一种基于耐草甘膦的水稻直播种植方法与流程

本发明属于农业种植技术和基因工程育种相互交叉的领域，具体涉及一种基于耐除草剂的水稻直播种植方法。

技术背景

近年来，随着城镇化发展，农村外出务工造成劳动力缺乏，劳动力成本上升；同时生产资料价格的上升，粮价基本维持不变，水稻种植的比较效益日益低下，水稻田抛荒现象日趋严重。水稻生产的稳定关系我国的粮食安全。水稻直播技术突破了传统精细耕作制度对劳动力的依赖，能大幅度地减轻劳动强度，降低劳动成本，十分顺应农村城镇化发展对创新耕作制度的要求。据统计，直播技术在全世界的栽种面积已经超过7.5亿亩，有逐渐替代旧耕作体系的趋势。直播稻主要生产优势是：适合规模化、集约化经营。节省了育秧以及移栽时的拔秧、运秧、栽秧等环节的用工，操作简便，且直播对土壤的翻耕次数减少，因而减少了对土壤结构的破坏。

水稻直播技术要解决的最重要问题是稻田杂草危害。我国稻田杂草种类数有近200种（李燕敏等，2017），直播稻田杂草危害是主要减产因素，研究表明，1株/m²的杂草稻密度可导致水稻减产9.15%，7株/m²时可造成水稻减产超过50%（温广月等，2011）；稗草密度达到13.33株/m²时，可以使水稻减产50%以上（朱文达等，2005）；当双穗雀稗密度达到10株/m²时，水稻减产36%，密度达35株/m²时，水稻减产达65%以上（何占祥等，1993）。培育抗除草剂水稻是水稻直播技术推行的重要环节。将抗除草剂水稻与直播免耕技术相配套，可以从根本上解决稻田“草害”问题，将极大地推进新耕作制度的发展。

另外，每年农业生产排放的温室气体占全球年排放量的14%，是导致气候变化的重要原因。根据研究，将抗除草剂水稻与直播免耕技术相配套有助于减少二氧化碳排放，减少了农业源的温室气体排放，对于降低全球温室效应有促进作用（邱龙等，2012）。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于耐草甘膦的水稻直播种植方法，将抗除草剂水稻与直播免耕技术相配套，可以从根本上解决稻田“草害”问题，将极大地推进新耕作制度的发展。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明是通过以下步骤实现的：将耐除草剂基因导入水稻品种，使得水稻获得耐草甘膦特性；以获得耐草甘膦特性的水稻为材料通过转育方法将耐草甘膦特性转移到直播水稻品种中获得适合于直播的耐草甘膦水稻品种；或者通过杂交方法将耐除草剂水稻恢复系与不育系配组获得的耐草甘膦杂交水稻品种。

具体方法如下：

1.耐除草剂水稻是一种利用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道或利用crisp/cas9方法等公知方法获得的对草甘膦具有高耐受性的水稻直播品种的直播栽培方法。本发明所述的耐除草剂基因可以是，但不限于epsps、aroa、cp4等，或者通过crisp/cas9方法获得的耐草甘膦基因。

2.适合于直播的水稻品种包括常规稻和杂交稻。以获得的耐草甘膦水稻为转育材料，通过常规育种方法将耐草甘膦性状转移到直播常规稻品种，如黄华占、福稻88、徐稻3号、桂农粘、金农丝苗、广源占16号等水稻，或者以耐草甘膦水稻为父本，直播水稻为母本，配置的耐草甘膦直播水稻杂交种。

3.直播田平整，采用拖拉机翻耕或旋耕种植田深度5～7cm，泡水1-2天后，再次用拖拉机翻耕或旋耕，打浆耙地找平，达到百米高低落差小于5-7cm，施足底肥、整平、做畦、畦宽1.2米，留工作沟30-40cm，排水至畦面无明显积水、待播种。

