本发明涉及一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法。
背景技术：
：本发明涉及的白花马蔺(iris.lacteapall.)为鸢尾科鸢尾属多年生草本花卉，叶基生，灰绿色，条形或狭剑形；花乳白色，直径5-6厘米，花梗长4-7厘米；花期长5-6月；耐盐碱、耐践踏，根状茎粗壮，根系发达，可用于水土保持、改良盐碱土及脆弱生态环境；根、茎、花、种子均可入药，马蔺也是具有较高观赏价值的园林绿化景观材料。但由于东北地区冬季寒冷漫长，夏季生长季短，城市绿化可利用的植物种类少，且绿化成本较高，尤其是黑龙江省，能够露地越冬的品种有限，因此大量繁育能够在我省露地越冬的优良品种，对丰富高寒地区园林绿化植物种类具有重要意义，由于马蔺分株繁殖速度较慢，增殖系数低，每年只能春季进行繁殖，需要的母本数量较多，不适合大批量生产栽培。由于此品种繁殖率低，分株繁殖速度较慢，增殖系数极低，每年仅能增殖2-4倍，因此影响了此品种的大批量生产及广泛应用，在园林彩化、绿化大面积应用过程中产业化生产受到限制，此发明方法为解决白花马蔺组培繁殖过程中从愈伤组织诱导不定芽从而提高不定芽扩繁系数提出了具体方法。技术实现要素：本发明以优化再生体系为目的，以保持遗传稳定性为核心，提供一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，以解决分株繁殖速度慢，增殖系数低，组培苗褐化、玻璃化等不能满足工厂化育苗需求的问题。为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，包括以下步骤：1)外植体筛选：春季选择马蔺健康植株展开的叶片，选取叶片中间位置，剪下作为外植体；2)外植体消毒：将叶片置于装有清水的200ml烧杯中，加入2-3滴洗洁精，烧杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30-40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度10％次氯酸钠溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20(tween20)制成消毒液，轻轻摇晃，15-20分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入经过高温高压灭菌的无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；3)接种：将消毒好的叶片材料用已消毒滤纸吸干，叶片切成小正方形，尺寸为：0.5cm×0.5cm，将切成小方形的叶片平行置于基本培养基ms上，培养时间15天，培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000-2200lux，lux为：照度的国际单位；4)愈伤组织不定芽诱导：筛选步骤3)中ms培养基中叶片无污染、叶片边缘膨大的部分，转接于第一培养基上，所述第一培养基构成为：基本培养基ms附加0.02mg/l萘乙酸(naa)、2.0mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)和1.02,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养30天，叶片诱导出绿色、致密的愈伤组织，培养45-50天时，叶片诱导的愈伤组织的芽点处长出许多不定芽，培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000-2200lux，lux为：照度的国际单位；5)增殖培养：将愈伤组织诱导的不定芽以2-3个为一丛分别切下来，转接于第二培养基上，所述培养基构成为：基本培养基ms附加0.02mg/l萘乙酸(naa)、2.0mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)和1.0mg/l激动素(kt)；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养室内适宜温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2200lux，不定芽开始萌发侧芽，培养35天，分别切下侧芽接种于第三培养基上，所述第三培养基构成为：基本培养基ms附加0.05mg/l萘乙酸(naa)和3mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2200lux；培养30-35天，每丛不定芽都萌发出6-10个小侧芽；在种苗产业化生产中，此步骤重复进行，当不定芽重复增殖培养第5次时，侧芽数量继续增长，但会出现变异芽，要及时切除，保持种苗的遗传性状稳定性；当增殖培养超过4次，要适当降低培养基中6-苄基腺嘌呤(6-ba)和萘乙酸(naa)浓度，6-ba浓度调整为1.5mg/l，naa浓度调整为0.01mg/l，避免玻璃化及芽变异；6)组培苗复壮：将侧芽单独剪切后转接到基本培养基ms中，培养20-25天长成独立复壮苗，复壮苗最长叶长2cm时即可转入生根培养基中，培养室内24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2000-2200lux；7)根诱导：将复壮苗转接至第四培养基生根培养基中；所述第四培养基构成为：基本培养基ms培养基中大量元素含量减半，所述减半大量元素，由质量百分比浓度，950mg/l的硝酸钾(kno3)，220mg/l的氯化钙(cacl2·2h2o)，185mg/l的硫酸镁(mgso4·7h2o)，825mg/l的硝酸铵(nh4no3)，85mg/l的磷酸二氢钾(kh2po4·h2o)组成；附加1mg/l萘乙酸(naa)；1mg/l吲哆丁酸(iba)和活性炭3000mg/l；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养室温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2000-2200lux，培养10天，复壮苗长出乳白色根须；8)出瓶移栽：待步骤7)中无菌苗根长大部分为0.5-1.0cm时，将培养瓶移置过渡培养间，敞开封口膜1/3，使瓶内与室内环境一致，2天后去掉封口膜后再放置1天；采用20-22℃的水轻轻洗去组培苗根部附着的培养基，将其移栽到装有新珍珠岩的苗盘中，在温室内一层遮阳网条件下放置7天后撤去遮阳网，30天后，计算成活率，即完成高频再生体系。基本培养基(ms)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/l的硝酸钾(kno3)，440mg/l的氯化钙(cacl2·2h2o)，370mg/l的硫酸镁(mgso4·7h2o)，1650mg/l的硝酸铵(nh4no3)，170mg/l的磷酸二氢钾(kh2po4·h2o)组成，配制大量元素母液1l，10倍量，分别取19000mgkno3、4400mgcacl2·2h2o、3700mgmgso4·7h2o、16500mgnh4no3、1700mgkh2po4·h2o，分别溶解后混合定容至1l，每配置1l培养基取大量元素母液100ml；微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/l的硫酸锰(mnso4·4h2o)，6.2mg/l的硼酸(h3bo3)，8.6mg/l的硫酸锌(znso4·7h2o)，0.25mg/l的钼酸钠(na2moo4·2h2o)，0.025mg/l的硫酸铜(cuso4·5h2o)，0.025mg/l的氯化钴(cocl2·6h2o)，0.83mg/l的碘化钾(ki)组成，配置微量元素母液1l，100倍量，分别取2230mgmnso4·4h2o、620mgh3bo3，860mgznso4·7h2o，25mgna2moo4·2h2o，2.5mgcuso4·5h2o，2.5mgcocl2·6h2o，83mgki，分别溶解后混合定容至1l，每配置1l培养基取微量元母液10ml；铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/l的硫酸亚铁(feso4·7h2o)和质量百分比浓度为37.3mg/l的乙二胺四乙酸二钠(na2·edta·2h2o)螯合后的溶液(edta-fe)组成，配置铁盐母液1l，分别取2780mgfeso4·7h2o、3730mgna2·edta·2h2o，分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1l，每配置1l培养基取铁盐溶液10ml；有机物由质量百分比浓度为0.5mg/l的烟酸，0.5mg/l的盐酸吡哆醇，0.4mg/l的盐酸硫胺素，2mg/l的甘氨酸，100mg/l的肌醇组成，配置有机物母液1l，分别取50mg的烟酸，50mg的盐酸吡哆醇，40mg的盐酸硫胺素，200mg的甘氨酸，10000mg的肌醇，分别溶解，混合后定容至1l，每配置1l培养基取有机物母液10ml；蔗糖25-30g/l，琼脂粉5g/l，ph值6，培养基配置成功后，分装100ml培养瓶后，封上透气膜，于120℃高温0.1mpa压强条件下灭菌20分钟，取出后放于无菌操作台备用。所述再生体系建立方法是通过叶片为外植体，诱导愈伤组织，经愈伤组织诱导分化出不定芽，经增殖、复壮、生根等方法培育出完整小植株，本发明采用愈伤组织诱导不定芽方法，建立一种白花马蔺高效再生体系，能够保持原品种优良遗传性状，扩大繁殖系数，提高繁殖速度，满足产业化需求。本发明从筛选外植体、消毒方法、诱导愈伤组织不定芽、增殖培养、组培苗复壮、生根培养、出瓶驯化等方面，建立了一套完整的白花马蔺植株再生体系，确定了愈伤组培诱导培养基配方，叶片愈伤组织诱导率达到82.0％，诱导不定芽分化，系数可达8.9，10天内生根率达到93.5％，移栽成活率达94％。本发明是以叶片为外植体以ms为基本培养基，利用萘乙酸(naa)、6-苄胺基嘌呤(6ba)，吲哆丁酸(iba)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)，激动素(kt)激素调节，建立白花马蔺再生体系的方法。本发明从接种到有效诱导不定芽需要60天，一个增殖培养周期为5周，增殖倍数为6-10倍，且不受季节的影响，不定芽增殖速度快，无菌苗分化率高，可极大提高种苗繁殖系数，生根率高，可保持品种原有遗传特性，可为种苗规模化生产提供可靠的技术支持，进行产业化生产以满足市场需求。本发明方法无菌苗分化率高，不定芽增殖速度快，生根率高，驯化移栽成活率高，可为保持原有遗传特性及规模化生产提供可靠的技术支持。