本发明属于油菜杂交种子生产技术领域，具体而言，涉及一种利用波里马细胞质雄性不育系、或常规自交系(或常规品种)与同时具有自交不亲和特性和因乙酰乳酸合成酶基因突变导致对磺酰脲类除草剂抗性的波里马细胞质雄性不育恢复系、或常规自交系(或常规品种)生产杂交f1种子的杂交制种方法。
背景技术
油菜杂种优势显著，一般可增产20％-30％，好的组合杂交后增产幅度可达50％，因此杂交油菜推广应用飞速发展，仅我国杂交油莱的面积已占油莱总面积的70％以上。杂种优势利用是提高作物产量的重要途径。油菜杂种优势利用途径很多，主要有细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、自交不亲和、化学杀雄等。其中，在细胞质雄性不育中，波里马细胞质雄性不育是一类重要的细胞质雄性不育类型。在化学杀雄中，目前生产上利用的化学杀雄剂主要是含有低浓度苯磺隆的混合物。研究证明，苯磺隆的靶标是乙酰乳酸合成酶，高浓度的苯磺隆溶液可以杀死油菜，低浓度的苯磺隆溶液可以诱导雄性不育，而对油菜生长没有明显影响。当乙酰乳酸合成酶基因某些位点发生突变后，油菜会产生对苯磺隆的抗性。
目前，油菜波里马细胞质雄性不育杂交f1种子制种方法是将波里马细胞质雄性不育系(母本)与恢复系(父本)按一定的行比在田间种植，种子成熟时于雄性不育系(母本)上收获f1杂交种子。化学杀雄杂交f1种子制种方法是将自交系甲(或常规品种甲)(母本)与自交系乙(或常规品种乙)(父本)按一定的行比在田间种植，在现蕾初期喷施1次含苯磺隆的配方杀雄剂，间隔15-20天后再喷一次，种子成熟时于自交系甲(或常规品种甲)(母本)上收获f1杂交种子。无论是利用波里马细胞质雄性不育系、还是化学杀雄生产f1杂交种，其缺点是在种植时需要将母本和父本按一定的行比分开种植，收获时也要分开收割，或者在父本谢花后先将父本砍掉，种子成熟时于母本上收获f1杂交种子。同时，在种子收获过程中需要严格监管，以避免将父本种子混入母本上所结的杂交f1种子中。显然，现有方法费时费力，劳动成本较高。另外，波里马细胞质雄性不育系的育性常常受到温度的影响，会产生数量不等的可育花粉，由此不育系会自交或兄妹交结实，导致f1种子纯度下降，会有一定的生产风险。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服已有技术的不足，提供一种简化的利用波里马细胞质雄性不育系、或常规自交系(或常规品种)生产油菜杂交f1种子方法。
为了实现本发明的目的，发明人结合多年的油菜雄性不育杂交研究经验，最终获得了如下简单高效的技术方案：
一种简化的油菜杂交f1种子的制种方法，该方法包括选用波里马细胞质雄性不育系、或常规自交系(或常规品种)(统称母本)与同时具有自交不亲和特性和因乙酰乳酸合成酶基因突变导致对磺酰脲类除草剂抗性的恢复系、或自交系(或常规品种)(统称父本)生产杂交f1种子的杂交制种方法，其具体方法为，在隔离条件下，将母本与父本种子按特定比例混合，将混合均匀的种子播种于油菜制种区的田里，在现蕾初期喷施1次含磺酰脲类除草剂的配方杀雄剂，间隔15-20天后再喷施1次，成熟时将母本和父本混收，生产获得杂交f1种子。
进一步优选地，上述方法中所述的母本和父本种子按适宜比例为70～90％：10～30％。
进一步优选地，如上所述简化的油菜杂交f1种子的制种方法，其中的隔离条件包括自然隔离、人工隔离。
进一步优选地，如上所述简化的油菜杂交f1种子的制种方法，其中人工撒播按每亩6000～30000株种植，机械或人工条播按行距为10～25cm，株距为5～15cm。
进一步优选地，在现蕾初期喷施含苯磺隆的配方杀雄剂，15-20天后再喷施一次同样的杀雄剂。
与现有技术相比，本发明的杂交制种方法的优点和进步性在于：
(1)播种时，传统方法是将母本和父本按一定行比分开种植，费工费时；本发明将母本和父本混合种植，育种程序简单，节约劳动成本，省钱又省力。
