本发明属于植物组织培养技术领域，尤其是一种杏黄兜兰的无性繁殖方法。
背景技术：
兜兰属隶属于兰科杓兰亚科(cypripedioideae)，以花形奇特、花色丰富、艳丽，花期长著称，观赏价值和经济价值极高。杏黄兜兰是兜兰属中罕见的纯黄色花种类，是兜兰属最具观赏价值的种类之一，曾多次获国际金奖，和硬叶兜兰并称兜兰中的“金童玉女”。
然而，由于巨大的市场价值，以及自然生境遭到破坏，近年来杏黄兜兰野生资源已经濒临灭绝，而市场的需求与日俱增，因此，杏黄兜兰的人工快速繁育及产业化栽培生产已经迫在眉睫。
目前，兜兰属植物规模化生产发展较慢。究其原因，兜兰是一种原始的兰科植物，受其生物学特性的影响，兜兰尤其是原生种的组培苗增殖速度过慢，生长周期长，不易建立可控的组培技术体系，生产力低下。首先，无性繁殖困难，由于杏黄兜兰等大多数兜兰叶基生于短茎，外植体选择较难，外植体消毒十分困难，而且母株个体稀少，因此，多年来，常规的以茎尖作为外植体的无性繁殖成功率极低，且易浪费整株母株；再次，类似于其他兜兰生产，现有技术仍以有性繁殖手段繁育杏黄兜兰组培苗。然而，杏黄兜兰不仅种子萌发十分困难，萌发率低下，而且实生苗后代极易出现性状分离，难以保持母株的优良性状，产品缺少一致性，导致整体品质标准和市场推广遇到障碍，因此，实现商品化生产的难度较大。现有技术未能解决杏黄兜兰在产业化栽培生产中存在的技术瓶颈。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
针对目前杏黄兜兰有性繁殖产品商品性差及无性繁殖成功率低下的问题，本发明提供一种杏黄兜兰的无性繁殖方法，即利用走茎快速繁殖杏黄兜兰无菌苗的方法，来建立杏黄兜兰无性繁殖技术体系，解决生产中组培苗生长缓慢、产品不一致的问题，提高杏黄兜兰种苗的繁殖效率和生产力，满足大规模种植杏黄兜兰优良品种的需要。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种杏黄兜兰的无性繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获得和处理：在10月份时，选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株，移入温室中培养，诱导走茎分蘖生长；移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消毒3min，将栽培基质装入栽培容器中；种植时根部深埋，露出茎基部；温室保持日温28℃，夜温18℃，湿度60-65％，遮阴度50-60％，隔7-10d浇1次无菌水；
(2)外植体采集：5-6个月后，待杏黄兜兰植株分蘖生长出3-5条走茎时即可作为外植体备用材料；从花盆里取出整株杏黄兜兰，选择长8-10cm、直径3-4mm的走茎10条，要求走茎生长健壮，苞片粉白色且紧密贴合茎段；将选好的走茎在流水下冲洗60min，之后取出，用软毛刷蘸取质量分数为0.1％的洗洁精溶液清洗5min，清理干净走茎表面污物后，选取顶端幼嫩的3-4个节段作为外植体；
(3)外植体表面消毒：在超净工作台上，将选取好的外植体置入75％的酒精中浸泡30s，无菌水漂洗2-3次后取出，在无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干走茎表面的水分，然后在走茎的单个节间上，用手术刀以“t”字形划割法，环切去除该节段上苞片的3/4，该条走茎的每个节间依次处理完成后，置入0.1％的升汞中消毒1min，用灭菌后的镊子取出，置入无菌水中漂洗3-4次，用无菌滤纸吸干走茎表面的水分，再用同样的环切方法去除节间上剩余的1/4苞片，环割时勿划伤节处具隐芽的区域，之后将外植体再次置入0.1％的升汞中消毒40s，取出后置入无菌水中漂洗3-4次；
(4)诱导培养：在无菌培养皿上，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，切除走茎接触消毒液的一端4-5mm，然后将走茎切段，要求每段保留1个节，节上部保留1/3节段，下部保留2/3节段，将切割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入诱导培养基表面，拧紧瓶盖，置入温度25℃培养室避光培养60d；
(5)丛生芽诱导：待步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽长至1-2cm长时，将侧芽切下，转接入丛生芽诱导培养基中，然后置入日温25℃，夜温15℃的培养室继续培养45d，每天光照12h，光照强度1000lx；
(6)增殖培养：将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶，清理干净根部附着的培养基，2-3株/丛转接入增殖培养基中，光照培养45d；培养温度25℃，每天光照12h，光照强度1000lx；
