本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种培育水稻抗稻瘟病两系不育系的方法。
背景技术：
稻瘟病是水稻三大主要病害之一，可引起水稻大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至绝收。稻瘟病在我国各大稻区均有不同程度发生，近年来发生逐渐呈上升趋势。培育并推广抗稻瘟病水稻品种是防治稻瘟病最经济、最有效的方法。
杂交稻是当前生产上广泛应用的主要水稻品种类型之一，但水稻品种的稻瘟病抗性、产量和品质之间存在着一定的矛盾，往往抗病性好的品种产量不高、品质不好，或者品质好的品种产量不高、抗性不好。因此大多数杂交稻品种的稻瘟病抗性不强，存在稻瘟病危害的风险。
不育系是培育杂交稻品种最重要的亲本，其稻瘟病抗性的强弱直接关系到杂交稻组合的抗稻瘟病能力，培育抗稻瘟病不育系并配制抗稻瘟病杂交稻组合是当前杂交水稻育种的重要方向，对于保证我国水稻生产安全具有重要意义。
目前，利用pi1、pi2基因进行抗稻瘟病水稻回交育种研究的案例不少，如广东省农科院利用分子标记辅助选择聚合pi1和pi2基因改良两系不育系gd-7s稻瘟病抗性，但是由于水稻两系不育系具有较强的生态适应性，这种适应性主要反映在不育系育性转化的光温特性上，因而为了减少低温波动而影响不育系的稳定性，根据各生态地区的光温条件选择不育性稳定、抗稻瘟病的水稻两系不育系是水稻两系不育系选育的目标。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术存在的水稻生产中缺少抗稻瘟病品种的问题，提供一种培育水稻抗稻瘟病两系不育系的方法。
为实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：
一种培育水稻抗稻瘟病两系不育系的方法，依次包括以下步骤：
一、先以水稻光温敏核不育系广占63-4s为母本、带有抗稻瘟病基因pi1和pi2的gd-7为父本，将两者杂交得到f1种子，再种植f1种子后与广占63-4s回交获得bc1f1种子；
二、先种植bc1f1种子以获得bc1f1群体，然后在bc1f1群体中利用分子标记辅助选择带有pi1和pi2基因标记的可育单株与广占63-4s回交得到bc2f1种子；
三、先种植bc2f1种子以获得bc2f1群体，然后在bc2f1群体中利用分子标记辅助选择带有pi1和pi2基因标记的单株，收获bc2f2种子；
四、先种植bc2f2种子以获得bc2f2群体，再结合分子标记辅助选择、育性鉴定以及农艺性状考察选择带有pi1和pi2基因纯合标记的不育单株，保留其稻蔸，并在可育环境条件下繁种，收获bc2f3种子；
五、先种植bc2f3种子以获得bc2f3株系，然后通过农艺性状考察和育性鉴定选择优良的不育单株，保留其稻蔸，并在可育环境条件下繁种，获得bc2f4种子；
六、先种植bc2f4种子以获得bc2f4株系，并按照步骤五所述方法繁殖获得bc2f5种子，再种植bc2f5种子以获得bc2f5株系，然后对bc2f5株系经pi1和pi2基因标记验证纯合，并通过人工冷水池处理选择育性转换起点温度低于23.5℃的株系，繁殖选中株系得到的自交种子即为培育得到的抗稻瘟病两系不育系。
步骤六中，所述人工冷水池处理具体为：先在水稻幼穗分化第4～7期将植株从大田挖出，盆栽后置于自然状态下至植株活蔸，再将盆栽活蔸的单株放入冷水池中，灌入冷水处理6～8天后移至自然状态下生长，然后选择剑叶与倒二叶叶枕距在±2cm内的单穗，待抽穗后镜检，其中，所述处理期间水温设置为：开机温度23.1℃，停机温度22.8℃。
