本发明涉及植物农药技术，更具体地说，是涉及一种抑杀植物病原真菌的植物提取物活性成分及其制备方法与应用。
背景技术：
植物病害是影响农业生产的一个重要因素，不同的病原菌能够导致多种作物产生疾病，这对农业经济造成了很大的损失。镰刀菌属的真菌够引起多种植物产生各种病害，在全球快速地出现发展，对全球的农业生产安全带来了很大的危害。它能够在土壤中度过一年四季，并能侵染多种植物，包括经济作物，粮食作物，观赏植物和药用植物。能引起植物发生多种病害，例如根腐，茎腐，花腐，穗腐等多种病害，寄主植物高达上百种，侵染植物的维管束系统，破坏负责疏导的组织维管束。为了抑杀植物病原真菌，人们很早就研发出了抑杀植物病原真菌的农药，很快便开始商业化生产，农药的快速发展对农产品的产量带来了丰厚的效益。早期抑杀植物病原真菌的农药都是化学农药，但随着化学农药的不断推广使用，它所造成的危害也是不容忽视的。大量使用化学农药会对环境造成严重的污染，会对非靶标的生物造成伤害，农药的残留物也会对人类的健康产生危害。随着人们的生活品质的提高，对食品安全也更加重视。因此为了能够使农业得到可持续健康发展，开发出对环境和人类健康没有危害的新农药成为了农药研究的重点任务，生物农药成为了现代农业发展的研究热点，而在生物农药中植物源农药是一个重要的领域。因为植物源农药具有以下特点：地球植物资源丰富，而且种类繁多；与化学农药不同的是，植物源的生物农药的针对性比较强，不会对非靶标的生物造成伤害；植物源提取物成分复杂，各活性成分间还会有协同作用，不同活性成分对病害的作用靶位不同，所以相对于化学农药采用植物源生物农药时，病害对农药不容易产生抗药性；因为植物源农药自身是来源于自然，所以能够自然的消解于自然，不会产生对环境具有破坏性的物质，因此开发出高效的生物农药对于保护生态环境，人畜健康都有重要的意义。
技术实现要素：
针对现有的植物抑杀植物病原真菌的制剂品种甚少的现状，本发明旨在提供一种可用于制备抑杀植物病原真菌的新制剂，且制剂生物活性高、对非靶标生物安全、环境相容性好的无花果叶活性成分，以及该活性成分的制备方法与应用。
本发明提供的抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分，为由无花果叶先通过乙醇浸提再通过乙酸乙酯或正己烷萃取所得到的膏状无花果叶活性成分。即无花果叶活性成分可以是以乙酸乙酯为萃取剂对以乙醇为萃取溶剂萃取无花果叶得到的提取物进行再提取得到的精提取物，也可以是以正己烷为萃取剂对以乙醇为萃取溶剂萃取无花果叶得到的提取物进行再提取得到的精提取物，甚至还可以是以乙醇为萃取剂萃取无花果叶得到的总提取物。总提取物和精提取物都可以用于制备抑杀植物病原真菌的活性成分，优先选用膏状的精提取物。
本发明提供的抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分，可通过包括以下步骤的方法进行制取：
(1)将干燥粉碎的无花果叶以乙醇为萃取溶剂于18-24℃浸提12-24小时，然后在45-50℃超声浸提4-8小时，使无花果叶中的活性成分充分浸出，固液分离，收集浸提液；
(2)将收集到的浸提液于45-55℃水浴浓缩，得到膏状无花果叶总提物，并回收作为萃取溶剂的乙醇；
(3)将浓缩得到的膏状无花果叶总提物再用乙酸乙酯或正己烷于18-24℃萃取12-24小时，使无花果叶中的活性成分充分浸出，固液分离，收集萃取液；
(4)将收集的萃取液于30-40℃真空下浓缩，得到膏状的成品无花果叶活性成分。
在上述制取抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分的方法中，步骤(1)固液分离得到的叶渣最好进一步地用乙醇在超声波下继续浸提4-8小时，固液分离，分离得到的浸提液与步骤(1)得到的浸提液合并，进入步骤(2)。
在上述制取抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分的方法中，步骤(3)固液分离得到的固渣最好进一步地用乙酸乙酯或正己烷继续萃取12-24小时，固液分离，分离后得到的萃取液与步骤(3)得到的浸提液合并，进入步骤(4)。用乙酸乙酯或正己烷继续对固渣进行萃取后分离所得到的残渣，可用乙酸乙酯或正己烷洗涤至洗涤液无色。
在上述制取抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分的方法中，步骤(2)所得到的膏状无花果叶总提物未送入步骤(3)处理之前，最好于1-10℃环境下保存。如果步骤(2)所得到的膏状无花果叶总提物接到就送入步骤(3)进行处理，则不需要特别保存。