(7)壮苗生根培养：将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基中光照培养90d；培养温度25℃，每天光照12h，光照强度2000lx；
(8)试管苗移栽：将杏黄兜兰具3cm高的完整植株从培养室转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部附着的培养基，以80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡植株8min后，自然阴干，采用口径为5㎝的透明营养钵移栽，3-5株/杯，将其移栽至栽培基质中；移栽场地保持良好的通风，移栽后第1个月遮阴度80-85％，湿度控制在85-90％。
作为优选，步骤(1)中所述的栽培基质采用泥炭：树皮：锯末：木炭：羊粪(v/v)＝3:3:2:1:1混合均匀，树皮、锯末、羊粪均经过充分腐熟，使用前经121℃高压灭菌20min。
作为优选，步骤(1)中所述的栽培容器采用口径12.5cm，高13cm的瓦盆，使用前在500-800倍的高锰酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。
作为优选，步骤(4)中所述的诱导培养基为1/2ms+6-ba0.8-1.5mg/l+naa0.2-0.8mg/l+活性炭1g/l+蛋白胨1.5g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。
作为优选，步骤(5)中所述的丛生芽诱导培养基：1/2ms+ba0.05-0.15mg/l+naa0.02-0.08mg/l+蛋白胨1.5g/l+苹果汁15-30ml/l+土豆汁20-40ml/l+香蕉汁60-80ml/l+活性炭1g/l+蔗糖30-40g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。
作为优选，步骤(6)中所述的增殖培养基：1/2ms+tdz0.08-0.15mg/l+2，4-d2-4mg/l+蛋白胨1g/l+香蕉汁80-120ml/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。
作为优选，步骤(7)中所述的壮苗生根培养基1/2ms+6-ba0.8-1.5mg/l+naa0.08-0.15mg/l+活性炭1-3g/l+蛋白胨1.0g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。
作为优选，步骤(8)中所述的栽培基质为碎松树皮：火山岩：木炭(v/v)＝4:2:1混合均匀，基质粒径为1-1.5cm，碎松树皮需充分腐熟后使用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)与已有技术相比，本发明方法具有外植体取材简便、易得、量大、不破坏母株，组培流程简单可行，成苗周期短，产品一致性高，整体品质标准可控等优点，是实现杏黄兜兰商品化生产的一种简便、快速、有效的繁殖方法。
(2)本发明方法走茎诱导率高，走茎粗壮；外植体灭菌率达76％，外植体诱导率达50％以上，单芽平均诱导丛生芽1.5-3.3个，平均增殖倍数2.07-3.4倍，平均生根数2-4.5条，最快240d即可出瓶移栽，移栽成活率均在88％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
一种杏黄兜兰的无性繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获得和处理
在10月份，选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株，移入温室中培养，诱导走茎分蘖生长。移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消毒3min，栽培基质采用泥炭：树皮：锯末：木炭：羊粪(v/v)＝3:3:2:1:1混合均匀，树皮、锯末均经过充分腐熟，使用前经121℃高压灭菌20min；栽培容器采用口径12.5cm，高10cm的瓦盆，使用前在500倍的高锰酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。保持温度28℃，湿度60％，遮阴度50％，隔7d浇1次无菌水。5个月后，每盆母株分蘖生长出3-4条浅紫色走茎，长度8-9cm，直径3-3.5mm。
(2)外植体采集
从花盆里小心取出整株杏黄兜兰，选择长8-9cm、直径>3mm的走茎10条，要求走茎生长健壮，苞片紧密贴合茎段。将选好的走茎在流水下冲洗60min，之后取出，用软毛刷蘸取质量分数为0.1％的洗洁精溶液清洗5min，清理干净走茎表面污物后，选取整条走茎作为外植体。