4.浸种催芽，是采用37℃温水浸种24小时（保温），控干至不滴水，置于37℃中催芽24小时，至种子破口露白。

5.播种，播种量5-10kg/亩，将露白的种子均匀撒播，播种后用压种板将种子压入泥土。

6.喷施草甘膦：喷施除草剂为草甘膦，待种子发根5-7天后，第一次喷施草甘膦，采用41%的草甘膦异丙胺盐，喷施浓度参照商品推荐浓度，保持畦面复水2-3cm。待稻苗长到进入分蘖初期时，第二次喷施售41%的草甘膦异丙胺盐，浓度和用量参照商品推荐浓度。

7.田间水肥管理。播种前施底肥，复合肥（15-15-15）40公斤/亩播种后保持田面湿润不积水。2周后施促苗肥，亩施肥量50kg复合肥；8周后施一次追肥促进花芽分化，亩施肥量50kg复合肥；播种后10周，再追一次促花肥，亩施15gk钾肥+5gk尿素追肥促进抽穗开花。整个生长季注意病虫害防治。

本发明的有益效果：

本发明提供的水稻的直播种植方法是一种基于耐草甘膦水稻品种的栽培方法，借助所育品种的耐草甘膦特性，通过喷施草甘膦方法达到迅速杀灭稻田杂草的目的，彻底解决直播水稻栽培的草害问题。由于草甘膦是一种非选择性除草剂，可以杀灭田间所有杂草，本发明的实施可以有效避免目前直播水稻栽培过程中需要选择多种除草剂进行组合除草的弊端，极大地简化了栽培管理措施，彻底解决了直播水稻过程中的草害问题，不仅提高稻谷产量也降低施药和劳动力成本，同时还可以结合农田机械的使用，提高生产力，提高生产效益。

使用耐除草剂水稻品种进行直播栽培，理论上，稻谷每亩增产32.56kg/亩，按国家公布的2017年稻谷最低收购价（国家粮食和物质储备局门户网站www.chinagrain.gov.cn）晚籼稻谷72元/kg计,每亩增收88.56元。节约人工费用270元/亩。节约用药成本7元/亩。三项合计增收365.56元/亩。此外直播栽培比移栽栽培节省了秧田的使用，进一步提高了土地利用，降低成本。

附图说明

图1萌发种子对草甘膦的耐受性。

图2幼苗对草甘膦的耐受性。

图3三叶期秧苗对草甘膦的耐受性。

图4分蘖期水稻对草甘膦的耐受性。

具体实施方式

具体方法如下：

1.耐除草剂水稻是一种利用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道或利用crisp/cas9方法等公知方法获得的对草甘膦具有高耐受性的水稻直播品种的直播栽培方法。本发明所述的耐除草剂基因可以是，但不限于epsps、aroa、cp4等，或者通过crisp/cas9方法获得的耐草甘膦基因。

2.适合于直播的水稻品种包括常规稻和杂交稻。以获得的耐草甘膦水稻为转育材料，通过常规育种方法将耐草甘膦性状转移到直播常规稻品种，如黄华占、福稻88、徐稻3号、桂农粘、金农丝苗、广源占16号等水稻，或者以耐草甘膦水稻为父本，直播水稻为母本，配置的耐草甘膦直播水稻杂交种。

3.直播田平整，采用拖拉机翻耕或旋耕种植田深度5～7cm，泡水1-2天后，再次用拖拉机翻耕或旋耕，打浆耙地找平，达到百米高低落差小于5-7cm，施足底肥、整平、做畦、畦宽1.2米，留工作沟30-40cm，排水至畦面无明显积水、待播种。

4.浸种催芽，是采用37℃温水浸种24小时（保温），控干至不滴水，置于37℃中催芽24小时，至种子破口露白。

5.播种，播种量5-10kg/亩，将露白的种子均匀撒播，播种后用压种板将种子压入泥土。

6.喷施草甘膦：喷施除草剂为草甘膦，待种子发根5-7天后，第一次喷施草甘膦，采用41%的草甘膦异丙胺盐，喷施浓度参照商品推荐浓度，保持畦面复水2-3cm。待稻苗长到进入分蘖初期时，第二次喷施售41%的草甘膦异丙胺盐，浓度和用量参照商品推荐浓度。