具体实施方式本发明一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，包括以下几个步骤：1)外植体筛选：春季选择马蔺健康植株展开的叶片，选取叶片中间位置，剪下作为外植体；2)外植体消毒：将步骤1)叶片置于装有清水的200ml烧杯中，加入2-3滴洗洁精，烧杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30-40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度10％次氯酸钠溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20(tween20)制成消毒液，轻轻摇晃，15-20分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入经过高温高压灭菌的无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；3)接种：将步骤2)消毒好的叶片材料用已消毒滤纸吸干，叶片切成小正方形，尺寸为：0.5cm×0.5cm，将切成小方形的叶片平行置于基本培养基ms上，培养时间15天，培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000-2200lux，lux为：照度的国际单位；4)愈伤组织不定芽诱导：筛选步骤3)中ms培养基中叶片无污染、叶片边缘膨大的部分，转接于第一培养基上，所述第一培养基构成为：基本培养基ms附加0.02mg/l萘乙酸(naa)、2.0mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)和1.02,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养30天，叶片诱导出绿色、致密的愈伤组织，培养45-50天时，叶片诱导的愈伤组织的芽点处长出许多不定芽，培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000-2200lux，lux为：照度的国际单位；5)增殖培养：将步骤4)愈伤组织诱导的不定芽以2-3个为一丛分别切下来，转接于第二培养基上，所述培养基构成为：基本培养基ms附加0.02mg/l萘乙酸(naa)、2.0mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)和1.0mg/l激动素(kt)；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养室内适宜温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2200lux，不定芽开始萌发侧芽，培养35天，分别切下侧芽接种于第三培养基上，所述第三培养基构成为：基本培养基ms附加0.05mg/l萘乙酸(naa)和3mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2200lux；培养30-35天，每丛不定芽都萌发出6-10个小侧芽；在种苗产业化生产中，此步骤重复进行，当不定芽重复增殖培养第5次时，侧芽数量继续增长，但会出现变异芽，要及时切除，保持种苗的遗传性状稳定性；当增殖培养超过4次，要适当降低培养基中6-苄基腺嘌呤(6-ba)和萘乙酸(naa)浓度，6-ba浓度调整为1.5mg/l，naa浓度调整为0.01mg/l，避免玻璃化及芽变异；6)组培苗复壮：将步骤5)侧芽单独剪切后转接到基本培养基ms中，培养20-25天长成独立复壮苗，复壮苗最长叶长2cm时即可转入生根培养基中，培养室内24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2000-2200lux；7)根诱导：将步骤6)复壮苗转接至第四培养基生根培养基中；所述第四培养基构成为：基本培养基ms培养基中大量元素含量减半，所述减半大量元素，由质量百分比浓度，950mg/l的硝酸钾(kno3)，220mg/l的氯化钙(cacl2·2h2o)，185mg/l的硫酸镁(mgso4·7h2o)，825mg/l的硝酸铵(nh4no3)，85mg/l的磷酸二氢钾(kh2po4·h2o)组成；附加1mg/l萘乙酸(naa)；1mg/l吲哆丁酸(iba)和活性炭3000mg/l；蔗糖30g/l；琼脂粉5g/l；ph6.0；培养室温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2000-2200lux，培养10天，复壮苗长出乳白色根须；8)出瓶移栽：待步骤7)中无菌苗根长大部分为0.5-1.0cm时，将培养瓶移置过渡培养间，敞开封口膜1/3，使瓶内与室内环境一致，2天后去掉封口膜后再放置1天；采用20-22℃的水轻轻洗去组培苗根部附着的培养基，将其移栽到装有新珍珠岩的苗盘中，在温室内一层遮阳网条件下放置7天后撤去遮阳网，30天后，计算成活率，即完成高频再生体系；如表1所示，供试的植株外植体100个，30天后，有82个外植体叶片诱导出愈伤健康组织，外植体愈伤组织诱导率为82％；表1叶片诱导愈伤组织数据统计如表2所示，以100个不定芽侧芽为基数，通过5周的培养，扩繁得到的组培不定芽890个，增殖倍数为8.9倍；不定芽数(个)扩繁5周后组培苗数(个)增殖倍数1008908.9表2不定芽分化实验统计如表3所示，100株复壮苗经过10天驯化培养，100株均正常生根，其中死亡7株，其成活率约为93％；复壮苗(株)生根株数(株)生根率成活率100100100％93％表3生根实验统计如表4所示，100株生根苗，栽植在装有新的珍珠岩的穴盘中培养，30后观察，正常扎根生长植株数为94株，成活率为94％；表4生根苗出瓶移栽实验统计如表1、表2、表3、表4所示，本发明从选择外植体、消毒方法、接种、愈伤组织不定芽诱导、增殖培养、组培苗复壮、根诱导及出瓶移栽方法等方面，建立了一套完整的白花马蔺植株再生体系，确定基于愈伤组织诱导不定芽的组培繁殖培养基配方，叶片愈伤组织诱导率达到82.0％，诱导不定芽分化系数可达8.9，10天内生根率达到100％，生根成活率为93％，出瓶移栽成活率达94％。当前第1页12