本发明涉及林木繁育技术领域，具体涉及一种桃叶卫矛种苗的组织培养方法。
背景技术
桃叶卫矛，别名丝棉木、白杜、明开夜合、华北卫矛，属于卫矛科卫矛属，高达6米，为落叶小乔木或灌木。树冠圆形或卵形，树皮灰褐色，小枝绿色，近四棱形。叶对生，椭圆状卵形或宽卵形，边缘有细锯齿。聚伞花序腋生，花3-7朵，黄绿色。蒴果4瓣裂，淡红色或带黄色；种子有桔红色假种皮。花期5-6月，果熟期9-10月。目前的繁殖方式以播种、扦插繁殖为主。由于我国已经采用组织培养的方法对杨树等树种进行繁育，即采用茎段或茎尖为外植体，经灭菌后接种在培养基上，获得生根率高的试管苗。
然而，如采用类似的手段对桃叶卫矛进行繁育，人们发现该植物具有难生根的问题。在组织培养过程中，桃叶卫矛表现为增殖速度较快，但是较难生根。且生根时通常先长愈伤组织，并进一步在愈伤组织上生长出较细的小根。但是这种小根较为脆弱，通常在受到外力的作用下就会折断或整个根脱落，移栽难以成活。因此需要解决桃叶卫矛，乃至卫矛属植物在无性繁殖过程中难生根的问题。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种桃叶卫矛的组织培养方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种桃叶卫矛的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取桃叶卫矛外植体并进行灭菌处理，得到无菌外植体；
(2)将所述无菌外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到不定芽；
(3)将所述不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；
(4)将所述继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
优选地，步骤(1)中，所述外植体为桃叶卫矛的半木质化嫩枝。
优选地，步骤(1)中，所述灭菌处理为将所述外植体依次使用酒精溶液和次氯酸钠溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。
优选地，步骤(1)中，所述酒精溶液的体积分数为75％，所述次氯酸钠溶液的质量浓度为20％。
优选地，步骤(2)中，所述初代培养基是以ms培养基为基础，并添加naa得到，所述初代培养基中naa的浓度为0.05mg/l，且所述初代培养基的ph值为5.8～6.2。
优选地，步骤(2)中，所述初代培养为将所述无菌外植体接种于初代培养基中，在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养15～25天，直至生成不定芽。
优选地，步骤(3)中，所述继代培养基是以ms培养基为基础，并添加6-ba、naa、蔗糖和琼脂得到，所述继代培养基中6-ba的浓度为0.15mg/l，naa的浓度为0.15mg/l，蔗糖的浓度为30g/l，琼脂的浓度为6g/l，且所述继代培养基的ph值为5.8～6.2。
优选地，步骤(3)中，所述继代培养为将所述不定芽接种于继代培养基中，在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养，每隔20～25天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗。
优选地，步骤(4)中，所述生根培养基是以1/2ms培养基为基础，并添加碳粉、iba、蔗糖和琼脂得到，所述生根培养基中碳粉的浓度为0.1～0.5mg/l，iba的浓度为0.1mg/l，蔗糖的浓度为20g/l，琼脂的浓度为6g/l，且所述生根培养基的ph值为5.8～6.2。
优选地，步骤(4)中，所述生根培养为将所述继代苗接种于生根培养基中，在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下，培养20～30天，得到生根苗。
优选地，步骤(4)中，在所述生根培养的前3天对所述继代苗进行暗处理。
优选地，步骤(4)结束后，还包括步骤(5)：将所述生根苗从生根培养基中取出并置于基质中，在自然光下培育5～10天，然后在土壤中培养30～40天得到移栽苗。
优选地，所述基质为蛭石。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种针对桃叶卫矛的标准化组织培养种苗的方法，具体操作方式包括：将桃叶卫矛当年生幼嫩茎段经消毒灭菌，再切掉两端接种于初代培养基中进行初代培养至生成不定芽；然后将不定芽切成块后，置于继代培养基中进行继代培养得到继代苗；再将继代苗切分成单株后，置于生根培养基中进行生根培养得到生根苗；最后将生根苗驯化后定植得到移栽苗，成活率达到85％～90％。本发明解决了桃叶卫矛生根困难，繁殖效率低，无法实现工厂化生产的问题。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明实施例涉及一种桃叶卫矛种苗的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体灭菌处理：