7.田间水肥管理。播种前施底肥，复合肥（15-15-15）40公斤/亩播种后保持田面湿润不积水。2周后施促苗肥，亩施肥量50kg复合肥；8周后施一次追肥促进花芽分化，亩施肥量50kg复合肥；播种后10周，再追一次促花肥，亩施15gk钾肥+5gk尿素追肥促进抽穗开花。整个生长季注意病虫害防治。

实施例1耐草甘膦转基因水稻的制备

1.1.菌株和质粒

根癌农杆菌菌株lba4404由本实验室保存，质粒为上述构建的质粒。

1.2培养基

①基本培养基（nb）：(n6大量、b5微量、ms铁盐、b5维生素、脯氨酸500mg.l-1、水解酪蛋白30mg.l-1、谷氨酰氨250mg.l-1、蔗糖3%、phytagel2.0~2.5g，ph5.8；

②诱导培养基：nb+2，4-d2mg.l^-1，ph5.8；

③aam培养基：aam无机盐、ms铁盐、b5维生素、aam氨基酸、水解酪蛋白300mg.l^-1、乙酰丁香酮（as）100μm、葡萄糖6%、蔗糖3%，ph5.2；

④共培养培养基：诱导培养基+乙酰丁香酮（as）100μm，ph5.8；

⑤筛选培养基1：诱导培养基+hgromycin30mg.l-1l+carbencilin250mg.l^-1，ph5.8；

⑥筛选培养基2：诱导培养基+hgromycin50mg.l^-1；

⑦分化培养基：nb+10mg.l^-1kt+0.4naamg.l^-1，ph5.8；

⑧生根培养基：1/2ms+蔗糖3%+phytagel2.0~2.5g.l^-1，ph5.8；

⑨农杆菌培养基为yeb。

1.3根癌农杆菌转化

水稻花后10-15天的未成熟种子幼胚，接种于诱导培养基，28℃暗培养，待盾片膨大至黄豆大小，掐块诱导愈伤组织。愈伤每15天继代培养1次，从第3代开始挑选生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。

工程菌单菌落转接于yeb固体培养基上（附加kan和rif各50mg/l）划线28℃暗培养两天，用适量添加有100um/l乙酰丁香酮aam培养基将菌液洗脱，悬浮于添加有100um/l乙酰丁香酮的20mlaam培养基中，剧烈摇动1min后，28℃温育1-2h，调整菌液浓度至1.5～2.0od（600nm）用于水稻转化。

挑出预培养后的胚性愈伤于灭菌三角瓶中，加入农杆菌菌液浸泡30min，用无菌滤纸吸干多余菌液后接于共培养基上，28℃暗培养3d。挑取共培养后的愈伤用无菌水冲洗3-5次，然后转入含250mg/l羧卞青霉素的无菌水浸泡60min，于无菌滤纸上晾干。接种于筛选培养基上，3周后即可见瘤状抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。挑选抗性愈伤转移含50mg/l潮霉素筛选培养基上进一步筛选，10～14后至分化培养基上，28℃16h光/暗培养，1个月后分化小苗，将小苗转接至生根培养基上，2周后幼苗生根，移至温室盆载。

实施例2新型耐除草剂水稻材料的鉴定和检测

1材料与方法

1.1dna提取

采用ctab法提取dna。取5g水稻叶片用液氮研磨成细粉，加入10ml65℃预热的ctab提取液，摇匀65℃保温30min。加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀后在10000rpm离心10min，上清液用预冷的异丙醇沉淀dna，将dna吸出用70%乙醇洗2遍，超净台上吹干后溶于超纯水中，电泳定量。

1.2水稻pcr检测

所用epsp基因引物序列为5’-gcagttggaccatcagcgaag-3’和3’-ctgttgagaaggatgcgaaaga-5’，扩增片断长度为742bp。