在上述制取抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分的方法中，步骤(1)中萃取溶剂乙醇的用量优选控制为无花果叶原料体积的5-10倍；步骤(3)中萃取剂乙酸乙酯或正己烷的用量优先控制为固渣体积的7-15倍。
上述制取抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分的方法，作为萃取溶剂的乙醇优选选用体积分数不低于75％的乙醇；进一步优选体积分数90-98％的乙醇。
本发明提供的所述抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分，可用于制备抑杀链格孢菌，厚孢镰刀菌，大刀镰刀菌，油菜菌核菌，禾谷镰刀菌，尖孢镰刀菌，三线镰刀菌，炭疽病菌，灰葡萄孢菌，稻根霉菌，枝孢霉菌的制剂。
本发明得到的浸膏状无花果叶总提物和精提物可用于n,n-二甲基甲酰胺溶解后直接用于制备抑杀植物病原真菌的制剂。只是总提物抑杀植物病原真菌效果较精提物抑杀植物病原真菌效果低一些。
本发明揭示的抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分可用于制备抑杀植物病原真菌和蘑菇病原真菌制剂，特别适用于制备抑杀油菜菌核菌、镰刀菌属真菌、链格孢菌、稻根霉菌等制剂。
本发明揭示的抑杀植物病原真菌的无花果叶活性成分，可制备成水剂、可溶性粉剂、可湿性粉剂、浓悬剂和粒剂等剂型的植物病原真菌抑杀制剂。各种剂型的制备方法为本领域的常规方法，各剂型制备过程中所用助剂为农药领域中的常用助剂。各剂型在使用时所配置的溶液，其中无花果叶提取物的浓度应在0.1mg/ml-1000mg/ml的范围内。
本发明提供的无花果叶活性成分对链格孢菌，无花果叶原料来源广泛，对人体无毒，对作物无害，作为植物源抑杀真菌剂有易降解的特点，因此有望开发为一种无公害的植物源抑杀真菌制剂。
附图说明
图1为三种浸膏对三种病原真菌的抑制作用图。
图2是f1-f11组分对大刀镰刀菌的抑菌活性图。
具体实施方式
以下通过实施例描述本发明的具体实施方式，对本发明的内容再做进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明的保护范围仅限于实例，相反，基于本发明的内容所实现的技术应用均属于本发明的保护范围。
活性测定是在离体的条件下，采用生长速率法测定所制备样品对病原真菌的抑菌活性，供试菌为链格孢菌(alternariaalternate)，厚孢镰刀菌(fusariumchlamydosporum)，大刀镰刀菌(fusariumculmorum)，油菜菌核菌(sclerotiniasclerotiorum)，禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)，尖孢镰刀菌(fusariumoxysporium)，三线镰刀菌(fusariumtricinctum)，炭疽病菌(colletotrichumhigginsianum)，灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)，稻根霉菌(rhizopusoryzae)，枝孢霉菌(cladosporiumcladosporioides)。
实施例1：无花果叶总提取物，
(1)将干燥无花果叶粉碎后过40目筛，得到无花果叶粉末。
(2)取相当于原料质量约7倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇在室温(温度一般在18-24℃范围)下浸提约20h(一般控制范围为12-24h)。
(3)在约50℃下超声波6h(一般控制范围为4-8h)。用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。
(4)将残渣再用相当于原料质量约6倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇进一步超声提取6h(一般控制范围为4-8h)，使无花果叶中的活性成分充分提出，用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。
(5)合并滤液，滤液用旋转蒸发仪在约50℃(一般控制范围为45-55℃)水浴下浓缩，得到浸提浓缩膏，4℃保存。
(6)取少量无花果叶浓缩膏，用n,n-二甲基甲酰胺配制成浓度为0.05g/ml溶液作为实验备用样品。
实施例2：正己烷萃取物的制备及抑菌活性测定
