一种苹果砧木T337组培苗生根诱导的方法与流程

本发明属于苹果苗木栽培技术领域，具体涉及一种苹果砧木t337组培苗生根诱导方法。

背景技术

苹果是人们日常生活中常见的、也是较为重要的水果品种之一。针对苹果的栽培模式，近三十多年来发生了重大的变化，作为较为先进的欧洲和美国等苹果生产大国，已经由乔砧栽培模式转向矮砧密植栽培模式，这样不仅节约了种植空间，降低了种植成本，也便于机械化管理，还可以有效地提高苹果生产的产量和品质。

就中国苹果栽培而言，中国苹果的栽培面积和产量均位于世界首位。而另一方面，目前乔砧果园所占比重较大，而由于矮砧密植栽培的优点，因此新建果园以矮砧密植栽培为主。在矮砧品种中，苹果m9-t337矮化砧木因具有矮化、早成花和易成花的特点，大面积在新建苹果园中应用，因此针对m9-t337矮化砧木苗木的需求量也大幅增加。但是受到气候环境、管理条件等因素的影响，现有m9-t337矮化砧木苗木仍主要由育苗企业通过压条繁育技术生产的t337自根苗为主。但这种生产方式，其生产周期相对较长，并且生产成本较高，无法充分满足市场需求。

组培是一种人工控制条件下可一年四季生产、并短时间内获得大量组培苗的快繁技术。但苹果组培过程中，生根难是苹果组培快繁的主要技术障碍之一，因此限制了组培快繁技术在苹果组培苗繁育中的应用。为此，极有必要就现有苹果组培技术进行进一步研究改进，从而为苹果的种植生产奠定技术基础。

技术实现要素：

本申请主要目的在于提供一种苹果砧木t337组培用组合培养基及利用该培养基的生根诱导方法，从而为组培快繁技术在苹果生产中的应用奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种苹果砧木t337组培用组合培养基，该组合培养基包括继代培养基、诱导生根培养基和根系生长培养基，具体而言：

所述继代培养基配方为：ms培养基+1.0~4.0mg/l6-ba+0.1~0.3mg/lnaa+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

优选为：ms培养基+2.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

所述诱导生根培养基配方为：1/2ms培养基+0.3~0.9mg/liba+20g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

优选为：1/2ms培养基+0.3mg/liba+20g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

所述根系生长培养基配方为：1/2ms培养基+25g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

具体应用时，首先将苹果砧木t337外植体在继代培养基中诱导成苗，然后将组培苗接种入诱导生根培养基中暗培养，再转接至根系生长培养基中培养生根。

利用所述苹果砧木t337组培用组合培养基的组培苗生根诱导的方法，具体包括如下步骤：

（1）外植体诱导成苗，并进行继代培养

按现有技术，将苹果砧木t337的外植体诱导形成组培幼苗，并进行继代培养15~25d左右以进行扩繁；

继代培养后选择生长健壮、高度不小于1.5cm的植株用于后续生根诱导；

继代培养时，继代培养基设计为：

ms培养基+2.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

对于继代培养中，生长势弱、高度小于1.5cm的幼苗植株，可进一步转接至中继培养基中进一步培养30d左右，以促进幼苗生长；

所述中继续培养基设计为：

ms培养基+0.6~2.4mg/l6-ba+0.5~1.0mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

优选为：ms培养基+1.8mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

继代培养过程中，环境条件要求为：光照时间16h/d、光照强度2000lux，温度25℃，空气湿度70%-80%；

（2）诱导生根

将步骤（1）中继代培养后生长健壮、高度不小于1.5cm的组培幼苗接种入诱导生根培养基中，暗培养6~8d，以诱导形成根原基；

环境条件要求为：温度25℃，空气湿度70%-80%；

（3）根系生长

将步骤（2）中诱导形成根原基后组培幼苗转接至根系生长培养基中培养30~50d左右，以促进根系生长和延长；

环境条件要求为：光照时间16h/d、光照强度2000lux，温度25℃，空气湿度70%-80%；

（4）炼苗、移栽

将步骤（3）中生根后幼苗转移至炼苗室适应3d后，洗掉根部残留的培养基，将根系在1000倍液可湿性粉剂多菌灵中蘸5s左右，栽植在栽培基质（草炭：珍珠岩：蛭石=3:1:1）中；

