本发明涉及动物模型的方法，具体涉及一种肠易激综合征的造模方法。
背景技术：
：：肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，ibs)是以肠道功能紊乱为主要特征的异质性疾病，其主要症状为反复腹痛、腹泻和排便性状异常等。近年来，肠易激综合征患病率呈上升趋势，且与成年人同层次的疾病如糖尿病、充血性心力衰竭、肾功能不全和肝硬化等相比较，ibs极大地影响了患者的身心健康和生活质量，已成为临床上待解决的难题之一。ibs是一种胃肠功能性障碍，涉及脑和肠之间多种复杂因素的非正常相互作用，其病因和发病机制目前还未明确。大多数学者认为内脏敏感性增高是ibs的主要病机，也是目前研究的热点。内脏高敏感性是指机体对疼痛和不适的耐受阈值降低，主要表现为胃肠道对化学刺激或机械性扩张的阈值降低。传统的ibs动物模型复制方法主要包括束缚制动刺激、醋酸肠道刺激、电刺激及成年动物直肠扩张刺激法等，但模型重复性较差，肠道的感觉异常会随着炎症的消退而消失，不符合ibs患者腹痛或腹部不适的慢性持续性过程。al-chaer等建立的乳鼠直肠扩张刺激模型，其主要原理是动物在新生期的短暂外周刺激会导致慢性内脏高敏感性，这种高敏性甚至能持续至成年期且无结肠组织病理学改变，与人类的ibs症状一致，因而更能模拟ibs的长期慢性病程。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，采用球囊扩张导管建立肠易激综合征乳大鼠直肠扩张刺激模型，该模型有效性及稳定性好，并可用于筛选防治肠易激综合征的药物。技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：一种肠易激综合征的造模方法，它包括以下步骤：(1)取孕大鼠所产下的乳鼠，从新生8d至14d，每天使用φ2.5mm的ptca球囊扩张导管进行乳鼠直结肠刺激，并在直肠内给予60mmhg的压力，持续30秒～90秒，25～35min后重新刺激一次；(2)从新生15d至21d，每天采用φ3.5mm的ptca球囊扩张导管进行乳鼠直结肠刺激，并在直肠内给予60mmhg的压力，持续30秒～90秒，25～35min后重新刺激一次；获得肠易激综合征的乳鼠模型。作为优选方案，以上所述的肠易激综合征的造模方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)取孕大鼠所产下的乳鼠，从新生8d至14d，每天使用φ2.5mm的ptca球囊扩张导管进行乳鼠直结肠刺激，并在直肠内给予60mmhg的压力，持续60秒，30min后重新刺激一次；(2)从新生15d至21d，每天采用φ3.5mm的ptca球囊扩张导管进行乳鼠直结肠刺激，并在直肠内给予60mmhg的压力，持续60秒，30min后重新刺激一次，获得肠易激综合征的乳鼠模型。作为优选方案，以上所述的肠易激综合征的造模方法，步骤(1)和步骤(2)用注射器推注3ml的蒸馏水给予60mmhg的压力。本发明所述的肠易激综合征的模型在筛选防治肠易激综合征药物中的应用。一种具有治疗肠易激综合征的中药组合物，其特征在于，它包括以下原料：菟丝子45～90份，黄连90～180份，防风60～120份，白芍30～60份，甘草6～12份。。球囊扩张导管是一种头端带有可膨胀球囊的软性导管，临床上用于在影像引导下扩张人体内狭窄的空腔脏器，主要包括冠状动脉球囊成形术(ptca)、气管和食道的扩张和治疗、椎体球囊导管、尿道球囊扩张导管等等。球囊扩张导管一般是由主要由球囊和导管两部分组成，导管末端附近装有一只球囊。根据球囊直径大小可大致分为小球囊(2-5mm)，普通球囊(5～12mm)和大球囊(≥12mm)。其中小球囊一般用于冠状动脉及直径偏细的肾、椎动脉。有益效果：本发明提供的肠易激综合征的造模方法和现有技术相比具有以下优点：本发明选用球囊扩张导管对出生后8d至21d新生大鼠进行结肠扩张刺激，给予直肠内60mmhg的压力，持续1min，30min后重复刺激。