(1)将干燥无花果叶粉碎后过40目筛，得到无花果叶粉末。
(2)取相当于原料质量约7倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇在室温(温度一般在18-24℃范围)下浸提约20h(一般控制范围为12-24h)。
(3)在约50℃下超声波6h(一般控制范围为4-8h)。用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。
(4)将残渣再用相当于原料质量约6倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇进一步超声提取6h(一般控制范围为4-8h)，使无花果叶中的活性成分充分提出，用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。
(5)合并滤液，滤液用旋转蒸发仪在约50℃(一般控制范围为45-55℃)水浴下浓缩，得到浸提浓缩膏，4℃保存。
(6)在无花果叶醇浸提浓缩膏中加入其10倍体积的正己烷萃取，滤纸过滤得滤液，向剩余固体中再次加入适当体积的正己烷重复萃取，滤纸过滤得滤液。直到萃取液到无色为止，然后将所得到的滤液用旋转蒸发仪在35℃下进行真空浓缩得到无花果叶醇提物的正己烷萃取浸膏
(7)取少量无花果叶浸膏，用n,n-二甲基甲酰胺配制成浓度为0.05g/ml溶液作为实验备用样品。
实施例3乙酸乙酯萃取物
(1)将干燥无花果叶粉碎后过40目筛，得到无花果叶粉末。
(2)取相当于原料质量约7倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇在室温(温度一般在18-24℃范围)下浸提约20h(一般控制范围为12-24h)。
(3)在约50℃下超声波6h(一般控制范围为4-8h)。用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。
(4)将残渣再用相当于原料质量约6倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇进一步超声提取6h(一般控制范围为4-8h)，使无花果叶中的活性成分充分提出，用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。
(5)合并滤液，滤液用旋转蒸发仪在约50℃(一般控制范围为45-55℃)水浴下浓缩，得到浸提浓缩膏，4℃保存。
(6)在无花果叶醇浸提浓缩膏中加入其10倍体积的乙酸乙酯进行萃取，滤纸过滤得滤液，向剩余固体中再次加入适当体积的乙酸乙酯重复萃取，滤纸过滤得滤液。直到萃取液到无色为止，然后将所有得到的滤液用旋转蒸发仪在35℃下真空浓缩获得无花果叶醇提物的乙酸乙酯萃取浸膏。
(7)取少量无花果叶浸膏，用n,n-二甲基甲酰胺配制成浓度为0.05g/ml溶液作为实验备用样品。
三种提取物的抑菌活性测定
生物活性的测定：在离体条件下，采用菌丝生长速率法测定无花果叶提取物的抑菌活性。分别取实验备用样品(质量浓度为0.05g/ml)配制培养基，配制浓度为1.0mg/ml。待平板凝固后在平皿中央接入已培养好的、生长一致的植物病原真菌菌饼(大刀镰刀菌，油菜菌核菌，链格孢菌)，以加入无菌水培养基接种后作为空白对照(ck)，每个处理设3个重复，26℃下恒温培养箱中培养，至对照培养皿菌落即将长满培养皿时记录数据。每个菌落按照十字交叉法测量两次，以平均数代表其菌落的大小，抑菌率的计算公式如下：
菌落直径(mm)＝菌落平均直径－菌饼直径(6.0mm)
抑菌率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)÷对照菌落直径×100％
实验结果如表1，图1所示所示：
表1无花果叶三种浸膏对三种病原真菌的抑菌率
e*代表无花果叶醇提物，e/a*代表无花果叶醇提物乙酸乙酯萃取物,e/h*代表无花果叶醇提物正己烷萃取物。
从表1可以看出无花果叶的三种浸膏对链格孢菌，大刀镰刀菌，油菜菌核菌都有抑制作用，但其抑制程度都不相同。其中无花果叶乙酸乙酯萃取物对三种病原真菌的抑制作用最强，醇提物的抑制效果次之，抑菌效果见图1。当药基浓度为1.0mg/ml时，无花果叶乙酸乙酯萃取物萃取物对链格孢菌，大刀镰刀菌，油菜菌核菌的生长抑制率分别为72.7％，87.4％，100％。说明无花果叶的有效成分存在于乙酸乙酯萃取物中。
实施例4无花果叶乙酸乙酯萃取物的生物活性测定