对植株进行适当遮盖保湿处理，以减缓幼苗叶片的蒸腾作用，例如用透明塑料杯盖在植株上；

炼苗期间保持基质80%以上的含水量，每隔7d给苹果砧木t337苗喷施一次1000倍液的多菌灵；15d后逐渐降揭开保湿杯降低湿度，待生根苗顶梢开始生长之后即可移出炼苗室进行移栽；

炼苗期间炼苗室的环境要求为：光照时间16h/d、光照强度5000lux，温度25℃，空气湿度70%-80%。

总体而言，本申请对于苹果砧木t337快繁过程中的部分关键技术、尤其是生根诱导技术进行了深入探讨和改进。初步实验效果表明，经过对相关培养基和培育步骤优化后，m9-t337砧木的生根率得到了显著提高，表现出较好的应用效果，因此本申请的相关技术方案可为苹果砧木t337的快速、高效繁殖奠定良好的技术基础。

附图说明

图1为不同iba浓度对生根的影响，其中a：ms；b：ms+0.3mg/liba；c：ms+0.6mg/liba；d：ms+0.9mg/liba；e：ms+1.2mg/liba；

图2为不同浓度ms及iba对生根的影响，其中a：1/2ms；b：1/2ms+0.3mg/liba；c：ms；d：ms+0.3mg/liba。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。

实施例

在介绍具体技术方案前，需要解释的是，由于本申请主要针对苹果砧木t337组培苗诱导生根技术进行深入探讨，因此就相关组培过程中未详述技术内容参考现有常规技术即可。

本申请针对苹果砧木t337组培苗诱导生根的总体技术方案如下所述。

（1）外植体诱导成苗，并进行继代培养

按现有技术，将苹果砧木t337的外植体诱导形成组培幼苗，并进行继代培养20d左右以进行扩繁；

继代培养后选择生长健壮、高度不小于1.5cm的植株用于后续生根诱导；

继代培养时，继代培养基设计为：

ms培养基+2.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

对于继代培养中，生长势弱、高度小于1.5cm的幼苗植株，可进一步转接至中继培养基中进一步培养30d左右，以促进幼苗生长；

所述中继续培养基设计为：

ms培养基+1.8mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

继代培养过程中，环境条件要求为：光照时间16h/d、光照强度2000lux，温度25℃，空气湿度70%-80%；

（2）诱导生根

将步骤（1）中继代培养后生长健壮、高度不小于1.5cm的组培幼苗切除基部的愈伤组织接种入诱导生根培养基中，暗培养7d，以诱导形成根原基；

所述诱导生根培养基配方为：1/2ms培养基+0.3mg/liba+20g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

环境条件要求为：温度25℃，空气湿度70%-80%；

（3）根系生长

将步骤（2）中诱导形成根原基后组培幼苗转接至根系生长培养基中培养40d左右，以促进根系生长和延长；

环境条件要求为：光照时间16h/d、光照强度2000lux，温度25℃，空气湿度70%-80%；

所述根系生长培养基配方为：1/2ms培养基+25g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8；

（4）炼苗、移栽

将步骤（4）中生根后幼苗转移至炼苗室适应3d后，洗掉根部残留的培养基，将根系在1000倍液可湿性粉剂多菌灵中蘸5s左右，栽植在栽培基质（草炭：珍珠岩：蛭石=3:1:1）中；

对植株进行适当保湿处理，以减缓幼苗叶片的蒸腾作用，例如用透明塑料杯盖在植株上；

炼苗期间保持基质80%以上的含水量，每隔7d给苹果砧木t337苗喷施一次1000倍液的多菌灵；15d后逐渐降揭开保湿杯降低湿度，待生根苗顶梢开始生长之后即可移出炼苗室进行移栽；

炼苗期间炼苗室的环境要求为：光照时间16h/d、光照强度5000lux，温度25℃，空气湿度70%-80%。

发明人认为，上述苹果砧木t337组培苗诱导生根过程中，部分关键技术在于继代培养、诱导生根培养、根系延长生长过程中培养基中生长激素的浓度及其组合，为此，在上述技术方案基础上，发明人进一步对相关技术参数进行了优化探讨，具体过程简要介绍如下。

