本发明涉及胚胎移植的技术领域，特别是涉及一种胚胎生产冷冻工艺。
背景技术
胚胎移植，又称受精卵抑制，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植至雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术，胚胎移植的本质是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程，可以充分发挥雌性优良个体的繁殖能力，并且大大缩短了供体本身的繁殖周期，同时增加了供体一生繁殖后代的数量。
利用胚胎移植，可以开发遗传特性优良的母畜繁殖潜力，较快的扩大良种畜群，采用胚胎移植可以使优良母畜免去了冗长的妊娠期，胚胎取出后不久即可再次发情、配种和受精，从而能在一定时间内产生较多的后代。
如果向母畜体内注射促性腺激素，还可诱发其在一个发情期中排出比自然情况下更多的卵子，取得多个胚胎供移植之用，另外，由于胚胎可以长期保存和远途运输，还为家畜基因库的建立，品种资源的引进和交换，以及减少疾病传播等提供了更好的条件。
胚胎冷冻是将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过慢速和快速两组降温放置使胚胎静止下来并可在液氮中保存的一种方法，可以将剩余的质量较好的胚胎冷冻保存，待以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内，将增加受孕的机会，并且可以用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量好，不能一次全部移植的，可以将多余的胚胎冷冻保存，从而可以合理限制胚胎移植胎数，降低多胎妊娠率，并且可以为胚胎移植失败或流产母畜提供再次移植机会，同时可以在超排卵周期出现卵巢过度刺激综合征迹象时，取消胚胎移植，将胚胎进行冷冻保存，在其后非刺激周期进行冷冻胚胎移植。
肉羊胚胎移植技术的母体是“借劣种母羊之腹怀良种母羊之胎”来快速扩繁良种母羊。但是现有的胚胎在冷冻保存时效果较差，并且解冻后再移植时胚胎活性较低。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种可以提高胚胎的冷冻保存效果，并且可以提高解冻后再移植时胚胎的活性的胚胎生产冷冻工艺。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，包括以下步骤：
(1)选择供体母羊和供体公羊：选择具备有优良的遗传特性和较高的育种价值，无病，健康状况良好，膘情适中，生殖系统机能正常的供体母羊和供体公羊，并且供体母羊选择2-5胎的母羊，供体公羊选择1.5-6岁的公羊；
(2)供体公羊精液采集：对选择出的供体公羊精液进行采集，并鉴定精液的质量，合格的精液按照合适的稀释比例进行稀释，以备输精使用；
(3)供体母羊超数排卵：体内刺激供体母羊使其超数排卵；
(4)输精：输精前供体母羊需空腹禁食12h，采用腹腔镜寻找到供体母羊的子宫角，采用装有精液的输精枪在两组子宫角内注入适量的精液；
(5)胚胎采集：在受精后2-3天时或5-6天时，利用冲卵液进行冲胚，从超排供体母羊体内将胚胎冲出，并收集在器皿中；
(6)胚胎鉴定：胚胎收集后，立即镜检鉴定胚胎质量，并对胚胎进行胚胎等级鉴定，根据胚胎质量与品种档案进行分组保存；
(7)配制冷冻所需溶液：配制冷冻胚胎所需要的预处理液和冷冻溶液；
(8)冷冻前胚胎前处理：将质量良好的胚胎依次放入预处理液和冷冻液中分别平衡5min；
(9)胚胎装管：在10min内将胚胎全部装入细管中，每只细管装入3-5枚胚胎，用细管塞封口，并将胚胎记录标记在细管塞上；
(10)冷冻：将装入胚胎后的细管放入冷冻仪中，采用慢速降温或快速降温的方法使胚胎冷却至-35℃；
(11)保存：在胚胎冷却至-35℃时将细管由冷冻仪中取出并投入液氮中冷冻保存，每周补充液氮，每年更换液氮。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，所述步骤(5)中的冲胚包括输卵管冲胚或子宫角冲胚。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，所述步骤(6)中的胚胎等级包括a级胚胎、b级胚胎、退化胚胎和无受精卵。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，所述步骤(7)中的预处理液包括以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的ethyleneglycol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的glycerol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％二甲基亚砜溶液和以pbs为基础溶液配制的体积分数为2.5％的ethyleneglycol与2.5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的bsa，使用时配合含有相通抗冻保护剂的冷冻液使用。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，所述步骤(7)中的冷冻液包括以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％的ethyleneglycol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％的glycerol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％二甲基亚砜溶液和以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的ethyleneglycol与5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的bsa。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，所述步骤(9)中的胚胎装管包括以下步骤：