步骤四中，所述育性鉴定具体为：先用i2-ki溶液对取自稻穗的花粉进行染色，再通过观察花粉染色情况和形状选择不育花粉率不低于99.5％的单株，其中，不育花粉率＝不育花粉数/总花粉数*100％，不育花粉数为染色后出现典败或圆败现象的花粉数量。
所述分子标记辅助选择中，
pi1基因分子检测的引物为：
f:attgctgcaaagtgggagac
r:aagtggaggcagttcaccac；
pi2基因分子检测的引物为：
f:gtgcatgagtccagctcaaa
r:gtgtactcccatggctgctc。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明一种培育水稻抗稻瘟病两系不育系的方法一方面选用gd-7作为亲本之一，不仅增加了不育系的南方籼稻背景(目前生产上的水稻两系不育系通常含有较多的粳稻背景)，提高了不育系的配合力，而且有利于籼粳交杂种优势的利用，另一方面，本方法在低世代(分离世代)通过分子标记辅助选择抗稻瘟病基因、中高世代采用人工冷水池处理进行育性鉴定并结合田间农艺性状考察，即结合冷水池处理和分子标记辅助选择来选育既抗稻瘟病，育性转化又稳定的不育系材料，从而保证了选择结果的高准确度、高可靠性，明显提高了工作效率。因此，本发明不仅提高了不育系的配合力、有利于籼粳交杂种优势的利用，而且保证了不育系育性转换温度及抗稻瘟病这两个重要性状的选择结果准确、可靠。
2、本发明一种培育水稻抗稻瘟病两系不育系的方法培育的不育系通过对抗性、不育性检测以及田间农艺性状的考察，使得两系不育系不仅抗稻瘟病，而且产量高、品质优、配合力好，克服了抗性、品质与产量之间的矛盾。因此，本发明实现了抗性、品质与产量之间的协调统一。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
一种培育水稻抗稻瘟病两系不育系的方法，依次包括以下步骤：
一、先以水稻光温敏核不育系广占63-4s为母本、带有抗稻瘟病基因pi1和pi2的gd-7为父本，将两者杂交得到f1种子，再种植f1种子后与广占63-4s回交获得bc1f1种子；
二、先种植bc1f1种子以获得bc1f1群体，然后在bc1f1群体中利用分子标记辅助选择带有pi1和pi2基因标记的可育单株与广占63-4s回交得到bc2f1种子；
三、先种植bc2f1种子以获得bc2f1群体，然后在bc2f1群体中利用分子标记辅助选择带有pi1和pi2基因标记的单株，收获bc2f2种子；
四、先种植bc2f2种子以获得bc2f2群体，再结合分子标记辅助选择、育性鉴定以及农艺性状考察选择带有pi1和pi2基因纯合标记的不育单株，保留其稻蔸，并在可育环境条件下繁种，收获bc2f3种子；
五、先种植bc2f3种子以获得bc2f3株系，然后通过农艺性状考察和育性鉴定选择优良的不育单株，保留其稻蔸，并在可育环境条件下繁种，获得bc2f4种子；
六、先种植bc2f4种子以获得bc2f4株系，并按照步骤五所述方法繁殖获得bc2f5种子，再种植bc2f5种子以获得bc2f5株系，然后对bc2f5株系经pi1和pi2基因标记验证纯合，并通过人工冷水池处理选择育性转换起点温度低于23.5℃的株系，繁殖选中株系得到的自交种子即为培育得到的抗稻瘟病两系不育系。
步骤六中，所述人工冷水池处理具体为：先在水稻幼穗分化第4～7期将植株从大田挖出，盆栽后置于自然状态下至植株活蔸，再将盆栽活蔸的单株放入冷水池中，灌入冷水处理6～8天后移至自然状态下生长，然后选择剑叶与倒二叶叶枕距在±2cm内的单穗，待抽穗后镜检，其中，所述处理期间水温设置为：开机温度23.1℃，停机温度22.8℃。