(2)收获时，传统方法是将母本和父本分开收割，或提前将父本砍掉；本发明是直接将母本和父本混收，操作简单，进一步节约了劳动成本。
(3)由于父本具有自交不亲和的特性，因此其不能正常结实，开花期会延长，有利于授粉，提高了f1种子产量。
(4)由于父本具有自交不亲和的特性，因此其不能正常结实，从根本上减少了将父本种子混入f1种子中的风险。
(5)传统方法中，当利用波里马细胞质雄性不育系制种时，由于母本行去杂不彻底会导致杂株给不育系授粉而影响杂种纯度；同时波里马细胞质雄性不育系育性易受到温度影响，不育系的育性不稳定可能自交和兄妹交结实也会影响杂种纯度。本发明可以通过喷施杀雄剂将母本行中的杂株和母本同时杀雄，消除了杂株给母本授粉和不育系自交或兄妹交的风险，有利于提高种子纯度，降低了生产风险。
(6)传统方法中，化学杀雄制种时，给母本行喷施杀雄剂要避免喷到父本上，否则会将父本杀雄，减少父本花粉量，影响制种产量。而为了避免将杀雄剂喷到父本上，传统方法要采用一定的隔离措施。本发明由于父本带有磺酰脲类除草剂抗性基因，喷施苯磺隆不会影响父本的雄性育性，不需要采取隔离措施。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法和技术。另外，实施例中波里马细胞质雄性不育系616a为本发明人培育的新品种，于2018年1月2日获得植物新品种权，品种权号为cna20141083.8。
实施例1：具有自交不亲和特性及因乙酰乳酸合成酶基因突变导致对磺酰脲类除草剂抗性的波里马细胞质雄性不育恢复系7-5str的选育
(1)用华油杂12号恢复系7-5做母本(基因型为bns-7bns-7)与从华油杂95的f2后代中分离出的自交不亲和单株(基因型为bns-1300bns-1300)杂交，获得f1。
(2)用上述f1作母本与华油杂12号恢复系7-5回交，得到bc1。
(3)用与自交不亲和基因bns-1300连锁的dna分子标记对上述bc1群体单株作dna分子检测，筛选出在自交不亲和基因位点为杂合基因型(bns-1300bns-7)的单株。
(4)用华油杂12号恢复系7-5(基因型为bnaahas3_bnaahas3)做母本与因乙酰乳酸合成酶基因突变导致对磺酰脲类除草剂抗性的655(基因型为bnaahas3_bnaahas3)杂交，获得f1。
(5)用步骤(4)得到的f1作母本与7-5回交，获得bc1。
(6)用与乙酰乳酸合成酶基因bnaahas3连锁的分子标记对上述bc1群体单株进行检测，筛选出在乙酰乳酸合成酶基因位点为杂合基因型(bnaahas3bnaahas3_)的单株。
(7)将在两个bc1群体中筛选出来的单株相互杂交，获得复交f1。
(8)分别用与自交不亲和基因bns-1300和乙酰乳酸合成酶基因bnaahas3连锁的dna分子标记对上述复交f1群体单株作dna分子检测，筛选出同时在自交不亲和乙酰乳酸合成酶基因位点为杂合基因型(bns-1300bns-7+bnaahas3bnaahas3)的单株。
(9)用上述复交f1中选单株与7-5回交，获得复交bc1。
(10)分别用与自交不亲和基因bns-1300和乙酰乳酸合成酶基因bnaahas3连锁的dna分子标记对上述复交bc1群体单株作dna分子检测，筛选出同时在自交不亲和乙酰乳酸合成酶基因位点为杂合基因型(bns-1300bns-7+bnaahas3bnaahas3)的单株。
(11)用上述复交bc1中选单株与7-5回交，获得复交bc2。
(12)分别用与自交不亲和基因bns-1300和乙酰乳酸合成酶基因bnaahas3连锁的dna分子标记对对上述复交bc2群体单株作dna分子检测，筛选出同时在自交不亲和乙酰乳酸合成酶基因位点为杂合基因型(bns-1300bns-7+bnaahas3bnaahas3)的单株。
(13)将上述复交bc2中选单株自交，得到复交bc2f2。