于出生后90d进行腹壁回撤反射试验评分，可得造模大鼠awr评分显著高于正常对照组，证明内脏高敏感模型复制成功且持续至其成年阶段，病理组织学检查、结肠组织sp的免疫组化检查及其它相关因子的检查亦佐证了本发明造模成功。本发明提供的肠易激综合征模型可用于筛选防治肠易激综合征的药物，稳定性好，与人类的ibs症状一致，因而更能模拟ibs的长期慢性病程。附图说明图1为各组给药后的鼠结肠组织病理学变化图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。1.实验材料1.1实验动物spf级健康sd孕大鼠25只，孕期18d，购于南通大学实验动物中心，许可证号：scxk(苏)2014-0001。实验动物于江苏省中医药研究院实验动物中心饲养，动物实验许可证号：syxk(苏)2011-0017，大鼠饲养环境为spf级，自由饮水和进食。1.2药物与试剂中药复方提取液(由菟丝子45g，黄连90g，防风60g，白芍30g，甘草6g组成；提取方法为加8倍量的水煎煮提取3次，每次1小时，合并浓缩，得到水提物)；马来酸曲美布汀胶囊，0.1g·粒-1，批号：20131008-005，购于山西振东安特生物制药有限公司。液体石蜡(分析纯)，批号12070601，上海久亿化学试剂有限公司。大鼠vip、sp酶联免疫检测试剂盒，批号20140515，南京建成生物工程研究所；大鼠cgrp联免疫检测试剂盒，批号20141116，南京建成生物工程研究所；大鼠5-ht酶联免疫检测试剂盒，批号20141109，南京建成生物工程研究所；大鼠免疫组化试剂盒，批号20141118，南京建成生物工程研究所。1.3主要仪器ptca球囊扩张导管，microport，规格：φ2.5mm、φ3.5mm；hypcrcontcrxp型组织脱水机，英国shandon公司；histocentre2型组织包埋机，英国shandon公司；micromhm340e组织切片机，德国美康公司；nc202-2电热干燥箱，南京长江电器仪器厂；低温冰箱kk29e18ti，德国西门子公司；三洋mdf-382e超低温冰箱，日本产；te212-l电子天平，德国sartorius公司；hh-60型快速恒温数显水箱，常州国华电器有限公司；thermomultiskanmk3酶标仪，美国进口；axioskop40显微镜，德国zeiss公司生产。2.实验方法2.1内脏高敏感d-ibs模型制备及分组给药孕大鼠所产下的乳鼠，从新生8d至14d，使用φ2.5mm的ptca球囊扩张导管进行直结肠刺激，直肠内给予60mmhg(用5ml的注射器推注约3ml的蒸馏水)的压力，持续1min。30min后重新刺激一次。从新生15d至21d换用φ3.5mm的ptca球囊扩张导管按上述步骤进行直结肠刺激，共刺激14天。普通饲料正常喂养至出生第60d后，60只雄性大鼠按体重随机分为空白对照组、模型对照组、马来酸曲美布汀组，中药复方低、中、高剂量组，每组10只。出生后第60d起开始灌胃给药。实验剂量为：马来酸曲美布汀组灌胃马来酸曲美布汀17mg·kg-1，中药复方低剂量组、中剂量组、高剂量组分别予以1.3、2.5、5.0g·kg-1灌胃给药，空白及模型对照组灌胃相应体积的生理盐水，每日1次，连续给药30d。期间各组大鼠普通饲料喂养，自由饮用纯净水。大鼠每周称体重1次，每周灌胃给药量按体重变化调整。2.22awr评分末次给药1d后进行awr评分，方法为：大鼠禁食不禁水16h，乙醚麻醉后将石蜡油润滑后的冠脉扩张球囊导管插入大鼠肛门，插入肛门内的球囊约5.0cm，距肛门外1.0cm处将其固定在大鼠尾根部后，导管根部开口连接注射器。大鼠苏醒后，将其放在18cm×5cm×7cm特制的透明塑料筒中，使之不能前后移动，亦不能转侧。大鼠适应30min后扩张肛门内的球囊从而引起大鼠结直肠扩张。