一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜M-CDX模型及制备方法与流程

本发明涉及生命科学领域，其具体是一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型及制备方法。

背景技术

肿瘤动物模型作为人类肿瘤的复制，是肿瘤研究中不可缺少的手段，随着近代医学发展，特别是肿瘤学和免疫学研究的需要，免疫缺陷动物的出现解决了移植肿瘤的免疫排斥问题，人体肿瘤移植于免疫缺陷动物，能保持其生物学特性，对于研究人体肿瘤的机制，药物筛选提供了很大帮助。

cn103239479a提供了一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法，该方法包括：将收集的临床病例皮肤鳞状细胞癌组织制成单细胞悬液，分离出cd31-cd24-cd45-cd61-cd133+肿瘤干细胞群，再和1×10⁶人原代成纤维细胞，1×10⁶人原代内皮细胞悬混在基质胶中，再将其注射至经人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境中。

为了了解恶性肿瘤在体的生物学行为特点，往往需要构建肿瘤在体模型模拟肿瘤真实生存环境。鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoicmembrance,cam）在发育的早中期不排斥来自异种动物的组织、细胞移植，因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。cam模型已广泛应用于新生血管生成、微循环、肿瘤生物学等方面的研究。

membrane-basedcell-derived×enograft（m-cdx）基于膜的细胞来源的异体移植，即，将异种物种的肺癌细胞系移植到鸡胚绒毛尿囊膜中构建的模型。此模型可用于血管新生与肿瘤发生发展的互相作用，以及筛选有效抗肿瘤化合物的研究。

传统的cdx模型，荷瘤载体一般是裸鼠，裸鼠移植瘤可以保存原有组织学构造或各种功能，且将人癌组织的组织培养物移种于裸鼠时，能重现已在组织培养中消失的原有的癌结构。这些特征有助于分析人类肿瘤的性质，从而推动各方面的工作，为实验肿瘤学提供新的有效的工具。但是，由于裸鼠的饲养和繁殖要求条件比较严格，价格比较昂贵，相关裸鼠移植肿瘤模型存在一定局限性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型及制备方法，此模型为将异种物种的肺癌细胞移植到鸡胚绒毛尿囊膜中构建而成的，制备方法包括将肺癌细胞种植在鸡胚绒毛尿囊膜上后，在适合条件下孵育过3天，用显微镜镜检。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型，包括鸡胚绒毛尿囊膜中移植有异种物种的肺癌细胞的鸡胚。

优选地，所述异种物种为人。

优选地，所述肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型应用于抗肺癌药物筛选。

一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型的制备方法，包括：

步骤1：将胚蛋在温度为35℃-40℃、湿度为60%-80%的培养箱中孵育2-4天，在胚蛋顶端剪开1cm×1cm窗口；

步骤2：将（0.5-8）×10⁶数量的处理好的肺癌细胞掺入细胞外基质，制成细胞悬液，滴加到事先放于绒毛尿囊膜上的硅胶圈内，在温度35℃-40℃、湿度为50%-65%条件下孵育3天，得到肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型。

优选地，在步骤1中，将胚蛋在温度为37℃，湿度为70%的培养箱中孵育3天。

优选地，在步骤2中，使用4×10⁶数量的肺癌细胞。

优选地，在步骤2中，温度37℃、湿度60%条件下孵育3天。

优选地，在步骤2中，所述细胞外基质与细胞悬液的比例为1：（1-5）。

优选地，在步骤2中，所述细胞外基质为结构蛋白、蛋白聚糖、粘连糖蛋白中的一种或几种混合。

优选地，在步骤2中，所述细胞外基质为粘连糖蛋白中的纤连蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以鸡胚为模型，以肺癌细胞为移植对象构建肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型；

m-cdx荷瘤的载体是一层带有丰富血管的绒毛尿囊膜，比起传统模型，具有实验周期短，饲养成本低，以及方便操作等独特优势；

本制备方法所需操作器械、实验器材均简单易用，价格低廉，普通实验室可以常规配备，而制取过程又操作简便，无需长时间经验积累。

附图说明

图1为本发明制得的肝癌细胞m-cdx荷瘤在显微镜下结构形态图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

