本发明涉及卵粒超温储存技术领域，尤其是涉及一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂及冷冻方法。
技术背景
在海洋生态系统中，浮游动物种群变化和生产力的高低，对于整个海洋生态系统结构、功能、以及生物资源的补充都具有十分重要的影响。海洋挠桡足类，隶属于节肢动物门（arthropoda）、甲壳亚门（crustacea）、桡足纲（copepoda），为小型甲壳动物，体长<3mm，营浮游、底栖或寄生生活，分布于海洋、淡水或半咸水中，数量极大，种类繁多，既是中、上层经济鱼类的主要摄食对象，又是养殖鱼、虾类幼体的重要开口饵料之一，故在水生态系统食物网和水产养殖中具有重要意义。挠足类的数量变动不仅与渔业的丰歉直接相关，对渔业资源结构有间接的影响，而且，对浮游植物的数量变化有着重要的调控作用，从而影响甚至改变海洋生态系统物流和能流路径和流向。此外，挠足类作为生产力第二环节次级生产力中的重要组成部分，在初级生产和更高营养级之间起着承上启下的重要作用，在海洋生态系统中占有非常重要的位置。由于挠足类在整个海洋生态系统中重要作用，被列入当今一些国际重大研究计划的重点研究内容。因此，实验室条件下对桡足类的养殖是实现对其生物学研究的基础，桡足类成熟卵粒的超低温冷冻是桡足类世代发育和受精卵冻存研究中的一项重要课题。
在超低温冷冻保存过程中，生物细胞会因受到不同类型的损伤（低温冷害、水和冷冻保护剂引起原生质膜内外的渗透压变化、冰晶形成所引起的机械性损伤、冷冻保护剂的化学毒性以及细胞对其的敏感度和耐受性等）而被损坏。目前常用的超低温冷冻方法主要是程序冷冻法和玻璃化冷冻法，前者主要是使用渗透较慢的低温保护剂，使冷冻保护剂充分渗透入细胞内平衡，借助于程序冷冻仪进行缓慢降温，最后再投入到液氮中进行长期保存。玻璃化冷冻法是将细胞使用适合的冷冻保护剂进行短暂处理后，直接投入到液氮中。然而，目前能够检索到的超低温冷冻方法在桡足类受精卵冻存应用上取得的效果（孵化率低下）均不理想。因此，亟待新的超低温冻存方法以解决以上问题。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种各成分能够发挥增益作用，能有效抑制卵粒细胞内冰晶的形成，减弱冰晶对卵粒的损伤程度，提高桡足类卵粒的孵化率，改善冻融后卵粒的发育潜能的用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂。
本发明的目的之一在于提供一种能配合冷冻保护剂的施用，有效控制卵粒的渗透压变化，避免胞内冰冰的形成，降低了桡足类卵粒的冰晶损伤的用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂，包含含有l-(-)-海藻糖的海藻糖和含卵粒的海水。l-(-)-海藻糖的存在能够在冷冻过程中促进海藻糖在卵粒的失水部位与蛋白质和膜脂质形成氢键，同时l-(-)-海藻糖中的羟基也能和膜磷脂中的磷酸根结合反应而将卵粒细胞周围内的水分置换释放胞外，加快了胞内水分的排出速率，降低了胞内冰晶形成的体积，从而减弱了冰晶对卵粒的损伤程度，此外，l-(-)-海藻糖还能和使用还能和乙二醇、甘油、二甲基亚砜发挥增益作用，大大降低溶液的凝固点，保证卵粒能够有充足的时间将细胞内水分适当性的渗出，避免胞内冰的形成，使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率和发育潜能。
优选的，海藻糖中含有0.21-0.25%的l-(-)-海藻糖。
优选的，含卵粒的海水中卵粒的密度为950-1100粒/ml，海水为经过预处理的天然海水，其盐度为2.7-3.5%。
优选的，海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后加入含有d-半胱氨酸的半胱氨酸和抗坏血酸钠，并且期间连续充气24-36h，最后调节海水的盐度，即可。该海水的预处理步骤能够有效地对天然海水中进行灭菌处理，杀灭海水中的各种病原性微生物，使经过除杂、灭菌、充气、调配盐度后的海水更加适合桡足类卵粒的低温储存。
进一步优选，半胱氨酸中含有0.4-0.7%的d-半胱氨酸。