步骤四中，所述育性鉴定具体为：先用i2-ki溶液对取自稻穗的花粉进行染色，再通过观察花粉染色情况和形状选择不育花粉率不低于99.5％的单株，其中，不育花粉率＝不育花粉数/总花粉数*100％，不育花粉数为染色后出现典败或圆败现象的花粉数量。
所述分子标记辅助选择中，
pi1基因分子检测的引物为：
f:attgctgcaaagtgggagac
r:aagtggaggcagttcaccac；
pi2基因分子检测的引物为：
f:gtgcatgagtccagctcaaa
r:gtgtactcccatggctgctc。
本发明的原理说明如下：
本发明以广占63-4s为轮回亲本、gd-7为供体亲本。广占63-4s是北方杂交粳稻研究中心与合肥丰乐种业水稻所育成的中籼光温敏核不育系；gd-7是广东省农业科学院以bl122为供体亲本改良两系不育系gd-7s稻瘟病抗性过程中的可育单株，其中bl122是由国际水稻研究所育成的多基因累加系，含有广谱抗稻瘟病基因pi1和pi2。
现有的水稻光温敏核不育系在选育环节，低世代主要靠设置适宜的选择环境、扩大选择群体、在当地和海南穿梭选择等方法，育性鉴定则主要通过分期播种的方法鉴定，因环境因素的不可控，会导致选择结果的准确度差、可靠性不够，不仅工作量很大，也很难选育出优质、抗病、育性稳定的不育系。对此，本发明通过分子标记辅助育种技术克服了现有育种技术主要是利用人工接种鉴定或稻瘟病疫区进行抗性鉴定，受环境及气候影响大，效果差、效率低、可靠性不高的缺点，保证培育的水稻两系不育系聚合稻瘟病抗性基因pi1和pi2，同时通过人工冷水池处理鉴定水稻两系不育系不育起点温度，克服了传统抗性育种技术中育性鉴定受气候条件不可控因素制约，鉴定结果准确度较差的缺点，保证了鉴定结果的准确可靠。
育性鉴定：本发明通过观察花粉染色和形状来判断花粉育性。育性正常的花粉粒含有较多的淀粉粒，遇i2-ki呈圆形紫黑色，而不育花粉粒经i2-ki染色有典败和圆败两种，花粉粒发育不健全，形状皱缩不规则，或圆形，无内含物，对i2-ki无染色反应，无受精能力，通常称典败(典型败育花粉)，花粉并不皱缩，仍为圆形，部分染色，也无受精能力，则为圆败。
本发明方法中，含pi1纯合单株或株系经分子标记检测只含有一条100bp的扩增条带，含pi2纯合单株或株系经分子标记检测只含有一条140bp的扩增条带。
实施例1：
一种培育水稻抗稻瘟病两系不育系的方法，依次按照以下步骤进行：
一、以水稻光温敏核不育系广占63-4s为母本、带有抗稻瘟病基因pi1和pi2的gd-7为父本，第一年夏季在武汉将两者杂交得到f1种子，同年冬季在海南种植f1种子后于第二年春季与广占63-4s回交获得bc1f1种子；
二、第二年夏季在武汉种植bc1f1种子以获得bc1f1群体，然后在bc1f1群体中利用分子标记辅助选择带有pi1和pi2基因标记的可育单株与广占63-4s回交得到bc2f1种子，其中，分子标记辅助选择过程中，基因pi1分子检测的引物为f:attgctgcaaagtgggagac、r:aagtggaggcagttcaccac，基因pi2分子检测的引物为f:gtgcatgagtccagctcaaa、r:gtgtactcccatggctgctc；
三、第三年春季在海南种植bc2f1种子以获得bc2f1群体，然后在bc2f1群体中利用分子标记辅助选择带有pi1和pi2基因标记的单株，收获bc2f2种子；