选择相同周期的健康的胚蛋60只，分别编号，分为a、b、c三组，每组20只。

实施例1

一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型由鸡胚绒毛尿囊膜中移植有肺癌患者的肺癌细胞的鸡胚构成，其建立方法为：

（1）将a组的20只胚蛋在温度为37℃，湿度为60%的培养箱中孵育3天，用开壳器轻轻插入胚蛋顶端，慢慢地撑开双壳，注意不要破坏外胚蛋的完整性，用剪刀沿壳边缘向壳顶方向剪取长款各1cm的窗口；

（2）将4×10⁶范围内的肺癌细胞掺入结构蛋白内，用离心机在4℃下，保持1500r/min，离心5min制备细胞悬液；

（3）将细胞悬液滴加到事先放于绒毛尿囊膜上的硅胶圈内，置入37℃、60%湿度的培养箱中孵育3天后，得到肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型。

将20只胚蛋分为10组模型，每组模型2只胚蛋；定时观察每个胚蛋内移植的肺癌细胞，当模型中的鸡胚绒毛尿囊膜上出现成瘤数量大于1时，确定模型建立成功，a组中出现成瘤的模型为5组，成瘤率为50％。

将实施例1制得的m-cdx荷瘤在显微镜下观察、记录，数码显微镜拍照，得到m-cdx荷瘤的结构形态图，如图1所示，对外套膜各层组织细胞的形态位置和结构变化进行观察，肺癌细胞与绒毛尿囊膜对比明显；显微镜下可见膜各层组织细胞结构完整，组织细微结构清晰、特征明显，能较准确显示各层组织细胞的细微结构及其在外套膜各部位的分布情况。

实施例2

一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型由鸡胚绒毛尿囊膜中移植有肺癌患者的肺癌细胞的鸡胚构成，其建立方法为：

（1）将b组的20只胚蛋在温度为36℃，湿度为65%的培养箱中孵育4天，胚蛋完整无残缺，将开壳器轻轻插入胚蛋顶端，慢慢地撑开双壳，用剪刀沿壳边缘向壳顶方向剪取长款各1cm的窗口；

（2）将5×10⁶范围内的肺癌细胞掺入蛋白聚糖内，用离心机在6℃下，保持2000r/min，离心6min制备细胞悬液；

（3）将细胞悬液滴加到事先放于绒毛尿囊膜上的硅胶圈内，置入38℃、55%湿度的培养箱中孵育3天后，得到肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型。

将20只胚蛋分为10组模型，每组模型2只胚蛋；定时观察每个胚蛋内移植的肺癌细胞，当模型中的鸡胚绒毛尿囊膜上出现成瘤数量大于1时，确定模型建立成功，b组中出现成瘤的模型为6组，成瘤率为60％。

实施例3

对比例，肺癌细胞来源于肺癌中期的小鼠。

一种肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型由鸡胚绒毛尿囊膜中移植有肺癌小鼠的肺癌细胞的鸡胚构成，其建立方法为：

（1）将c组的20只胚蛋在温度为36℃，湿度为65%的培养箱中孵育4天，胚蛋完整无残缺，将开壳器轻轻插入胚蛋顶端，慢慢地撑开双壳，用剪刀沿壳边缘向壳顶方向剪取长款各1cm的窗口；

（2）将6×10⁶范围内的肺癌细胞掺入蛋白聚糖、粘连糖蛋白的1：1的混合液内，用离心机在6℃下，保持2000r/min，离心6min制备细胞悬液；

（3）将细胞悬液滴加到事先放于绒毛尿囊膜上的硅胶圈内，置入38℃、55%湿度的培养箱中孵育3天后，得到肺癌鸡胚绒毛尿囊膜m-cdx模型。

将20只胚蛋分为10组模型，每组模型2只胚蛋；定时观察每个胚蛋内移植的肺癌细胞，当模型中的鸡胚绒毛尿囊膜上出现成瘤数量大于1时，确定模型建立成功，c组中出现成瘤的模型为7组，成瘤率为70％。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。