一种鱼卵保存液及其应用的制作方法

本发明涉及鱼卵和仔稚鱼的保存技术领域，尤其涉及一种鱼卵保存液及其应用。

背景技术

鱼卵是鱼类繁殖季节产卵繁殖后代的一种重要方式，也有卵胎生和假胎生的种类。鱼类产卵除了具有严格的季节性规律，还有固定的产卵海域，与水域温度、营养、盐度和浮游生物丰富度等多种生态指标相关。因此，鱼卵的种类、分布区域和数量是海洋环境监测和渔业资源调查以及科学理论研究的重要指标。同时，鱼卵和仔稚鱼也是渔业可持续发展的根本，其早期数量和成活率决定了渔业资源的世代更替，它的数量直接决定了成鱼资源的补充量。另外，鱼卵和仔稚鱼也是生态系统中特别是海洋生态系统浮游生物的重要组成部分，既是能量的消费者又是海洋食物链中重要环节之一，对维持生态平衡和食物链可持续发展具有重要意义。因此，鱼卵和仔稚鱼的保存和鉴定是海洋生态学以及生物学分类研究中的重要环节。

在多年来对于鱼卵的保存研究中，乙醇(95％或无水乙醇)作为鱼卵保存的基本方法也是较为通用的简单方法一直沿用至今。据报道，用乙醇保存的鱼卵在15年之后，仍能提取较为完整的dna。在鱼卵和仔稚鱼的鉴定方法发展过程中，形态学鉴定是早期人们对于鱼卵和仔稚鱼鉴定的常用手段，即依据鱼卵和仔稚鱼的形态、大小、卵周隙、脂肪球、内膜、绒毛膜、卵黄间隙和颜色等特征对鱼卵进行鉴定。随着分子鉴定技术的发展，如今dna条形码技术成为鱼类鉴定的普遍之选。但二者均有优缺点，在现代鱼卵和仔稚鱼鉴定中往往把形态学鉴定作为dna条形码方法的重要补充，也是检验现代分子鉴定技术成功与否的重要标志。鉴于形态学和分子检测的需要，乙醇保存的鱼卵和仔稚鱼因为脱水和离开乙醇保存液后，往往会因大量失水而变形萎缩，还会随着时间而失去部分颜色，因而影响形态学鉴定(一般在体视显微镜或双目显微镜下鉴定)。

技术实现要素：

本发明为了克服传统乙醇保存液对鱼卵和仔稚鱼在检测中失水变形并导致颜色褪去等而影响形态学鉴定的不足，提供了一种成膜性好、具有保水、防褪色作用、常温及低温稳定保存鱼卵和仔稚鱼形态的鱼卵保存液，实验证明本发明的保存液比传统乙醇保存液可以更有效保存鱼卵和仔稚鱼的形态。

本发明还提供了一种鱼卵保存液在鱼卵和仔稚鱼的形态保存中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鱼卵保存液，所述鱼卵保存液的主要成分为苯氧乙醇和丙二醇。

本发明选用苯氧乙醇和丙二醇作为鱼卵保存液的主要成分，二者均能和水以及其他有机溶剂任意比混合，有一定粘度，相比乙醇(95％)具有不易挥发、不易燃的特点，只要简单调整合适的浓度，保持适当的渗透压就可以有效保护动物细胞。

苯氧乙醇，中文名又叫二苯氧基乙醇、苯氧基乙醇等，分子式为：c8h10o2，属有机合成物，为无色稍带粘性液体，微香，味涩。溶于水，可与丙酮、乙醇和甘油任意混合，是化妆品中常见的防腐剂，属于相对比较安全的防腐剂之一，也作为药品为外科用药。本品对革兰阴性细菌和阳性细菌有一定的杀毒效果，浓度2％的溶液或乳剂可用于治疗绿脓杆菌感染的表面创伤，灼伤和脓疡。

丙二醇是一种化学试剂，与水、乙醇及多种有机溶剂混溶，其化学式为c3h8o2，为无色粘稠液体，近乎无味，细闻微甜。丙二醇在化妆品、牙膏和香皂中用作润湿剂，在染发剂中用作调湿、匀发剂，也用作防冻剂，毒性和刺激性都非常小，迄今尚未发现受害者。丙二醇在医药工业中常用作制造各类软膏、油膏的溶剂、软化剂和赋形剂等，在医药工业中用作调合剂、防腐剂、软膏、维生素、青霉素等的溶剂。丙二醇也用作化妆品的溶剂和软化剂等等。

作为优选，所述鱼卵保存液中包含以下体积百分含量的组分：苯氧乙醇0.2～1％和丙二醇4～5％，余量为水。该工作浓度下，具有适当的渗透压，可以有效保存鱼卵和仔稚鱼的形态。