取桃叶卫矛外植体并进行灭菌处理，得到无菌外植体。
其中，外植体是作为离体培养材料的植物器官或组织的片段，其具有代谢旺盛，再生能力强的特点。在本发明的一个实施例中，外植体为桃叶卫矛的半木质化嫩枝。
在本发明的一个实施例中，灭菌处理为将外植体依次使用酒精溶液和次氯酸钠溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。其中，酒精溶液的体积分数可以为75％，次氯酸钠溶液的质量浓度可以为20％。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)包括：将桃叶卫矛当年生嫩茎在质量浓度为75％的酒精中消毒灭菌20～40秒并用无菌水冲洗后，转移到质量浓度为20％的次氯酸钠溶液中消毒灭菌10～15分钟，然后用无菌水冲洗3～5次，将残留的消毒试剂清洗干净，得到无菌外植体。
(2)初代培养：
灭菌结束后，将无菌外植体接种于初代培养基中进行初代培养，得到不定芽。
在本发明的一个实施例中，初代培养基是以ms培养基为基础，并添加naa得到，初代培养基中naa的浓度为0.05mg/l，且初代培养基的ph值为5.8～6.2。
其中，naa为萘乙酸，是一种广谱植物生长调节剂。能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮或种子进入到植株内，随营养流输导到全株。naa的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。
在本发明的一个实施例中，初代培养的具体条件为：在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养15～25天，直至生成不定芽。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(2)包括：在无菌工作环境中，将消毒后的茎段切掉与消毒剂接触的两端，然后将茎段剪成长度为0.5cm～1cm，有1～2个生长点的分段，接种于初代培养基中。初代培养基是以ms培养基为基础，并添加naa得到，其中naa的浓度为0.05mg/l，且ph值为5.8～6.2。在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养15～25天，直至生成不定芽。
(3)继代培养：
将不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗。
在本发明的一个实施例中，继代培养基是以ms培养基为基础，并添加6-ba、naa、蔗糖和琼脂得到，继代培养基中6-ba的浓度为0.15mg/l，naa的浓度为0.15mg/l，蔗糖的浓度为30g/l，琼脂的浓度为6g/l，且继代培养基的ph值为5.8～6.2。
在本发明的一个实施例中，继代培养的具体条件为：在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养，每隔20～25天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行切段分化，直至得到继代苗。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(3)包括：在无菌工作环境中，将不定芽切成块后置于继代培养基中：继代培养基是以ms培养基为基础，并添加6-ba、naa、蔗糖和琼脂得到。继代培养基中6-ba的浓度为0.15mg/l，naa的浓度为0.15mg/l，蔗糖的浓度为30g/l，琼脂的浓度为6g/l，且继代培养基的ph值为5.8～6.2。在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养，每隔20～25天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗。
申请人发现，如果在继代培养基中加入iaa或iba(iaa为吲哚乙酸，iba为吲哚丁酸，均为刺激植物生长的激素类试剂)，会降低桃叶卫矛的株高和增殖倍数，因此优选继代培养基中不加入iaa或iba。
(4)生根培养：
将继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
在本发明的一个实施例中，生根培养基是以1/2ms培养基为基础，并添加碳粉、iba、蔗糖和琼脂得到，生根培养基中碳粉的浓度为0.1～0.5mg/l，iba的浓度为0.1mg/l，蔗糖的浓度为20g/l，琼脂的浓度为6g/l，且生根培养基的ph值为5.8～6.2。
在本发明的一个实施例中，生根培养的具体条件为：在温度为25～28℃、光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下，培养20～30天，得到生根苗。