每只大鼠球囊扩张3次，容量为2ml，每次扩张持续30s，间隔5min，以防肠道缺血。取3次评分的均值作为awr测试结果。awr评分标准参考：1分，刺激时大鼠情绪基本稳定；2分，给予刺激时变得不稳定,偶尔扭动头部；3分，腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面；4分，腹背部肌肉较强烈收缩并把腹部抬离地面；5分，腹部肌肉强烈收缩,腹部呈弓形并把腹部、会阴部抬离地面。2.3指标测定大鼠血清sp、cgrp测定：给药结束后实验动物禁食24h，自由饮用纯净水，各组大鼠给予10％水合氯醛(腹腔注射3ml·kg-1)麻醉后，从腹主动脉中采集动脉血5ml置于塑料软管中，离心10min，转速3000r·min-1，取上清液保存于-20℃以下待测。采用酶联免疫分析法测定大鼠sp、cgrp，操作按试剂盒说明书进行。大鼠组织vip、5-ht测定：麻醉状态下，取实验大鼠盲肠上结肠组织，冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，按1:9于结肠组织中加入生理盐水研磨匀浆，离心取上清液，按elisa试剂盒说明书操作测定大鼠结肠组织vip、5-ht。大鼠组织sp免疫组化测定：麻醉状态下，摘取实验大鼠盲端下1cm处结肠组织，沿肠系膜纵向剪开，冰冷生理盐水冲洗，立即固定于10％中性甲醛水溶液中，按照试剂盒说明书进行大鼠sp免疫组化检测。2.4标本采集大鼠麻醉状态下，摘取盲端下1cm处结肠组织2cm，沿肠系膜纵向剪开，冰冷生理盐水冲洗，立即固定于10％中性甲醛水溶液中，梯度酒精脱水，石蜡包埋，常规切片，苏木精—伊红(he)染色，显微镜下观察。3.实验结果3.1一般情况描述空白对照组大鼠精神状态良好，反应敏锐，毛发顺滑光亮，食欲正常，大便呈黑色颗粒状。造模期间各造模大鼠精神萎靡，活动减少，体质量缓慢上升，毛发稀松发黄缺少光泽，肛周体毛被稀便沾染，有稀软便排出。上述现象经药物治疗后各给药组大鼠均有明显改善，毛发顺泽，活动增多，腹泻减少，较模型组相比有显著好转。3.2结肠组织病理学变化实验结果发现模型组各鼠肠黏膜下和(或)固有层分离和(或)黏膜下和肌层不同程度水肿，局部绒毛脱落，黏膜层可见不同程度急慢性炎细胞浸润，粘膜下层可见小血管增生、扩张充血。给药组各鼠肠黏膜血管增生、炎症反应有所改善，以中剂量组为最。见图1。图1中a为空白组、b为模型组、c为马来酸曲美布汀、d为中药复方低剂量组、e为中药复方中剂量组、e为中药复方高剂量组。3.3awr评分结果给药前，与空白对照组相比，造模大鼠awr评分较高，差异悬殊(p＜0.01)，证明内脏高敏感模型复制成功。给药后，中药复方剂量组awr评分明显低于模型组(p＜0.01)，说明中药复方各治疗组的内脏敏感性降低。此外，由于中药复方各剂量组awr分值不同，高、中剂量组的awr分值低于低剂量组，表明中药复方对大鼠内脏敏感性的改善与其剂量呈一定的相关性。见表1。表1中药复方对大鼠awr评分的影响(n＝10)组别剂量/g·kg-1awr/分空白对照组—1.13±0.23**模型对照组—3.90±0.22马来酸曲美布汀0.0171.87±0.65**中药复方低剂量组1.32.03±0.96**中药复方中剂量组2.51.37±0.40**中药复方高剂量组5.01.40±0.41**注：与模型组比较，**：p<0.01。3.4血浆sp和cgrp结果模型组大鼠血浆sp含量比空白组大鼠低，统计学差异显著(p<0.01)。给药后，中药复方各治疗组和马来酸曲美布汀组大鼠血浆sp含量较模型组大鼠明显升高(p<0.05～0.01)，基本接近接近正常动物的水平，表明用药后可明显模型大鼠血浆sp水平的异常降低。模型组大鼠血浆cgrp含量明显比空白对照组大鼠低，差异明显(p<0.01)。