作为优选，所述鱼卵保存液中还包含乙醇和/或甘油，所述乙醇在鱼卵保存液中的体积比控制在0～50％，所述甘油在鱼卵保存液中的体积比0～10％。这些成分的添加不影响保存效果，但可以在低温冷冻-20℃状态下长期保存。

作为优选，所述鱼卵保存液中还包含改性芦荟胶，所述改性芦荟胶由纳米g-c3n4量子点与芦荟胶复配所得，所述改性芦荟胶中纳米g-c3n4量子点的质量比控制在2～8％。

芦荟胶俗称“万能胶”，是一种具有生物相容性的绿色材料，有杀菌消炎，分解死亡感染的组织细胞，促进细胞增殖再生的功效。纳米g-c3n4量子点是一种具有优异的可见光响应的半导体材料，具有类似石墨的层状结构，属于非金属生物相容性的新型纳米材料，对细胞膜作用温和。而芦荟胶本身不具备粘性，本发明创造性地采用超声波分散技术将纳米g-c3n4量子点均匀地分布于芦荟胶中，在纳米g-c3n4量子点层状结构中彼此的分子力作用下相互靠拢，使得改性芦荟胶具有一定的粘性，同时纳米g-c3n4量子点层状结构与苯氧乙醇和丙二醇和乙醇上丰富的羟基基团接枝，协同增效，产生一定的成膜作用，使得浸泡在保存液中鱼卵表面产生一层透明质薄膜材料，增加鱼卵的刚性，有效防止鱼卵的失水、变形及褪色，同时纳米g-c3n4量子点具有荧光作用，进一步便于实验室的形态学鉴定。

作为优选，所述纳米g-c3n4量子点的粒径控制在5～10nm。该粒径范围内纳米g-c3n4量子点在芦荟胶中的分散度最佳，产生的黏度适中，黏度过高会导致鱼卵彼此粘连，不利于观察。

作为优选，所述改性芦荟胶占鱼卵保存液的体积比控制在0.05～0.15％，该浓度范围内各组分直接的接枝作用最佳，所保存的鱼卵表面成膜作用适中。

一种如上述的鱼卵保存液在鱼卵和仔稚鱼的形态保存中的应用，不适于保存具有复活活力的鱼类胚胎。

作为优选，保存温度控制在-4～25℃。

作为优选，保存温度控制在0～7℃。

作为优选，将鱼卵或仔稚鱼置于鱼卵保存液中，保存过程中持续采用可见光照射。可见光照可以杀菌，同时使得鱼卵保存液中的纳米g-c3n4量子点产生光催化杀菌作用，有利于延长鱼卵的保存期，降低实验成本。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)具有适当的成膜性，防止鱼卵失水、变形，褪色，可以长期有效保护鱼卵和仔稚鱼的形态，在鉴定过程中呈现暴露状态下不会失水萎缩变形；

(2)不会对鱼卵dna造成损伤，不影响基于dna的检测；

(3)无毒无害，具有一定的杀菌性、不易挥发，不易燃的优点；

(4)基于最简单的实验室保存条件，常温和低温均可，安全可靠，适于大多数检测和研究单位应用。

附图说明

图1是四种鱼卵(a、b、c、d)在实施例2的鱼卵保存液中保存12个月后的细胞形态图。

图2是经实施例2的鱼卵保存液保存12个月后的鱼卵dna的pcr产物的电泳分析结果图，其中，n为对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

下面结合实例对本发明的方法过程做进一步说明。但实例仅限于本保存液的说明，权利保护并不限于此。本领域相关的技术人员可以借助实例更好地理解和使用本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

本发明实施例1-6的鱼卵保存液的配方见表1：

表1.鱼卵保存液的配方表

根据查阅资料和预实验，设计以上六种鱼卵保存液配方，预实验中设置试剂组分的浓度为：苯氧乙醇(0.1％-5％，)丙二醇(2％-10％)，乙醇(10-50％)，丙三醇(1％-10％)，二甲基亚砜(1％-20％)。在测试浓度变化对保存效果的影响时，以配方ⅰ为基础优选出苯氧乙醇和丙二醇的合适浓度，分别为1％和4％，并固定苯氧乙醇和丙二醇在配方在ⅱ、ⅲ和ⅳ中浓度为1％和4％，然后变化其他添加成分的浓度并逐个测试其对鱼卵的保存效果，保存分为常温(6-25℃室温)和低温(4℃)两种条件，保存时间为3-12个月，每个月抽检一次。鱼卵选用我国东海舟山海域捕捞的鱼卵，同时以95％乙醇保存液为对照；每组鱼卵约为100个。