在本发明的一个实施例中，在生根培养的前3天对所述继代苗进行暗处理，其生根天数会相对缩短。本申请的发明人在实验中发现，22～28℃的黑暗环境能够显著的促进桃叶卫矛外植体进行生根。由于处于黑暗环境中，外植体的养分几乎依赖于根系的吸收，生根后能够外植体迅速吸收培养基中的养分，进而显著促进外植体的生长发育，进而减少了培育的时间。但是，在生根前三天以后对组培苗进行暗处理对生根天数没有明显影响。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(4)包括：将继代苗切分成单株后，置于生根培养基中。生根培养基是以1/2ms培养基为基础，并添加碳粉、iba、蔗糖和琼脂得到，其中碳粉的浓度为0.1～0.5mg/l，iba的浓度为0.1mg/l，蔗糖的浓度为20g/l，琼脂的浓度为6g/l，且ph值为5.8～6.2。在温度为25～28℃下，前3天进行暗处理。然后温度不变，在光照强度为2200～2800lx、光照时间为12～16h/天的条件下培养17～27天，得到生根苗。
在本发明的一个实施例中，步骤(4)结束后，可以省去炼苗过程，直接进行移栽。具体过程为：
将生根苗从生根培养基中取出置于基质中，继续进行生根培养。基质选择蛭石，其质地较松，不易损害根系，同时透水性较强。将生根苗置于自然光下，在环境温度为22～27℃，相对湿度为55～65％rh的条件下培育5～10天，即可长出新根。待幼苗长出新根后，对于水分的需求变强，此时需要将其移植到保水性较好的土壤内。本发明采用草炭：大田土＝1:1的土壤，移栽后即可放于苗床上，整体进行管护。待30～40天后得到移栽苗，成活率达到85％～90％。
实施例1
采用瓶内生根法对桃叶卫矛进行组织培养：
步骤一、采集外植体：在内蒙古地区，4月份桃叶卫矛开始萌动抽条，此时即可采集当年生枝条作为外植体。要求母株无病虫害且生长健壮。
步骤二、外植体灭菌：接种前，将超净工作台的紫外灯开启15-20min，之后通风10min。将外植体上的叶片剪去，用刷子蘸取洗洁精轻刷外植体表面后放在超净工作台中，用体积分数为75％的酒精溶液灭菌30s，用无菌水冲洗3次，再用质量浓度为20％的次氯酸钠溶液处理10min。处理结束后，用无菌水清洗4-5次，将残留的消毒试剂清洗干净，经此处理桃叶卫矛外植体的总萌发率为95％。
步骤三、初代培养：灭菌结束后，在超净工作台中将作为外植体的嫩枝剪成长度约1-1.5cm并带有1-2个腋芽的茎段，接种于初代培养基中进行腋芽诱导萌发，每瓶接种3个外植体。初代培养基为含有0.05mg/lnaa的ms培养基。30天后腋芽萌发，转入继代培养基中培养。
步骤四、继代培养：继代培养采用ms+6-ba0.15mg/l+naa0.15mg/l，每瓶接种4个植株。培养基中还添加蔗糖30g/l，琼脂6g/l，ph值在5.8-6.2之间。将其放在环境温度25-28℃，光照12小时/天，光强为2500lx的环境下培养20天。此培养基的增殖倍数为11.49，且幼苗生长健壮。其中，ms培养基中各成分及含量见表1。
表1
步骤五、生根培养：
(1)配制培养基：以1/2ms培养基为基础培养基，其中添加蔗糖20g/l，琼脂6g/l，ph值在5.8-6.2之间，同时改变培养基中的活性炭加入量和生长激素种类。不同的生根培养基及生长状况如表2所示。
(2)选取生长健壮，无染菌状况的，高度在3cm左右的正常组培苗作为生根材料，将组培苗接种到生根培养基中，每种培养基接种40株。组培室中环境温度为25-28℃，环境湿度为40％，光照强度2500lx。
表2
从表2可知：实施例1可正常生根，但是在生根过程中产生了愈伤组织。愈伤组织所产生的根系主要特点为水质化，移栽过程中容易折断，移栽成活率较低。且该植株在根系长出后，植株表现为生长缓慢，根系生长也较慢，不及时出瓶会有黄化现象产生。
实施例2植株生长正常，由于活性炭的加入，生长周期明显缩短，且生根过程中不产生愈伤组织，但是其生根条数与实施例1相比没有明显差异。
实施例3使用的是最适宜的生根培养基，其中添加了0.3g/l的活性炭。其表现为生长周期27天，生根条数为5条，生根率达95％，且植株生长健壮。
实施例4的生长周期相对更短，但是其生根率明显降低，生根条数也相对减少，可能是由于活性炭的过量加入，抑制了生根过程的进行。当活性炭过量时，表现较为明显。实施例5的植株无根系产生，并且随着时间的延长逐渐死亡。
实施例6使用了较小含量的iba，其生长正常，但生根率有所下降。实施例7使用了较大含量的iba，虽然缩短了生根周期，但生根率下降较大。实施例8以naa代替iba，虽然植株能够生长但无根系产生，不能进行移栽。
在实施例3的基础上，在生根接种后的不同时间段内对组培苗进行暗处理，其它条件不变，结果见表3。举例：生根前处理(前3天)的含义为：在生根过程的前3天内，进行连续24h*3的无光照处理。
表3
注：根生长速度为从生根开始到可移栽的时间(通常为5天)
表3说明，在生根前三天对组培苗进行暗处理，其生根天数会相对缩短，提高培育效率。但是，在生根前三天以后对组培苗进行暗处理对生根天数没有明显影响。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。