(3)外植体表面消毒
在超净工作台上，将选取好的外植体置入75％的酒精中浸泡30s，无菌水清洗3次后取出，在无菌培养皿中用无菌滤纸吸干走茎表面的水分，然后在走茎的单个节间上，用手术刀以“t”字形划割法小心环切去除苞片，注意勿划伤节处具隐芽的区域，再置入0.1％的升汞中消毒1.5min后取出，置入无菌水中漂洗7次。
(4)诱导培养
在无菌培养皿上，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，切除走茎接触消毒液的一端4mm，然后将走茎切段，要求每段保留1个节，节上部保留1/3节段，下部保留2/3节段，将切割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入培养基表面，拧紧瓶盖，置入温度25℃培养室。诱导培养基为1/2ms+6-ba0.8mg/l+naa0.2mg/l+活性炭1g/l+蛋白胨1.5g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。避光培养60d后，污染率达42％，诱导率为21.8％。
(5)丛生芽诱导
将步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽小心切下，转接入丛生芽诱导培养基：1/2ms+ba0.05mg/l+naa0.02mg/l+蛋白胨1.5g/l+苹果汁15ml/l+土豆汁20ml/l+香蕉汁60ml/l+活性炭1g/l+蔗糖30g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6，置入日温25℃，夜温15℃的培养室，每天光照12h，光照强度1000lx。继续培养45d后每个单芽可诱导丛生芽1.5-2.7个，芽较皱缩，长度1-2cm。
(6)增殖培养
将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶，清理干净根部附着的培养基，2株/丛转接入增殖培养基：1/2ms+tdz0.08mg/l+2,4-d2mg/l+蛋白胨1g/l+香蕉汁80ml/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。温度25℃，每天光照12h，光照强度1000lx。培养45d后平均每瓶丛生芽增殖2.07倍，无变异。
(7)壮苗生根培养
将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基1/2ms+6-ba0.8mg/l+naa0.08mg/l+活性炭1g/l+蛋白胨1.0g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。温度25℃，每天光照12h，光照强度2000lx。培养90d后组培苗生根2-3.5条，株高2-3cm，叶片较绿。
(8)试管苗移栽
将杏黄兜兰具3厘米高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部附着的培养基，采用口径为5㎝的透明营养钵移栽，3株/杯。
栽培基质为碎松树皮：木炭(v/v)＝3:1混合均匀，基质粒径1cm，碎松树皮需充分腐熟后使用。移栽场地保持良好的通风，移栽后第1个月遮阴度80％，湿度控制在85％，移栽成活率88.5％。
实施例2
一种杏黄兜兰的无性繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获得和处理
在10月份，选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株，移入温室中培养诱导走茎分蘖。移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消毒3min，栽培基质采用泥炭：树皮：锯末：木炭：羊粪(v/v)＝3:3:2:1:1混合均匀，树皮、锯末、羊粪均经过充分腐熟，使用前经121℃高压灭菌20min；栽培容器采用口径12.5cm，高13cm的瓦盆，使用前在500倍的高锰酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。种植时根部深埋，微露出茎基部。保持日温28℃，夜温18℃，湿度65％，遮阴度60％，隔10d浇1次无菌水。6个月后，每盆杏黄兜兰母株分蘖生长出4-5条粉白色走茎，长度9-10cm，直径3.5-4mm。
(2)外植体采集
从花盆里小心取出整株杏黄兜兰，选择长9-10cm、直径3.5-4mm的走茎10条，要求走茎生长健壮，苞片粉白色且紧密贴合茎段。将选好的走茎在流水下冲洗60min，取出后用软毛刷蘸取质量分数为0.1％的洗洁精溶液清洗5min，清理干净走茎表面污物后，选取顶端幼嫩的4个节段作为外植体。