1.3转基因水稻草甘膦耐受性检测

转基因水稻萌发种子的抗性检测：种子37℃浸种2d，充分吸胀后，于31℃催芽3d，挑出萌发种子置于培养皿中，倒入不同浓度的纯品草甘膦(sigma)，28℃，16h/8h光/暗培养。观察转基因水稻种子对草甘膦耐受性。实验设以下几个浓度：草甘膦(0mmol/l,0.05mmol/l,0.1mmol/l,0.15mmol/l,0.20mmol/l,0.25mmol/l)，每皿30粒，每个处理3皿，7d后观察拍照根生长情况。

1.4田间转基因水稻草甘膦耐受性检测

5月30日浸种，37℃催芽，2天后播种。在三叶期喷2倍商品推荐使用浓度41%草甘膦，10天后观察记载存活克隆。7月5日插秧，株行踞20cm×20cm，每行7株，7月19日分蘖期，分蘖期喷除草剂，喷施3倍商品推荐使用浓度41%草甘膦，10天后观察记载存活克隆，7月29日调查，记载、拍照。

2结果

2.1转基因水稻的分子检测

对t1代转化植株进行了epep、epsp102的pcr扩增。epep、epsp102扩增中，所有转基因植株均可扩增出792bp条带；非转基因明恢86无相应条带。

2.2萌发种子对草甘膦的耐受性

为了确定转基因萌发种子对草甘膦的耐受性，将浸种至破口露白的种子置于不同浓度的草甘膦溶液中，28℃培养7d后观察：非转基因对照在各浓度的草甘膦溶液中只有胚轴和芽鞘伸长而无根的生长(预备实验显示在0.01mmol/l时有部分发育正常)。转基因萌发种子在0.15mmol/l以下的各浓度中能够生长出正常的叶片、主根和须根。但当草甘膦浓度大于或等于20mmol/l时，小苗的芽、叶形态正常，而根的生长被抑制(图1)。

2.3幼苗对草甘膦的抗性

为了确定转基因水稻苗期对草甘膦的耐受性，将种子播于育秧盘，长至3叶期时，用微量喷雾器喷施不同浓度草甘膦（草甘膦浓度为商品推荐使用浓度的0,3,4,5倍量），通过统计小苗在喷施不同浓度的草甘膦后存活的比率，检测转基因植株对草甘膦的耐受性。结果显示：草甘膦浓度在3倍量时，转基因水稻100%的植株存活，但有一些老叶枯黄；当浓度达到4倍量时，只有45%的存活率；当浓度达到5倍量时，所有植株均死亡(图2)。三叶期秧田喷施3倍商品推荐使用浓度41%草甘膦，10天后观察记载存活株系。结果见图3。

2.4分蘖期对草甘膦的耐受性

分蘖期喷除草剂，喷施3倍商品推荐使用浓度41%草甘膦，10天后观察记载存活株系。结果见图4。

实施例3新型耐除草剂水稻直播栽培

1材料与方法

以转epsps水稻恢复系ep3为材料，以受体明恢86为对照，试验安排在土壤质地均匀、肥力中等、排灌方便的田块进行。

1.1实验设计

设喷草甘膦、不喷草甘膦（施用苄嘧磺隆4.7%+丙草胺35.3%可湿性粉剂60g/亩。）二个处理，每个小区面积7.5m²。喷草甘膦处理具体为：6月1日、7月5日各喷一次41%草甘膦（药水比：1:150），喷草甘膦每处理3个小区，不喷草甘膦的6个小区，在不喷草甘膦的6个小区中3个小区为非转基因对照明恢86，3个小区为ep3。

1.2实验实施

试验田准备：选取土壤质地均匀、肥力中等、排灌方便的田块为实验小区。2017年5月7日拖拉机首次翻耕，5月14日进行次翻，5月16日耙平，保证田块不出现积水窝，以保证出苗率和出苗整齐一致，耙平后沉降，再开排灌沟。直播前1天排干积水；按照完全随机区组排列、3次重复，在丈量画点后拉线弹压划出小区、走道和保护行，插立各区组小区内品种标牌。具体条件为采用拖拉机翻耕或旋耕种植田深度7cm，泡水2天后，再次用拖拉机翻耕或旋耕，打浆耙地找平，达到百米高低落差小于7cm，施足底肥、整平、做畦、畦宽1.2米，留工作沟40cm，排水至畦面无明显积水、待播种。