四、第三年夏季在武汉种植bc2f2种子以获得bc2f2群体，再结合分子标记辅助选择、育性鉴定以及对株型、柱头外露率、开花习性、丰产性等农艺性状考察选择得到8株带有pi1和pi2基因纯合标记的不育单株，保留其稻兜，于第四年春季带至海南繁种，收获bc2f3种子，其中，所述育性鉴定具体为：先在每穗上取上中下各三朵颖花中的花粉放在一个载玻片上用1％的i2-ki溶液进行染色，再每片各选择2～3个视野通过观察花粉染色情况和形状，连续镜检3天，选择不育花粉率不低于99.5％的单株，其中，不育花粉率＝不育花粉数/总花粉数*100％，不育花粉数为染色后出现典败或圆败现象的花粉数量；
五、第四年夏季在武汉种植bc2f3种子以获得bc2f3株系，然后通过农艺性状考察选择优良的不育单株，保留育性鉴定合格的稻兜，第五年春季带至海南繁种，获得bc2f4种子；
六、第五年夏季在武汉种植bc2f4种子以获得bc2f4株系，然后通过农艺性状考察选择优良的不育单株，保留育性鉴定合格的稻兜，第五年冬季带至海南繁种，繁殖获得bc2f5种子，第六年夏季在武汉种植bc2f5种子以获得bc2f5株系，再对bc2f5株系经pi1和pi2基因标记验证纯合，并通过人工冷水池处理选择育性转换起点温度低于23.5℃的株系11ms403，第六年冬季将其稻兜带至海南繁种，获得自交种子，该种子即为培育得到的抗稻瘟病两系不育系，其中，所述人工冷水池处理具体为：先在水稻幼穗分化第4～7期将植株从大田挖出盆栽，每盆三株，挂牌后置于自然状态下3～4天至植株活蔸，再将盆栽活蔸的单株按顺序整齐放入冷水池中，灌入23℃左右的冷水，水深以不育系幼穗浸没在水下5～10cm为准，处理期间水温设置为：开机温度23.1℃，停机温度22.8℃，处理7天后移至自然状态下生长，然后选择剑叶与倒二叶叶枕距在±2cm内的单穗，挂红牌作标记并编号，待作好标记的单穗抽穗开花时，首先淘汰目测明显散粉可育的单株，剩余单株在抽穗开花当天即取样镜检。
本发明对11ms403的育性表现、抗病性进行了相关的鉴定，11ms403的育性表现、抗病性及11ms403所配的杂交稻a在区试中的表现结果如下：
1、育性表现
(1)在武汉夏季不育期进行人工冷水池处理进行育性鉴定，结果见表1：
表111ms403人工光温育性鉴定结果
从上表中能够看出，11ms403不育起点温度低于23.5℃。
(2)自然条件下11ms403的育性表现
在武汉进行分期播种，4月15日播种第一期，前期每期间隔10天，后期每期间隔7～8天播一次，共播9期，对照品种为广占63-4s，从第一期始穗开始，每三天取10穗镜检和10穗套袋自交，分别考察花粉和小穗育性表现。结果表明：
11ms4034月15日播种，7月14日始穗，播始历期90天，6月20日播种，9月2日始穗，播始历期74天。随着播期推迟，播始历期变短，其变幅从90天到74天，表明其属于感温性较强的早熟中籼型不育系。
11ms403从7月14日始穗到9月5日，均表现稳定不育，不育期达到了50天以上。
2、抗病性
在宜昌对11ms403进行稻瘟病自然诱发鉴定，结果见表2：
上述结果表明，11ms403对稻瘟病的抗性级别为1级，表现为抗稻瘟病。
3、不育系11ms403所配的杂交稻a产量和抗性表现
以11ms403为母本，恢复系r476为父本，于春季将11ms403与r476在海南进行初配获得品种a，夏季在武汉鉴定杂种优势，表现出抗稻瘟病、米质优、丰产性强、熟期适宜等特点，并进行两年区试，产量及抗性结果见表3：
表3杂交稻a区试产量和稻瘟病抗性表现
以上结果显示：杂交稻a与对照(ck)平产，稻瘟病抗性达到抗性水平(病级1级)。