率，降低嵌合体比率，进而大量获得多倍体材料，以解决现有方法不易高效获得纯合四倍体的问题，对育种研究以及大规模生产均具有重要意义。本发明是直接利用组培无菌苗的幼嫩叶片再生出不定芽进行多倍体诱导，黑果枸杞叶片离体诱导多倍体的最佳处理时期及处理浓度可大大提高诱变效率，降低嵌合体比率，本发明的技术方案中，不定芽的出苗率可达94.1％。附图说明图1为本发明实施例的黑果枸杞二倍体植株dna含量示意图。图2为本发明实施例的黑果枸杞四倍体植株dna含量示意图。图3为本发明实施例的黑果枸杞二倍体植株染色体数目示意图。图4为本发明实施例的黑果枸杞四倍体植株染色体数目示意图。图5为二倍体与四倍体黑果枸杞茎段同时接种至生根培养基生长30d后茎秆及其生长初期表型差异进行对比图。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。本发明针对现有方法不易获得纯合四倍体及获得四倍体诱导率低的问题，提出一种黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法。本发明的实施例包括如下步骤：s1、剪取黑果枸杞无菌苗从上至下第4-5片幼嫩叶片，剪去叶片两端获得伤口后接种于叶片分化培养基中预培养8-11天，至叶片膨大生长出少量绿色愈伤组织；其中，叶片分化培养基的成分为：ms基本培养基+0.1mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+0.5mg/lkt；s2、将获得的带愈伤组织的叶片转移至含1％(v/v)dmso和秋水仙碱的液体叶片分化培养基中进行多倍体浸泡诱导，秋水仙碱浓度为50-150mg/l，避光黑暗条件处理1-2天；然后使用无菌水清洗叶片后转入上述叶片分化培养基，继续22-26℃光照培养至长出不定芽，出苗率可达94.1％；s3、将加倍过后的不定芽转入生根培养基中，22-26℃生长10天至不定芽高度达到3cm时进行多倍体检测，以获得多倍体再生植株；其中，生根培养基的成分为：1/2ms基本培养基+0.1mg/liba。多倍体检测用流式细胞仪和根尖染色体计数法实现。表1不同浓度秋水仙碱对黑果枸杞不定芽的诱导的影响由表1可看出，当秋水仙碱的浓度为50mg·l-1，dmso为体积浓度1％同时作用时，诱导四倍体的概率可以达到42.9％，说明此种组合大大提升了黑果枸杞获得多倍体的效率。以流式细胞仪(图1和图2)和根尖染色体计数法(图3和图4)为检测方法时，其中，所用染液为10μg/ml的dapi染液，所使用裂解液配方为：流式细胞仪检测用染液为10μg/ml的dapi染液，流式细胞仪所用的裂解液配方为：裂解液成分配置1l含量mgcl2·6h2o9.14gmops4.19gna3c6h5o77.74gtritonx-1005mlpvp-4010g所述根尖染色体计数方法的具体步骤为：1)预处理：植株根长至1-1.5cm时剪取0.5cm根尖置于对二氯苯水溶液4℃处理4h；2)固定：将根尖用卡诺固定液固定24h后用蒸馏水洗3次；3)解离：在60℃条件下用1mhcl处理根尖12-15min，清水洗4次；4)压片：取出根尖，切去根冠和伸长区，用解剖针轻戳根尖，滴一滴改良苯酚品红，染色10-15min后盖上盖玻片，施加少量压力使细胞舒展，100x物镜观察获得的变异株组培苗根尖细胞的中期染色体数目。获得的变异株组培苗根尖细胞的中期染色体数目为2n＝4x＝48，即为四倍体。5)证实所得的四倍体，将二倍体与四倍体黑果枸杞茎段同时接种至生根培养基生长30d后茎秆及其生长初期表型差异进行对比(图5)，可知右侧四倍体苗表现出茎部增粗、生长矮化等特性。本发明针对黑果枸杞型较小，干果产量低，无法满足市场需求，浪费大量劳动力，且黑果枸杞大部分为正在逐渐消失的野生资源等现存的不完美状态及其开发价值，目前对于黑果枸杞叶片离体多倍体诱导最佳处理时期的相关研究还未见报道，已有多倍体研究无法高效获得四倍体材料，本发明根据找到的秋水仙碱最佳处理浓度和处理时期，直接利用组培无菌苗的幼嫩叶片再生出不定芽进行多倍体诱导，不仅操作方便简易，最重要的是还可以高效提高诱变效率，降低嵌合体发生概率，同时保留二倍体对照，大量获得多倍体材料，以解决现有方法不易高效获得纯合四倍体的问题，对育种研究以及大规模生产均具有重要意义。本发明是直接利用组培无菌苗的幼嫩叶片再生出不定芽进行多倍体诱导，黑果枸杞叶片离体诱导多倍体的最佳处理时期及处理浓度可大大提高诱变效率，降低嵌合体比率。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12