本发明涉及一种聚乙烯吡咯烷酮溶液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。
背景技术
目前，人类辅助生殖技术中，单精子注射(icsi)前的精子运动减速去自动、胚胎pgd/s活检中样品防粘流程等所采用的溶液仅为hepes或者mops为缓冲的聚乙烯吡咯烷酮盐溶液，这种聚乙烯吡咯烷酮盐溶液不能有效地保持精子的功能，尤其对精子质膜的完整性和钙离子的保护性差，从而导致受精率很低。
牛磺酸(taurine)又称β-氨基乙磺酸，最早由牛黄中分离出来，纯品为无色或白色斜状晶体，无臭。牛磺酸化学性质稳定，不溶于乙醚等有机溶剂，是一种含硫的非蛋白氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成。牛磺酸虽然不参与蛋白质合成，但它却与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关。牛磺酸的药物作用：1、强肝利胆作用：豚鼠实验表明，牛磺酸可解除胆汁阻塞，呈利胆作用；2、解热与抗炎作用：通过对中枢5-ht系统或儿茶酚胺系统的作用降低体温；3、降压作用；4、强心和抗心律失常作用；5、降血糖作用；6、松弛骨骼肌和拮抗肌强直的作用。
丝氨酸又名β羟基丙氨酸，在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。此外，丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。
苏氨酸是一种重要的营养强化剂，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。其制剂具有促进人体发育和抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素——单酰胺菌素的原料。
甘氨酸是内源性抗氧化剂还原性谷胱甘肽的组成氨基酸，机体发生严重应激时常外源补充，有时也称为半必需氨基酸。用于制药工业、生化试验及有机合成，是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必需的一种氨基酸，在分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水中可电离，具有很强的亲水性，但属于非极性氨基酸，溶于极性溶剂，而难溶于非极性溶剂，而且具有较高的沸点和熔点，通过水溶液酸碱性的调节可以使甘氨酸呈现不同的分子形态。
脯氨酸，中性，水中溶解度比任何氨基酸都大，25℃时100g水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物。一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形成4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关。植物体在干旱、高温、低温、盐渍等多种逆境下，常常有脯氨酸的明显积累。脯氨酸在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。
四元羧酸乙二胺四乙酸(edta)，是一种重要的人造有机多元酸络合剂，其最重要的化学性质是能够与各种金属阳离子形成高度稳定的水溶性络合物，因此具有强络合性，可防止金属离子沉淀，阻止金属离子的催化作用，增加溶液中金属离子可获得性，或从系统中去除金属离子。广泛应用于商业和家用洗涤剂、纺织与造纸工艺漂白过程、金属电镀过程、食品工业、医学和农业。
聚乙烯吡咯烷酮简称pvp，是一种非离子型高分子化合物，是n-乙烯基酰胺类聚合物中最具特色，且被研究得最深、广泛的精细化学品品种，已发展成为非离子、阳离子、阴离子3大类，工业级、医药级、食品级3种规格，相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品，并以其优异独特的性能获得广泛应用。pvp作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，但其最具特色，因而受到人们重视的是其优异的溶解性能及生理相容性。在合成高分子中像pvp这样既溶于水，又溶于大部分有机溶剂、毒性很低、生理相溶性好的并不多见，特别是在医药、食品、化妆品这些与人们健康密切相关的领域中，随着其原料丁内酯价格的降低，必将展示其发展的良好前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种各项质控达标的聚乙烯吡咯烷酮溶液，不仅可以有效地保持精子的功能和质膜的完整性，提高辅助生殖技术的受精率，而且，也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种聚乙烯吡咯烷酮溶液，其特征在于：是将牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、螯合剂和聚乙烯吡咯烷酮溶解于含有抗菌素和指示剂的盐溶液中配制而成。
优选的：所述聚乙烯吡咯烷酮溶液，是将牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、螯合剂、聚乙烯吡咯烷酮分别按照0.20-0.25mmol/l、0.05-0.15mmol/l、0.20-0.40mmol/l、0.10-0.50mmol/l、0.10-0.50mm/l、0.01-0.05mmol/l、70-100g/l的浓度溶解于含有抗菌素和指示剂的盐溶液中配制而成。
优选的：所述的螯合剂为四元羧酸乙二胺四乙酸。
优选的：所述抗菌素为庆大霉素，浓度为5-12μg/ml。
优选的：所述指示剂为酚红，浓度5.0-10.0μg/ml。
优选的：所述盐溶液是以hepes或者mops为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/l、氯化钾4.50-4.70mmol/l、硫酸镁0.10-0.25mmol/l、氯化钙1.90-2.20mmol/l、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/l、hepes或者mops18.00-22.00mmol/l、葡萄糖2.60-2.88mmol/l、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/l、乳酸钠21.00-22.66mmol/l、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/l；
优选的：所述盐溶液中的能量物质还包括白蛋白；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于在盐水溶液中制备而成，终浓度为5mg/ml。
所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的制备方法，包括以下步骤：