(3)外植体表面消毒
在超净工作台上，将选取好的外植体置入75％的酒精中浸泡30s，无菌水清洗3次后取出，在无菌培养皿中用无菌滤纸吸干走茎表面的水分，然后在走茎的单个节间上，用手术刀以“t”字形划割法小心环切去除该节段上3/4的苞片，该条走茎的每个节间依次处理完成后，将整条走茎置入0.1％的升汞中消毒1min，无菌水中漂洗3次后，用无菌滤纸吸干走茎表面的水分，再用同样的环切方法小心去除节间上剩余的1/4苞片，环割时注意勿划伤节处具隐芽的区域，之后将外植体再次置入0.1％的升汞中消毒40s，用灭菌后的镊子取出，置入无菌水中漂洗4次取出。
(4)诱导培养
在无菌培养皿上，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，切除走茎接触消毒液的一端5mm，然后将走茎切段，要求每段保留1个节，节上部保留1/3节段，下部保留2/3节段，将切割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入培养基表面，拧紧瓶盖，置入温度25℃培养室培养。诱导培养基为1/2ms+6-ba1.5mg/l+naa0.8mg/l+活性炭1g/l+蛋白胨1.5g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。避光培养60d后，污染率23.7％，诱导率为51.9％。
(5)丛生芽诱导
将步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽小心切下，转接入丛生芽诱导培养基：1/2ms+ba0.15mg/l+naa0.08mg/l+蛋白胨1.5g/l+苹果汁30ml/l+土豆汁40ml/l+香蕉汁80ml/l+活性炭1g/l+蔗糖40g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6，置入日温25℃，夜温15℃的培养室继续培养，每天光照12h，光照强度1000lx。继续培养60d后，每个单芽可诱导丛生芽2-3个，芽饱满有光泽，长度2-2.9cm。
(6)增殖培养
将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶，清理干净根部附着的培养基，3株/丛转接入增殖培养基：1/2ms+tdz0.15mg/l+2,4-d4mg/l+蛋白胨1g/l+香蕉汁120ml/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。温度25℃，每天光照12h，光照强度1000lx。培养50d后平均每瓶丛生芽增殖2.83倍，未见变异。
(7)壮苗生根培养
将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基1/2ms+6-ba1.5mg/l+naa0.15mg/l+活性炭3g/l+蛋白胨1.0g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。温度25℃，每天光照12h，光照强度2000lx。培养90d后，组培苗生根3.5-4条，株高2.8-3.5cm，叶片平展有光泽。
(8)试管苗移栽
将杏黄兜兰具3厘米高的完整植株从培养室转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部附着的培养基，以80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡植株8min后，自然阴干，采用口径为5㎝的透明营养钵移栽，5株/杯。
栽培基质为碎松树皮：火山岩：木炭(v/v)＝4:2:1混合均匀，基质粒径1.5cm，碎松树皮需充分腐熟后使用。移栽场地保持良好的通风，移栽后第1个月遮阴度85％，湿度控制在90％，移栽成活率达93.5％。
实施例3
一种杏黄兜兰的无性繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获得和处理
在10月份，选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株，移入温室中培养，诱导走茎分蘖生长。移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消毒3min，栽培基质采用泥炭：树皮：锯末：木炭：羊粪(v/v)＝3:3:2:1:1混合均匀，树皮、锯末均经过充分腐熟，使用前经121℃高压灭菌20min；栽培容器采用口径12.5cm，高10cm的瓦盆，使用前在500倍的高锰酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。保持温度28℃，湿度63％，遮阴度55％，隔8d浇1次无菌水。5.5个月后，每盆母株分蘖生长出4条粉白色走茎，长度9cm，直径3.5mm。