（一）继代培养用继代培养基

为探讨不同继代培养基对于后续扩繁影响，将苹果砧木t337组培幼苗分别接种在不同激素浓度组合的继代培养基中，进行继代扩繁。

需要解释和说明的是，继代培养基均以ms培养基作为基础，均含有0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂；具体组培过程中，参考上述技术方案描述，仅进行步骤（1）中的继代培养，以增殖系数来评价继代培养基的扩繁效果，不再进行后续的诱导生根等后续组培过程。

继代培养基中不同激素浓度组合及最终扩繁效果如下表1所示。

表1，继代培养基中不同浓度激素组合对扩繁影响

注:结果中数值后面的不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

对上表结果进行分析可以看出，在naa浓度保持相同时，随着6-ba浓度升高，增殖系数呈现先升高后降低趋势，而在6-ba浓度保持相同时，较低浓度naa对于增殖显然是较为有利的。而以最终增殖系数作为评价标准时，最适激素浓度组合为：2.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa；也即：最适继代培养基为：

ms培养基+2.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8。

（二）壮苗用中继培养基

参考前述总体技术方案描述，将继代培养后株高为0.5cm～1.0cm之间的组培苗分别接种到不同激素浓度的中继培养基中进行壮苗，以探讨最适培养基。

需要说明的是，中继培养基均以ms培养基作为基础，均含有30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂；具体组培过程中，参考上述技术方案描述，仅进行步骤（1）中的中继培养以壮苗，中继培养30d后，观察记录组培苗的株高及生长情况。

中继培养基中不同浓度激素组合及对组培幼苗影响情况具体如下表2所示。

表2，中继培养基总不同浓度激素组合对m9-t337壮苗的影响

对上表结果分析可以看出，过高naa浓度对于组培幼苗影响显然较大，而6-ba浓度对于组培幼苗生长影响随着使用浓度升高呈现先正向后负向的影响，因此，6-ba使用浓度显然也并非越高越好。综合而言，最适中继培养基为：

ms培养基+1.8mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8。

（三）诱导生根培养基

为确定诱导生根时最佳激素组合，参考前述总体技术方案描述，将继代培养后株高1.5cm以上的组培苗接种到不同浓度iba激素的诱导生根培养基中，先暗培养一周，然后进行正常的光照培养（不进行转接操作，直接进行培养，即，不采用前述总体技术方案中的根系延长生长培养），40d后观察统计组培苗的生根率、生根数和平均生根数，以此来评价不同浓度的诱导效果，从而探讨确定最适浓度。

需要解释和说明的是，不同浓度iba激素的诱导生根培养基均以1/2ms培养基为基础培养基，均含有20g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，制备培养基时iba在高压灭菌前加入到培养基。

具体不同浓度iba激素设置情况及对诱导生根影响结果如下表3所示。

表3，不同iba浓度对组培幼苗生根的影响

注：表中总根数为接种30株组培幼苗的总根数。

具体诱导生根情况如图1所示。对上表数据进行分析可以看出，iba在低浓度情况下可较好促进生根，但过高浓度则抑制了生根。因此，最适的诱导生根培养基配方为：1/2ms培养基+0.3mg/liba+20g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph=5.6～5.8。

（四）根系延长生长

由于iba激素对于根系发育具有一定的负向左右，因此，对于前述生根诱导培养基是否适合进一步的根系生长延长需要进一步进行探讨。因此为确定诱导生根后根系延长生长时的最佳培养基，参考前述总体技术方案描述，将继代培养后株高1.5cm以上的组培苗先接种到诱导生根培养基（1/2ms培养基+0.3mg/liba+20g/l蔗糖+6.5g/l琼脂）中暗培养一周，然后分别转接到不同类型培养基中，进行根系延长生长培养，在培养至40d后观察统计组培苗的生根率、生根数和平均生根条数。

具体转接培养基类型及对根系延长生长影响结果如下表4所示。

表4，不同培养基类型（培养基中均含有25g/l蔗糖+6.5g/l琼脂）对根系延长生长影响

注：表中总根数为转接接种30株组培幼苗的总根数。

具体生根情况如图2所示。对上表进行分析可以看出，转接后，培养基不含iba时对于根系延长生长更为有利，而就培养基类型而言，1/2ms培养基显然较ms培养基更能促进根系生长，生根条数最多，并且有二级侧根出现。因此，最适根系延长生长培养基为：1/2ms培养基+25g/l蔗糖+6.5g/l琼脂。