a、先在细管中吸取0.5cm长的保存液；
b、其次吸取0.3cm的空气；
c、然后吸取含胚胎的冷冻液0.5cm；
d、再吸取0.2cm的空气；
e、最后吸取0.3cm的保存液。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，所述步骤(10)中的慢速降温适用于2-3d的胚胎，包括以下步骤：
a、设置降温速度为1℃/min，将胚胎由20℃降至-7℃；
b、-7℃时植入制冷剂晶母，停留20min，诱发结晶，并在此期间检查结晶情况；
c、设置降温速度为0.3℃/min，将胚胎由-7℃降至-35℃。
本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，所述步骤(10)中的快速降温适用于5-6d的囊胚，包括以下步骤：
a、设置降温速度为3℃/min，将胚胎由20℃降至-6℃；
b、-6℃植冰，停留8min，在此期间检查植冰情况；
c、设置降温速度为0.5℃/min，将胚胎由-6℃降至-35℃。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明的一种胚胎生产冷冻工艺，在对受精的胚胎进行冷冻保存时，在降温过程中，可以通过植冰或采用植入制冷剂晶母诱发结冰，使当温度降到保存液冰点附近时，可以迅速结冰，以防胚胎细胞内部产生冰晶，减少给胚胎造成物理性的损伤，从而可以提高胚胎的冷冻保存效果，并且其在解冻后活性较高，再将其移植至受体母羊体内后，母羊产生妊娠反应开始培育羔羊的几率较高，因此，相比于现有的胚胎冷冻技术，本发明可以提高解冻后再移植时胚胎的活性。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
选择具备有优良的遗传特性和较高的育种价值，无病，健康状况良好，膘情适中，生殖系统机能正常的供体母羊和供体公羊，并且供体母羊选择2-5胎的母羊，同时产羔60d以上，断奶30d以上，供体公羊选择1.5-6岁的公羊，并且精子活力品质优良，性欲旺盛，并对供体公羊精液进行采集，鉴定精液的质量后将合格的精液按照合适的稀释比例进行稀释，输精前供体母羊需空腹禁食12h，同时体内刺激供体母羊使其超数排卵，采用腹腔镜寻找到供体母羊的子宫角，并采用装有稀释后的精液的输精枪在两组子宫角内注入适量的精液，完成受精；
在受精后第2-3天时，利用冲卵液进行输卵管冲胚或子宫角冲胚，从超排供体母羊体内将胚胎冲出，并收集在器皿中，立即镜检鉴定胚胎质量，并对胚胎进行胚胎等级鉴定，鉴定出a级胚胎、b级胚胎、退化胚胎和无受精卵，去除退化胚胎和无受精卵；
配制冷冻胚胎所需要的4种预处理液：以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的ethyleneglycol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的glycerol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％二甲基亚砜溶液和以pbs为基础溶液配制的体积分数为2.5％的ethyleneglycol与2.5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的bsa，使用时配合含有相通抗冻保护剂的冷冻液使用；
配制冷冻胚胎所需要的4种冷冻溶液：以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％的ethyleneglycol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％的glycerol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％二甲基亚砜溶液和以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的ethyleneglycol与5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的bsa；
将质量良好的胚胎依次放入4种预处理液和4种冷冻液中分别平衡5min，并在10min内将胚胎全部装入细管中，胚胎装管时，采用去掉针头部分的注射器与细管连接，并先在细管中吸取0.5cm长的保存液，其次吸取0.3cm的空气，然后吸取含胚胎的冷冻液0.5cm，再吸取0.2cm的空气，最后吸取0.3cm的保存液，使每只细管装入3-5枚胚胎，用细管塞封口，并将胚胎记录标记在细管塞上，保存液渗入到细胞内后，能增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的驱动力减弱，减少冰晶的形成；
将装入胚胎后的细管放入冷冻仪中，设置降温速度为1℃/min，将胚胎由20℃降至-7℃，并在-7℃时植入制冷剂晶母，停留20min，诱发结晶，并在此期间检查结晶情况，再设置降温速度为0.3℃/min，将胚胎由-7℃降至-35℃，在胚胎冷却至-35℃时将细管由冷冻仪中取出并投入液氮中冷冻保存。