进一步优选，半胱氨酸和抗坏血酸钠的添加量分别为0.25-0.33mg/l和0.07-0.15mg/l。本发明用特别配比的半胱氨酸能够和抗坏血酸钠发挥协同作用，能够中和灭菌过程用氧化剂或产生的具有氧化作用的物质，避免氧化剂的存在对桡足类卵粒的影响，提高卵粒的孵化率，此外用特别配比的半胱氨酸和抗坏血酸钠预处理过的海水能够刺激桡足类卵粒对温度的敏感度，能够和冷冻保护剂中的其他成分增益，增大细胞膜的渗透性，使得卵粒细胞内的水份能够快速除去，能有效抑制卵粒细胞内冰晶的形成，有效降低了超低温对卵粒的损伤。
优选的，冷冻保护剂包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水80-110份、乙二醇1.2-3.8份、甘油2.1-4.3份、二甲基亚砜0.6-1.2份、海藻糖1.2-2.5份。本发明冷冻保护剂配方由多种渗透性保护剂和单一非渗透性保护剂组合而成，为联合冷冻保护剂，能够发挥增益作用，有效降低了低温冷害和卵粒细胞内因脱水不完全所引起原生质膜内外的渗透压变化、冰晶形成而对桡足类卵粒造成的机械性损伤，能避免超低温储存对桡足类卵粒中染色体的重新排列产生影响而导致纺锤体异常，提高桡足类卵粒的孵化率，改善冻融后卵粒的发育潜能。
本发明还公开一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻方法，利用上述冷冻保护剂进行多级冷冻，其具体步骤为：
步骤1：向含卵粒的海水中加入甘油和一半的乙二醇，搅拌混匀，然后在25-45min内将混合液的温度匀速降温至2-5°c，备用；
步骤2：向步骤1得混合液中加入剩余的乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖，搅拌混匀，然后在85-120min内匀速降温至-85至-75°c，备用；
步骤3：将步骤2得混合液在120-160min内匀速降温至-200至-190°c，然后转移至液氮中保存。本发明多级冷冻程序配合冷冻保护剂的施用，有效控制了卵粒的渗透压变化，有效地和冷冻保护剂结合起来，避免胞内冰冰的形成，降低了桡足类卵粒的冰晶损伤，使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率和发育潜能。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明冷冻保护剂有效降低了低温冷害和卵粒细胞内因脱水不完全所引起原生质膜内外的渗透压变化、冰晶形成而对桡足类卵粒造成的机械性损伤，能避免超低温储存对桡足类卵粒中染色体的重新排列产生影响而导致纺锤体异常，提高桡足类卵粒的孵化率，改善冻融后卵粒的发育潜能；2）本发明多级冷冻程序配合冷冻保护剂的施用，有效控制了卵粒的渗透压变化，有效地和冷冻保护剂结合起来，避免胞内冰冰的形成，降低了桡足类卵粒的冰晶损伤，使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率和发育潜能。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂，包含含有l-(-)-海藻糖的海藻糖和含卵粒的海水。l-(-)-海藻糖的存在能够在冷冻过程中促进海藻糖在卵粒的失水部位与蛋白质和膜脂质形成氢键，同时l-(-)-海藻糖中的羟基也能和膜磷脂中的磷酸根结合反应而将卵粒细胞周围内的水分置换释放胞外，加快了胞内水分的排出速率，降低了胞内冰晶形成的体积，从而减弱了冰晶对卵粒的损伤程度，此外，l-(-)-海藻糖还能和使用还能和乙二醇、甘油、二甲基亚砜发挥增益作用，大大降低溶液的凝固点，保证卵粒能够有充足的时间将细胞内水分适当性的渗出，避免胞内冰的形成，使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率和发育潜能。
海藻糖中含有0.25%的l-(-)-海藻糖；含卵粒的海水中卵粒的密度为1100粒/ml，海水为经过预处理的天然海水，其盐度为3.5%。
上述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后加入含有d-半胱氨酸的半胱氨酸和抗坏血酸钠，并且期间连续充气36h，最后调节海水的盐度，即可。该海水的预处理步骤能够有效地对天然海水中进行灭菌处理，杀灭海水中的各种病原性微生物，使经过除杂、灭菌、充气、调配盐度后的海水更加适合桡足类卵粒的低温储存。