5月16日浸种：采用37℃温水浸种24小时（保温），控干至不滴水，5月18日催芽：置于37℃中催芽24小时，1天后种子露白，5月19日播种（播种量5-10kg/亩，将露白的种子均匀撒播，播种后用压种板将种子压入泥土），采用生产通用的撒播方式播种，所有小区均由经验丰富的同一人播种。播种尽可能均匀一致，注意播满整个小区，不留边角。播种后用压种板压种,换品种时保持压种板不带种，防止人为混杂。

喷施草甘膦：喷施除草剂为草甘膦，待种子发根7天后，第一次喷施草甘膦，采用41%的草甘膦异丙胺盐，喷施浓度参照商品推荐浓度，保持畦面复水3cm。待稻苗长到进入分蘖初期时，第二次喷施售41%的草甘膦异丙胺盐，浓度和用量参照商品推荐浓度。

田间管理:播种后及时在试验田四周设置防鸟网，并做好防鼠工作。施肥管理：6月13日施50kg/亩复合肥，8月10施15kg/亩钾肥+5kg/亩尿素。及时防治病虫害。水分管理：间歇灌溉、干湿交替。

1.3性状考察及产量测定

采用定面积查苗，成熟期每小区随机取10株按单株分别测算株高、结实率、千粒重、单株重。产量测定：收割每个小区所有植株，脱粒，烘干后称干谷重，再换算成亩产。

2结果

2.1生育期及农艺性状

为了解转基因水稻农艺性状，按单株分别测算株高、结实率、千粒重、单株重，比较分析不同处理差异情况。试验结果显示：喷草甘膦与不喷草甘膦的处理株高没有显著性差异；ep3穗数比明恢86显著增多，但不同处理的ep3没有显著差异；喷草甘膦与不喷草甘膦的处理结实率没有显著性差异；ep3的千粒重比明恢86略重，但喷草甘膦与不喷草甘膦的处理没有显著差异。

2.2产量评估

成熟期，收割每个小区所有植株，脱粒，晒干、称干谷重，再换算成亩产。结果见表，由表可见：不喷草甘膦处理的ep3和明恢863个小区平均产量无差异；喷草甘膦处理小区平均产量4.43kg，三个处理折合亩产分别为361.12kg、361.12kg和393.68kg，ep3喷草甘膦处理比对照增加产量32.56kg/亩。

2.3成本估算

节约用药成本：不喷草甘膦处理在整畦后及苗期需要施用2次（苄嘧磺隆4.7%+丙草胺35.3%），亩施量2包/次，每包5元，整个生长期用量计4包，共计20元；喷草甘膦处理，亩施量41%草甘膦水剂400ml/次，共需要喷2次，合计用药量800ml，草甘膦每升16.25元，整个生长季共用药800ml计13元。两者相比较喷草甘膦处理节约用药成本7元/亩。

稻谷增收：抗草甘膦水稻ep3喷草甘膦处理每亩产量估算393.68kg，其对照明恢86每亩产量估算361.12kg，抗草甘膦水稻ep3喷草甘膦处理比对照增产32.56kg/亩，按国家公布的2017年稻谷最低收购价（国家粮食和物质储备局门户网站www.chinagrain.gov.cn）晚籼稻谷72元/kg计,每亩增收88.56元。

节约人工费用：直播栽培比移栽栽培在移栽环节节省2个人工，按150元/人天计算，节约人工成本300元；整个生长期喷草甘膦2次，2x0.1人工/亩=0.2个人工，计30元；扣除喷药人工费。实际节约人工费用270元。

三项合计增收365.56元/亩。此外直播栽培比移栽栽培节省了秧田的使用，进一步提高了土地利用，降低成本。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。