经保存液配方筛选，根据各配方保护液对于鱼卵形态的保存效果，以鱼卵形态完整性、是否发生粘连、保护液的遮光在显微镜下是否影响拍照鉴定、配方成本高低以及是否对操作人员有害、挥发性和易燃性等综合指标，结果表明实施例2和实施例3的配方具有类似的保存效果，各个保存时间段(1-12个月)鱼卵形态无显著变化。

因此，结合考虑保存液的成本、挥发性和易燃性以及安全性，综合评定配方ⅰ为最佳配方，苯氧乙醇和丙二醇浓度分别在0.2％～1％和4％～5％。

12个月后经实施例2的鱼卵保存液中鱼卵与95％乙醇保存液中的鱼卵形态无明显差异，排除人为操作损坏，均具有良好的外形，显微镜下的鱼卵形态，12个月后实施例2的鱼卵保存液中鱼卵形态部分照片如图1所示，a-d为四种不同鱼卵，外形完整、圆润，内部脂肪球等特征保留完成，显微镜下可见明显特征，表明本发明鱼卵保存液具有较好的效果。

另一方面，鱼卵从保存液取出后置于显微镜下拍照，保存液中取出后鱼卵可以持久保持圆滑湿润状态，不变形，表面不干涩，表面液体经吸水纸处理后显微镜下不出现遮光现象，保护液无异味。乙醇保存液中的鱼卵取出后极易干燥，随之萎缩变形，形成卵的外膜塌陷。相比之下，本发明的保存液具有保持外形完整性的优越性。

鱼卵保存液对dna质量的影响：

为了检验本发明的鱼卵保存液对于保存鱼卵dna质量的影响，分别选取20枚存放12个月的来自乙醇保存液和本发明实施例2的保存液的鱼卵进行测试。提取dna之前进行预处理，即乙醇保存液取出的鱼卵室温条件下置于吸水纸上，至乙醇完全挥发；本发明的保存液取出的鱼卵经双蒸水洗涤2次后吸水纸吸干。经动物基因组dna试剂盒(大连takara公司)提取单个鱼卵dna，进行相同操作完成dna提取过程。利用核酸定量仪nanodrop2000测定dna样品的浓度和纯度，然后以dna条形码引物扩增细胞色素氧化酶coi基因，判定保存液中鱼卵dna的质量。

coi基因引物参照文献(ivanovanv,zemlakts,hannerrh,etal.universalprimercocktailsforfishdnabarcoding.molecularecologynotes,2007,7(4):544-548.)合成，产物长度680bp，引物序列如下：

上游fishf2-t1：tgtaaaacgacggccagtcgactaatcataaagatatcggcac

下游fishr2-t1：caggaaacagctatgacacttcagggtgaccgaagaatcagaa

pcr反应体系为20μl，包含10xbuffer2μl，上引物flshf2-t11μl，下引物flshr2-t11μl，dntp1.6μl，taq酶0.2μl，模板dna3μl，超纯水11.2μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；30个循环×(95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s)；72℃延伸10min。pcr产物检测方法：取5μl的pcr产物，在1.5％琼脂套凝胶和1×tae缓冲液中电泳30min(90v)，4sred染色，在凝胶成像系统拍照观察。

经检测，乙醇保存鱼卵提取的dna的浓度在14～240ng/ml(124±36ng/ml)，od260/280在1.85～2.05范围内；本发明保存液中鱼卵提取的dna的浓度在11～450ng/ml(140±42ng/ml)，od260/280在1.88～2.25范围内；从提取dna数量和质量看，二者有一定差异，但这些数据不足以反应dna质量对后续检测的影响，pcr扩增产物的质量是检测的关键所在。

图2是经本发明实施例2鱼卵保存液中保存了12个月的鱼卵，经dna提取后用dna条形码coi引物扩增结果。扩增产物大小与预期一致(680bp)，产物无杂带，证明保存的鱼卵样品中dna质量良好。对pcr产物进行电泳分析(图2)显示，除了对照外，所有样品dna均在680bp左右有单一的目的条带，表明提取模板质量满足coi基因引物扩增检测的要求，可用于进一步序列分析。对部分pcr产物送往生物公司测序(杭州擎科梓熙生物技术有限公司)，测序结果在genbank和bold数据库进行序列比对，样品最大相似度在97％以上，均能对检测物种进行鉴别认定。从dna提取到pcr扩增产物的检测，本发明保存液ⅰ中鱼卵的dna与乙醇保存液中鱼卵dna质量无差异，且pcr检测证明具有同等效果。因此，本发明的鱼卵保存液可以替代乙醇保存液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。