其中，半胱氨酸中含有0.7%的d-半胱氨酸；半胱氨酸和抗坏血酸钠的添加量分别为0.33mg/l和0.15mg/l。用特别配比的半胱氨酸能够和抗坏血酸钠发挥协同作用，能够中和灭菌过程用氧化剂或产生的具有氧化作用的物质，避免氧化剂的存在对桡足类卵粒的影响，提高卵粒的孵化率，此外用特别配比的半胱氨酸和抗坏血酸钠预处理过的海水能够刺激桡足类卵粒对温度的敏感度，能够和冷冻保护剂中的其他成分增益，增大细胞膜的渗透性，使得卵粒细胞内的水份能够快速除去，能有效抑制卵粒细胞内冰晶的形成，有效降低了超低温对卵粒的损伤。
上述冷冻保护剂包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水110份、乙二醇3.8份、甘油4.3份、二甲基亚砜1.2份、海藻糖2.5份。该冷冻保护剂配方由多种渗透性保护剂和单一非渗透性保护剂组合而成，为联合冷冻保护剂，能够发挥增益作用，有效降低了低温冷害和卵粒细胞内因脱水不完全所引起原生质膜内外的渗透压变化、冰晶形成而对桡足类卵粒造成的机械性损伤，能避免超低温储存对桡足类卵粒中染色体的重新排列产生影响而导致纺锤体异常，提高桡足类卵粒的孵化率，改善冻融后卵粒的发育潜能。
一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻方法，利用上述冷冻保护剂进行多级冷冻，其具体步骤为：
步骤1：向含卵粒的海水中加入甘油和一半的乙二醇，搅拌混匀，然后在45min内将混合液的温度匀速降温至5°c，备用；
步骤2：向步骤1得混合液中加入剩余的乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖，搅拌混匀，然后在120min内匀速降温至-75°c，备用；
步骤3：将步骤2得混合液在160min内匀速降温至-190°c，然后转移至液氮中保存。本发明多级冷冻程序配合冷冻保护剂的施用，有效控制了卵粒的渗透压变化，有效地和冷冻保护剂结合起来，避免胞内冰冰的形成，降低了桡足类卵粒的冰晶损伤，使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率和发育潜能。
实施例2：
一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂，具体包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水100份、乙二醇3份、甘油3份、二甲基亚砜1份、海藻糖2份。
其中，海藻糖中含有0.22%的l-(-)-海藻糖；含卵粒的海水中卵粒的密度为1000粒/ml，海水为经过预处理的天然海水，其盐度为3.0%。
上述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后加入含有d-半胱氨酸的半胱氨酸和抗坏血酸钠，并且期间连续充气30h，最后调节海水的盐度，即可，上述半胱氨酸中含有0.55%的d-半胱氨酸；半胱氨酸和抗坏血酸钠的添加量分别为0.29mg/l和0.11mg/l。
一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻方法，利用上述冷冻保护剂进行多级冷冻，其具体步骤为：
步骤1：向含卵粒的海水中加入甘油和一半的乙二醇，搅拌混匀，然后在30min内将混合液的温度匀速降温至4°c，备用；
步骤2：向步骤1得混合液中加入剩余的乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖，搅拌混匀，然后在100min内匀速降温至-80°c，备用；
步骤3：将步骤2得混合液在150min内匀速降温至-196°c，然后转移至液氮中保存。
用本实施例方法冷冻氏纺锤水藻成熟卵粒，其效果检验为：
以上配方及程序冻存1d、2d、4d和7d的卵粒孵化率依次为59.4%、58.7%、54.6%和53.9%。
实施例3：
一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂，具体包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水80份、乙二醇1.2份、甘油2.1份、二甲基亚砜0.6份、海藻糖1.2份。
其中，海藻糖中含有0.21%的l-(-)-海藻糖；含卵粒的海水中卵粒的密度为950粒/ml，海水为经过预处理的天然海水，其盐度为2.7%。