(14)分别用与自交不亲和基因bns-1300和乙酰乳酸合成酶基因bnaahas3连锁的dna分子标记对对上述复交bc2f2群体单株作dna分子检测，筛选出同时在自交不亲和乙酰乳酸合成酶基因位点为纯合基因型(bns-1300bns-1300+bnaahas3bnaahas3)的单株。
(15)对上述复交bc2f2群体中同时在自交不亲和乙酰乳酸合成酶基因位点为纯合基因型(bns-1300bns-1300+bnaahas3bnaahas3)的单株进行自交(人工辅助授粉)，得到复交bc2f3。
(16)对上述复交bc2f3家系进行农艺性状、自交不亲和性和苯磺隆抗性鉴定，筛选出自交不亲和且具有苯磺隆抗性，表型最接近于7-5的家系，混繁(人工辅助授粉)混收，获得7-5str。
实施例2：油菜波里马细胞质雄性不育杂交制种
本发明的方法包括利用波里马细胞质雄性不育系616a和同时具有自交不亲和特性和因乙酰乳酸合成酶基因突变导致对磺酰脲类除草剂抗性的的恢复系7-5str生产杂交f1种子，其杂交制种方法具体步骤包括：
(1)将616a和7-5str种子按80％：20％比例混合均匀。
(2)在人工网室隔离条件下，将上述混合均匀的种子按行距为20cm，株距为10cm种植。
(3)油菜现蕾初期喷化杀灵wp2(具体操作过程：第一步，5克化杀灵wp2可湿性粉剂+1000ml水配成母液；第二步，取母液50ml+15000ml水配成稀释液；第三部，将稀释液直接均匀喷在油菜叶片上)。15天后，选择晴天再喷一次。
(4)种子成熟时将不育系和恢复系混合收获，统计后显示，杂种纯度为95.6％。
实施例3：油菜波里马细胞质雄性不育杂交制种
(1)将616a和7-5str种子按80％：20％比例混合均匀。
(2)在人工网室隔离条件下，将上述混合均匀的种子按25000株/亩密度种植。
(3)油菜现蕾初期喷化杀灵wp2(具体操作过程：第一步，5克化杀灵wp2可湿性粉剂+1000ml水配成母液；第二步，取母液50ml+15000ml水配成稀释液；第三部，将稀释液直接均匀喷在油菜叶片上)。15天后，选择晴天再喷一次。
(4)种子成熟时将不育系和恢复系混合收获，统计后显示，杂种纯度为94.8％。
实施例4：油菜化学杀雄杂交制种
本发明的方法包括利用常规油菜品种“中双11”和同时具有自交不亲和特性和因乙酰乳酸合成酶基因突变导致对磺酰脲类除草剂抗性的恢复系7-5str生产杂交f1种子，其杂交制种方法具体步骤包括：
(1)将油菜常规品种“中双11”和具有自交不亲和特性的恢复系7-5str种子按80％：20％比例混合均匀。
(2)在自然隔离条件下，将上述混合均匀的种子按行距为20cm，株距为10cm种植。
(3)油菜现蕾初期喷化杀灵wp2(具体操作过程：第一步，5克化杀灵wp2可湿性粉剂+1000ml水配成母液；第二步，取母液110ml+15000ml水配成稀释液；第三部，将稀释液直接均匀喷在油菜叶片上)。15天后，取母液80ml+15000ml水配成稀释液，选择晴天再喷一次。
(4)种子成熟时将不育系和恢复系混合收获，统计后显示，杂种纯度为91.2％。
实施例5：油菜化学杀雄杂交制种
本发明的方法包括利用常规油菜品种“中双11”和同时具有自交不亲和特性和因乙酰乳酸合成酶基因突变导致对磺酰脲类除草剂抗性的恢复系7-5str生产杂交f1种子，其杂交制种方法具体步骤包括：
(1)将油菜常规品种“中双11”和具有自交不亲和特性的恢复系7-5str种子按80％：20％比例混合均匀。
(2)在自然隔离条件下，将上述混合均匀的种子按25000株/亩密度种植。
(3)油菜现蕾初期喷化杀灵wp2(具体操作过程：第一步，5克化杀灵wp2可湿性粉剂+1000ml水配成母液；第二步，取母液110ml+15000ml水配成稀释液；第三部，将稀释液直接均匀喷在油菜叶片上)。15天后，取母液80ml+15000ml水配成稀释液，选择晴天再喷一次。
(4)种子成熟时将不育系和恢复系混合收获，统计后显示，杂种纯度为90.8％。