给药后，中药复方各给药组和马来酸曲美布汀组大鼠血浆cgrp含量明显升高(p<0.01)，其中中药复方高、中剂量组血浆cgrp值接近正常组大鼠的水平，表明用药后模型大鼠的血浆cgrp水平恢复接近正常大鼠的水平。见表2。表2中药复方对大鼠血浆sp、cgrp表达的影响(n＝10)组别剂量/g·kg-1sp/ng·ml-1cgrp/ng·l-1空白对照组—28.84±1.81**66.31±3.71**模型对照组—25.50±2.3158.08±3.62马来酸曲美布汀0.01727.39±1.45*65.16±2.99**中药复方低剂量组1.326.92±1.9262.58±2.46**中药复方中剂量组2.527.37±1.25*64.46±2.18**中药复方高剂量组5.028.79±2.20**65.92±3.84**注：与模型组比较，**：p<0.05；**：p<0.01。3.5结肠组织vip和5-ht结果模型组大鼠结肠组织vip含量比空白对照组大鼠低，差异明显(p<0.01)。给药后，中药复方各治疗组和马来酸曲美布汀组大鼠组织vip含量较模型组大鼠明显升高(p<0.05～0.01)，其中高剂量组恢复接近正常水平。模型组大鼠组织5-ht含量比空白对照组大鼠低，差异显著(p<0.05)。给药后，中药复方各给药组和马来酸曲美布汀组大鼠组织5-ht含量明显升高(p<0.05～0.01)，各给药组均恢复到正常动物的水平。见表3。表3中药复方对大鼠组织vip、5-ht表达的影响(n＝10)组别剂量/g·kg-1vip/ng·l-15-ht/ng·ml-1空白对照组—37.22±1.46**19.09±0.98*模型对照组—27.89±6.7117.89±1.30马来酸曲美布汀0.01735.80±5.16**19.54±1.00**中药复方低剂量组1.333.56±4.16*18.50±0.94中药复方中剂量组2.533.86±3.11*19.85±2.23*中药复方高剂量组5.036.78±6.07**21.83±3.98**注：与模型组比较，**：p<0.05；**：p<0.01。3.6结肠组织sp表达观察发现sp表达显棕黄色，在大鼠结肠粘膜层血管内有表达。d-ibs模型组大鼠结肠粘膜层血管sp阳性表达细胞数显著低于空白组大鼠(p<0.01)，给药后，中药复方各治疗组和马来酸曲美布汀组大鼠结肠粘膜层血管sp阳性表达细胞数较模型组大鼠明显升高(p<0.05～0.01)，初步表明其作用机制与恢复结肠组织中sp的表达相关。样本sp阳性表达细胞数分析结果见表4。表3-4各组大鼠结肠sp表达比较(n＝4)组别剂量/g·kg-1阳性表达细胞数空白对照组—12.10±2.35**模型对照组—5.05±1.33马来酸曲美布汀0.0179.90±2.75*中药复方低剂量组1.35.65±0.90中药复方中剂量组2.57.35±1.15*中药复方高剂量组5.010.40±0.43**注：与模型组比较，**：p<0.05；**：p<0.01。本发明应用ptca球囊扩张技术对出生后8d至21d新生大鼠进行结肠扩张刺激，给予直肠内60mmhg的压力，持续1min，30min后重复刺激。于出生后90d进行腹壁回撤反射试验评分，可得造模大鼠awr评分显著高于正常对照组，证明内脏高敏感模型复制成功且持续至其成年阶段，病理组织学检查、结肠组织sp的免疫组化检查及其它相关因子的检查亦佐证了这一结果。并且，本发明通过复制ibs内脏高敏感模型，发现中药复方可抑制血浆sp、血浆cgrp、结肠vip、结肠5-ht含量的下降，提高结肠组织上中sp的表达，本发明提供的中药复方可从多层次、多环节改善肠易激综合征内脏高敏感性，发挥其对ibs的多靶点治疗作用取得了很好的技术效果。以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本
发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12当前第1页12