1、称量好各种组分，备用；
2、配制盐溶液：称量好的组分中，先将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μm滤膜过滤，内毒素＜0.015eu/ml；然后，依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得盐溶液；
3、检测步骤2所得盐溶液的渗透压和ph值，并记录最终渗透压和ph值；所述渗透压保持为250-275mosm/kg，所述ph值保持为7.0-7.4；
4、将牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、螯合剂、聚乙烯吡咯烷酮分别按照0.20-0.25mmol/l、0.05-0.15mmol/l、0.20-0.40mmol/l、0.10-0.50mmol/l、0.10-0.50mm/l、0.01-0.05mmol/l、70-100g/l的溶解于盐溶液中，到充分溶解止；
5、将步骤4所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
a、20-25℃条件下ph值：7.45-7.75；
b、渗透压：117-147mosm/kg；
c、内毒素：＜1.0eu/ml；
d、一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
6、将配置好的溶液在百级gmp车间进行无菌分装和标签。
优选的：所述步骤3中，检测完步骤2所得盐溶液的渗透压和ph值，并记录最终渗透压和ph值后，按照预配置的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为5mg/ml补充到盐溶液中。
有益效果：本发明所述的聚乙烯吡咯烷酮溶液是向盐溶液内添加牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、螯合剂edta和聚乙烯吡咯烷酮，不仅可以有效地保持精子质膜的完整性，而且，edta还可以螯合钙离子，降低精子去自动过程中的钙离子流失，以利于提高精子注射的受精率，也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
具体实施方式
下面结合具体实施实施方式对本发明做进一步说明。
本发明所述的聚乙烯吡咯烷酮溶液，是将牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、螯合剂、聚乙烯吡咯烷酮分别按照0.20-0.25mmol/l、0.05-0.15mmol/l、0.20-0.40mmol/l、0.10-0.50mmol/l、0.10-0.50mm/l、0.01-0.05mmol/l、70-100g/l的浓度溶解于含有抗菌素和指示剂的盐溶液中配制而成。
所述的螯合剂为四元羧酸乙二胺四乙酸；所述抗菌素为庆大霉素，浓度为5-12μg/ml；所述指示剂为酚红，浓度5.0-10.0μg/ml；
所述盐溶液是以hepes或者mops为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/l、氯化钾4.50-4.70mmol/l、硫酸镁0.10-0.25mmol/l、氯化钙1.90-2.20mmol/l、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/l、hepes或者mops18.00-22.00mmol/l、葡萄糖2.60-2.88mmol/l、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/l、乳酸钠21.00-22.66mmol/l、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/l；
所述盐溶液中的能量物质还包括白蛋白；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于在盐水溶液中制备而成，终浓度为5mg/ml。
所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的制备方法，包括以下步骤：
1、称量好各种组分，备用；
2、配制盐溶液：称量好的组分中，先将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μm滤膜过滤，内毒素＜0.015eu/ml；然后，依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得盐溶液；
3、检测步骤2所得盐溶液的渗透压和ph值，并记录最终渗透压和ph值；所述渗透压保持为250-275mosm/kg，所述ph值保持为7.0-7.4；
检测完步骤2所得盐溶液的渗透压和ph值，并记录最终渗透压和ph值后，还可以按照预配置的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为5mg/ml补充到盐溶液中；
4、将牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、螯合剂、聚乙烯吡咯烷酮分别按照0.20-0.25mmol/l、0.05-0.15mmol/l、0.20-0.40mmol/l、0.10-0.50mmol/l、0.10-0.50mm/l、0.01-0.05mmol/l、70-100g/l的溶解于盐溶液中，到充分溶解止；
5、将步骤4所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
a、20-25℃条件下ph值：7.45-7.75；
b、渗透压：117-147mosm/kg；
c、内毒素：＜1.0eu/ml；
d、一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
6、将配置好的溶液在百级gmp车间进行无菌分装和标签。
【存储说明和稳定性】
存储：将分装好的聚乙烯吡咯烷酮溶液存放于2℃-8℃，应尽可能减少液体暴露于co2和空气，以避免7.0或更低的ph水平。不要暴露在高于39℃的温度下。
稳定性：可以直到标签上显示的到期日期。使用无菌程序除去所需体积的产品，一旦移除，不要将任何量的产品返回原始容器；如果产品变色、浑浊或有微生物污染迹象，请勿使用。
为避免污染问题，使用无菌技术进行处理，并在完成操作后丢弃瓶子或小瓶中剩余的任何多余产品。
【具体使用方法】
1、在进行单精子注射(icsi)精子运动减速去自动时，先将所述的聚乙烯吡咯烷酮溶液在icsi皿(icsi皿要覆盖石蜡油)内做成圆形或者长形小滴，然后将少量的精子放入圆形小滴的一侧或者长形小滴的远端，在小滴的另一侧挑选优质的精子，用于单精子注射。
2、胚胎pgd/s活检中样品防粘流程，是将所述的聚乙烯吡咯烷酮溶液在活检皿内做成小滴，用活检针吸取少量的聚乙烯吡咯烷酮溶液即可进行样品活检了。