(2)外植体采集
从花盆里小心取出整株杏黄兜兰，选择长9cm、直径3.5mm的走茎10条，要求走茎生长健壮，苞片紧密贴合茎段。将选好的走茎在流水下冲洗60min，之后取出，用软毛刷蘸取质量分数为0.1％的洗洁精溶液清洗5min，清理干净走茎表面污物后，选取顶端幼嫩的3个节段作为外植体。
(3)外植体表面消毒
在超净工作台上，将选取好的外植体置入75％的酒精中浸泡30s，无菌水清洗3次后取出，在无菌培养皿中用无菌滤纸吸干走茎表面的水分，然后在走茎的单个节间上，用手术刀以“t”字形划割法小心环切去除苞片，注意勿划伤节处具隐芽的区域，再置入0.1％的升汞中消毒1min，无菌水中漂洗3次后，用无菌滤纸吸干走茎表面的水分，再用同样的环切方法小心去除节间上剩余的1/4苞片，环割时注意勿划伤节处具隐芽的区域，之后将外植体再次置入0.1％的升汞中消毒40s，用灭菌后的镊子取出，置入无菌水中漂洗4次取出。
(4)诱导培养
在无菌培养皿上，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，切除走茎接触消毒液的一端4.5mm，然后将走茎切段，要求每段保留1个节，节上部保留1/3节段，下部保留2/3节段，将切割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入培养基表面，拧紧瓶盖，置入温度25℃培养室。诱导培养基为1/2ms+6-ba1mg/l+naa0.5mg/l+活性炭1g/l+蛋白胨1.5g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。避光培养60d后，污染率达23％，诱导率为55.3％。
(5)丛生芽诱导
将步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽小心切下，转接入丛生芽诱导培养基：1/2ms+ba0.1mg/l+naa0.05mg/l+蛋白胨1.5g/l+苹果汁20ml/l+土豆汁30ml/l+香蕉汁70ml/l+活性炭1g/l+蔗糖40g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6，置入日温25℃，夜温15℃的培养室，每天光照12h，光照强度1000lx。继续培养45d后每个单芽可诱导丛生芽2.5-3.3个，芽饱满有光泽，长度2.3-3cm。
(6)增殖培养
将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶，清理干净根部附着的培养基，3株/丛转接入增殖培养基：1/2ms+tdz0.1mg/l+2,4-d3mg/l+蛋白胨1g/l+香蕉汁100ml/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。温度25℃，每天光照12h，光照强度1000lx。培养45d后平均每瓶丛生芽增殖3.4倍，无变异。
(7)壮苗生根培养
将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基1/2ms+6-ba1mg/l+naa0.1mg/l+活性炭2g/l+蛋白胨1.0g/l+蔗糖20g/l+琼脂4.9g/l，ph5.6。温度25℃，每天光照12h，光照强度2000lx。培养90d后组培苗生根3.5-4.5条，株高3-4cm，叶片平展有光泽。
(8)试管苗移栽
将杏黄兜兰具3厘米高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部附着的培养基，以80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡植株8min后，自然阴干，采用口径为5㎝的透明营养钵移栽，4株/杯。
栽培基质为碎松树皮：木炭(v/v)＝3:1混合均匀，基质粒径1.5cm，碎松树皮需充分腐熟后使用。移栽场地保持良好的通风，移栽后第1个月遮阴度83％，湿度控制在88％，移栽成活率97％。
按照实施例1、实施例2、实施例3中的方案分别对杏黄兜兰进行组织培养，调查、统计单芽平均诱导丛生芽、单芽平均增殖倍数、单芽平均生根数和移栽成活率。
表1丛生芽增殖系数和成苗率测定
从表1可知，按照实施例1-3中的技术方案进行组织培养，本发明的实施例1-3中方法的杏黄兜兰走茎诱导率高，走茎粗壮；外植体灭菌率达76％，外植体诱导率达50％以上，单芽平均诱导丛生芽1.5-3.3个，平均增殖倍数2.07-3.4倍，平均生根数2-4.5条，最快240d即可出瓶移栽，移栽成活率均在88％以上。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。