配制解冻液1：以pbs为基础溶液配制0.5mol/l的蔗糖溶液，并在其中添加体积分数为5％的ethyleneglycol溶液、5％的glycerol溶液、5％二甲基亚砜溶液和2.5％的ethyleneglycol+2.5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的bsa，使用时配合含有相通抗冻保护剂的冷冻液使用；
配制解冻液2：浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液，并添加0.3％bsa的；
在20℃下，将液氮中保存的细管取出，并浸入25℃水浴中平行晃动10s，取出细管，拭去表面水珠，并将其中的物质推入干净的培养皿中快速检查胚胎，并将胚胎依次放入解冻液1和解冻液2中平衡5min，再用pbs清洗3次；
在此之前首选选择性欲旺盛、身体健康状况良好，无传染性疾病的试情公羊3-4只对身体健康状况良好，无生殖道疾病和传染性疾病的100只受体母羊进行试情，使受体母羊发情，并将解冻后的胚胎移植进受体母羊体内，使受体母羊进入妊娠期，开始培育羔羊；
100只受体母羊中正常进入妊娠期的受体母羊为48只，最后产得的羔羊身体状况与受精后不经冷冻保存直接进行胚胎移植产得的羔羊身体状况无明显区别。
实施例2
选择具备有优良的遗传特性和较高的育种价值，无病，健康状况良好，膘情适中，生殖系统机能正常的供体母羊和供体公羊，并且供体母羊选择2-5胎的母羊，同时产羔60d以上，断奶30d以上，供体公羊选择1.5-6岁的公羊，并且精子活力品质优良，性欲旺盛，并对供体公羊精液进行采集，鉴定精液的质量后将合格的精液按照合适的稀释比例进行稀释，输精前供体母羊需空腹禁食12h，同时体内刺激供体母羊使其超数排卵，采用腹腔镜寻找到供体母羊的子宫角，并采用装有稀释后的精液的输精枪在两组子宫角内注入适量的精液，完成受精；
在受精后第5-6天时，利用冲卵液进行输卵管冲胚或子宫角冲胚，从超排供体母羊体内将胚胎冲出，并收集在器皿中，立即镜检鉴定胚胎质量，并对胚胎进行胚胎等级鉴定，鉴定出a级胚胎、b级胚胎、退化胚胎和无受精卵，去除退化胚胎和无受精卵；
配制冷冻胚胎所需要的4种预处理液：以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的ethyleneglycol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的glycerol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％二甲基亚砜溶液和以pbs为基础溶液配制的体积分数为2.5％的ethyleneglycol与2.5％的二甲基亚砜混合溶液；
配制冷冻胚胎所需要的4种冷冻溶液：以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％的ethyleneglycol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％的glycerol溶液、以pbs为基础溶液配制的体积分数为10％二甲基亚砜溶液和以pbs为基础溶液配制的体积分数为5％的ethyleneglycol与5％的二甲基亚砜混合溶液；
将质量良好的胚胎依次放入4种预处理液和4种冷冻液中分别平衡5min，并在10min内将胚胎全部装入细管中，胚胎装管时，采用去掉针头部分的注射器与细管连接，并先在细管中吸取0.5cm长的保存液，其次吸取0.3cm的空气，然后吸取含胚胎的冷冻液0.5cm，再吸取0.2cm的空气，最后吸取0.3cm的保存液，使每只细管装入3-5枚胚胎，用细管塞封口，并将胚胎记录标记在细管塞上，保存液渗入到细胞内后，能增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的驱动力减弱，减少冰晶的形成；
将装入胚胎后的细管放入冷冻仪中，设置降温速度为3℃/min，将胚胎由20℃降至-6℃，并在-6℃时植冰，停留8min，在此期间检查植冰情况，再设置降温速度为0.5℃/min，将胚胎由-6℃降至-35℃，在胚胎冷却至-35℃时将细管由冷冻仪中取出并投入液氮中冷冻保存。
配制解冻液1：以pbs为基础溶液配制0.5mol/l的蔗糖溶液，并在其中添加体积分数为5％的ethyleneglycol溶液、5％的glycerol溶液、5％二甲基亚砜溶液和2.5％的ethyleneglycol+2.5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的bsa，使用时配合含有相通抗冻保护剂的冷冻液使用；
配制解冻液2：浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液，并添加0.3％的bsa；
在20℃下，将液氮中保存的细管取出，并浸入25℃水浴中平行晃动10s，取出细管，拭去表面水珠，并将其中的物质推入干净的培养皿中快速检查胚胎，并将胚胎依次放入解冻液1和解冻液2中平衡5min，再用pbs清洗3次；
在此之前首选选择性欲旺盛、身体健康状况良好，无传染性疾病的试情公羊3-4只对身体健康状况良好，无生殖道疾病和传染性疾病的100只受体母羊进行试情，使受体母羊发情，并将解冻后的胚胎移植进受体母羊体内，使受体母羊进入妊娠期，开始培育羔羊；
100只受体母羊中正常进入妊娠期的受体母羊为64只，最后产得的羔羊身体状况与受精后不经冷冻保存直接进行胚胎移植产得的羔羊身体状况无明显区别。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。