上述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后加入含有d-半胱氨酸的半胱氨酸和抗坏血酸钠，并且期间连续充气24h，最后调节海水的盐度，即可，上述半胱氨酸中含有0.4%的d-半胱氨酸；半胱氨酸和抗坏血酸钠的添加量分别为0.25mg/l和0.07mg/l。
一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻方法，利用上述冷冻保护剂进行多级冷冻，其具体步骤为：
步骤1：向含卵粒的海水中加入甘油和一半的乙二醇，搅拌混匀，然后在25min内将混合液的温度匀速降温至2°c，备用；
步骤2：向步骤1得混合液中加入剩余的乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖，搅拌混匀，然后在85min内匀速降温至-85°c，备用；
步骤3：将步骤2得混合液在120min内匀速降温至-200°c，然后转移至液氮中保存。
对比例1：
冻存对象：汤氏纺锤水藻成熟卵粒；
冷冻保护剂包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水100份、乙二醇3份、甘油3份、二甲基亚砜1份、海藻糖2份。海水为经过预处理的天然海水，其盐度为3.0%；上述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后，并且期间连续充气30h，最后调节海水的盐度，即可。
冷冻方法的具体步骤为：
步骤1：向含卵粒的海水中加入甘油和一半的乙二醇，搅拌混匀，然后在30min内将混合液的温度匀速降温至4°c，备用；
步骤2：向步骤1得混合液中加入剩余的乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖，搅拌混匀，然后在100min内匀速降温至-80°c，备用；
步骤3：将步骤2得混合液在150min内匀速降温至-196°c，然后转移至液氮中保存。
效果检验：
以上配方及程序冻存1d、2d、4d和7d的卵粒孵化率依次为52.2%、50.4%、46.7%和46.1%。
对比实施例2和对比例1可知，实施例2用冷冻保护剂和冷冻程序配合的施用，能够降低了桡足类卵粒的冰晶损伤，大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率。
对比例2：
冻存对象：汤氏纺锤水藻成熟卵粒；
冷冻保护剂包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水100份、乙二醇3份、甘油3份、二甲基亚砜1份、海藻糖2份。海水为经过预处理的天然海水，其盐度为3.0%；上述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后加入含有d-半胱氨酸的半胱氨酸和抗坏血酸钠，并且期间连续充气30h，最后调节海水的盐度，即可，上述半胱氨酸中含有0.55%的d-半胱氨酸；半胱氨酸和抗坏血酸钠的添加量分别为0.29mg/l和0.11mg/l。
冷冻方法的具体步骤和实施例2一致。
效果检验：
以上配方及程序冻存1d、2d、4d和7d的卵粒孵化率依次为55.1%、53.7%、50.9%和50.6%。
对比实施例2和对比例2可知，实施例2用海藻糖中l-(-)-海藻糖的存在能够大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率和发育潜能。
对比例3：
冻存对象：汤氏纺锤水藻成熟卵粒；
冷冻保护剂包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水100份、乙二醇3份、甘油3份、二甲基亚砜1份、海藻糖2份。海藻糖中含有0.22%的l-(-)-海藻糖，海水为经过预处理的天然海水，其盐度为3.0%；上述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后，并且期间连续充气30h，最后调节海水的盐度，即可。
冷冻方法的具体步骤和实施例2一致。
效果检验：
以上配方及程序冻存1d、2d、4d和7d的卵粒孵化率依次为56.2%、54.1%、51.2%和50.7%。
对比实施例2和对比例3可知，半胱氨酸和抗坏血酸钠预处理过的海水能够和冷冻保护剂中的其他成分增益，能有效抑制卵粒细胞内冰晶的形成，有效降低了超低温对卵粒的损伤。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。