⑴取膏状无花果叶乙酸乙酯萃取物用n,n-二甲基甲酰胺配制成浓度为0.05g/ml药液作为实验备用样品，以链格孢菌，厚孢镰刀菌，大刀镰刀菌，油菜菌核菌，禾谷镰刀菌，尖孢镰刀菌，三线镰刀菌，炭疽病菌，灰葡萄孢菌，稻根霉菌，枝孢霉菌为供试菌种，测定不同药液浓度下的抑菌活性。抑菌活性测定方法同实施例1。
实验结果如表2所示：
表2无花果叶乙酸乙酯萃取物对11种病原真菌菌丝生长的抑制作用
注：抑菌率为药液浓度在1.0mg/ml时测定。
由表可以看出无花果叶乙醇总提物乙酸乙酯萃取物对11种病原真菌均具有一定的抑制效果，其中对油菜菌核菌的抑制率达到了100％，
实施例5无花果叶乙酸乙酯萃取物活性成分分离及活性测定
1、用薄层色谱摸索对无花果叶乙酸乙酯萃取物的最佳分离条件，将硅胶板在烘箱中于100℃下活化30min，冷却后用铅笔在距硅胶板底部边缘1厘米处轻描一条细线，用玻璃点样毛细管吸取无花果叶e/a萃取物母液，点于硅胶板上，然后分别用乙酸乙酯，乙酸乙酯和石油醚混合液，乙酸乙酯和甲醇的混合液作为展开剂检测最佳的分离方案，等到展开剂的前沿跑到距硅胶板顶端约1厘米左右时，取出硅胶板，在254nm紫外灯下观察谱带，分析最佳的分离条件。
2、无花果叶e/a萃取物常柱压初分离，
(1)装柱：用石油醚将硅胶粉制成悬浮液倒入柱子中，然后一直用石油醚洗脱，直到柱子中的硅胶粉压实后，向柱内加入少量石英砂，使其均匀平铺于硅胶粉上，继续向柱子中加入石油醚，当柱内液面降低到比石英砂表面高大约2cm时，关闭柱子。
(2)上样：将样品沿色谱柱管壁均匀的加到石英砂层上，然后用石油醚把柱子上的残留样品冲洗进柱内，向柱内加入少量石英砂，使其均匀平铺于样品，打开活塞使柱内溶剂流出，当液面和柱面相平时，关闭活塞。
(3)洗脱：采用梯度洗脱法，先按乙酸乙酯-石油醚(10:1,5:1)的比例依次加入柱子，然后用乙酸乙酯-甲醇(100:1,50:1,25:1,5:1,1:1)的比例依次加入柱子，最后用甲醇洗脱，洗脱的流速为4-5滴每秒，根据情况每30-50ml收集一管。洗脱的同时，将收集到的液体采用薄层色谱法进行鉴定，将在254nm紫外照射下相同薄层色谱迁移率的液体合并在一起，最后共得到11个组分，命名为f1-f11。最后将11个组分用旋转蒸发仪在50℃水浴下进行浓缩得到浸膏。
(4)生物活性的测定：在离体条件下，采用菌丝生长速率法测定11个组分的抑菌活性。11个组分各取0.4mg，用n,n-二甲基甲酰胺完全溶解配成11种药液。用24孔板法测定11种药液的抗真菌活性，第一个空加入等体积的n,n-二甲基甲酰胺，作为阴性对照组，后面依次加入11种药液，然后向12个孔中分别加入400μl的还处于液体状态的pda培养基，使其与药液充分混合。培养基冷却凝固后，采用打孔器(4mm)截取新鲜的大刀镰刀菌菌丝块，接种到制作好的培养基中间。等到空白对照组的菌丝长满平板时，观察用药处理组的菌丝生长情况，计算抑菌率方法如实施例1。
实验结果如图2所示。从图2可以看出f5组分对大刀镰刀菌表现了明显的抑制作用。说明无花果叶中具有抗真菌活性的化合物在f5组分中。
实施例6无花果叶乙酸乙酯萃取物活性成分分析
(1)采用气相色谱-质谱的方法对具有抗真菌活性的f5组分成分进行分析。色谱条件为采用气相色谱-质谱的方法对无花果叶醇提物及e/a萃取物成分进行分析[29]。柱箱温度：40.0℃；进样温度：290.00℃；进样模式：分流；流量控制模式：压力；压力：49.5kpa；总流量：9.0ml/min；柱流量：1.00ml/min；线速度：36.1cm/sec；吹扫流量：3.0ml/min；分流比：5.0；高压进样模式：关；载气节省器：关；分流阻尼固定：关；
柱温箱温度程序：
[gc程序]
[gcms-qp2010plus]
离子源温度：200.00℃；接口温度：220.00℃；溶剂延迟时间：3.00min；检测器增益方式：相对；检测器增益：0.00kv；阀值：0。谱库为：nist08.lib。
实验结果如表3所示：
表3f5组分的gc/ms分析结果
从表3可以看出f5组分分析得出其主要化合物有6种(见表2.3)。其中乙酸羽扇醇酯(lup-20(29)-en-3-ol,acetate,(3b)-)的含量最高为27.02％，其次为β-谷甾醇(β-sitosterol)，含量是17.31％。补骨脂素(psoralen)的含量也比较高为8.11％。剩余的3种化合物的含量较低，分别为佛手柑内酯(4-methoxy-7h-furo[3,2-g]chromen-7-one，7.61％)，十七烷酸(margaricacid，6.95％)，4-methyl-2-oxo-2h-chromene-7-carbaldehyde(5.05％)。可以初步判断无花果叶乙酸乙酯萃取物中的主要抗真菌活性成分可能为补骨脂素，乙酸羽扇醇酯，β-谷甾醇。