一种文物霉菌防霉剂的制备及应用的制作方法

本发明属于生物技术杀菌剂领域，涉及一种抑制文物上常见优势霉菌如青霉和曲霉生长的防霉剂的制备及应用领域，本配方制得的以脂肽类物质为活性成分的防霉剂对易滋长霉菌的纸质、丝织品、皮革制品、竹木等有机质材料均有良好抑菌效果；对于滋生了霉菌的上述文物，经过防霉剂处理，可以有效抑制霉菌的生长。

背景技术：

1、设计文物霉菌抑菌剂的意义：

我国的历史文化源远流长，传承的珍贵文物不尽其数，但有机质文物易受霉菌侵袭。霉菌对文物的破坏是多方面的：霉菌在生长过程中利用有机质中的养分，对文物造成直接的破坏；霉菌代谢过程中释放热量加速了文物的破坏；霉菌的生长过程中固着于有机质，形成菌斑，甚至有些霉菌会产生使基质着色的色素；霉菌的代谢产物如酶类及其它产物可对文物造成直接破坏，如产生对文物有腐蚀作用的有机酸。另外，古籍修复工作和潮湿条件下的房屋家具受霉菌威胁等也都需要抑制霉菌的生长。因此，设计和研制有效的、绿色环保的霉菌杀菌剂具有在实际中具有重要意义。

2、常用防霉剂及其存在的缺陷

(1)传统无机防霉剂：化学药品之类的无机防霉剂是当下广泛应用的防霉剂。无机防霉剂通常具有耐热性好、持续性好、抗菌范围广等优点。但化学药剂本身有毒性和腐蚀性，如百里酚lag002和lag003，通过银离子的抑菌作用防霉，还有一些防霉剂由无机盐硫酸铜、氯化汞、氟化钠等制成。这些防霉剂共同的特点是毒性大，对人体和环境有很大威胁。

(2)新型低毒防霉剂：nmf-1防霉剂、香叶醇长效抗霉灵等，虽然它们保证了低毒、甚至无毒的特性，但它们的主要防霉成分属于油性物质，不可水溶，使用方法单一，有较强挥发性，防霉时间较短，需要定时补充，制备较为复杂。

(3)有机防霉剂：一般主要由酚类(如苯酚)、氯酚类(如五氯酚)、有机汞盐(如油酸苯基汞)、有机铜盐(如8-羟基喹啉铜)、有机锡盐(如氯化三乙或三丁基锡等)等制成。特点是有一定毒性，对人有一定危害，同时对含有蛋白质成分的文物如皮革等具有腐蚀作用。

3、文物除霉措施及存在的问题

目前文物保护主要靠控制污染源头，对保存的大环境、局部环境、微环境应用低温、避光以及减少人为的外源性污染等措施。对于出现霉菌滋生的文物所采取的措施主要是首先对生长的霉菌进行清洗，然后用一些有无机防霉的化学药品进行处理。但是这样的方法有很大弊端，因为化学药剂本身的毒性、腐蚀性等都会带来危害，即使是使用精密仪器对文物进行清洗也会伤害文物表面。苏格兰一些古代石砌建筑物曾采用化学物质清洗青苔，但是几年后这些青苔又“卷土重来”。因此，绿色环保和无毒高效防霉剂的研究非常必要。常用防霉剂的毒性和腐蚀性对文物、人体健康和环境均有危害。因此有必要研究无毒，低成本、不易挥发、抑菌谱广、使用方式多样的文物防霉剂。

4、脂肽类物质的抗真菌作用：

脂肽类物质主要是细菌在代谢中产生的生物表面活性剂。它是由肽链和脂肪酸组成的一类两亲性物质。它在抗支原体、杀虫、抗肿瘤、抗病毒以及抗真菌等方面发挥巨大作用。作用机制是多方面的，包括引起膜结构的改变或损伤、抑制细胞壁合成、诱导细胞凋亡、抑制蛋白质、dna、rna合成等。如有学者研究得出，海洋芽孢杆菌产生的脂肽类物质可以破坏真菌的孢子和过度溶解多核的菌丝。同时有学者研究得出抗菌脂肽对哺乳动物细胞无致突变性或潜在的遗传毒性。本发明将细菌产生的含有脂肽类物质的发酵液制成生物防霉剂，具有无毒，低成本、不易挥发、抑菌谱广、使用方式多样等特点。

技术实现要素：

本发明利用枯草芽孢杆菌的发酵液，内含对霉菌具有强烈抑菌活性的脂肽类物质，制备生物防霉剂，具有高效、无毒和环保的特性。

1.细菌菌株：本发明所使用的是本研究室筛选获得的细菌菌株(61号)，经过16srdna序列分析属于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，该菌种已经于2018年8月15日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，用于专利程序的生物材料保存，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.16222，该菌株代谢产物中含有脂肽类物质，对青霉和黑曲霉等霉菌有很强的抑菌效果。

2.最佳发酵条件：将61号菌转接到lb平板上，37℃培养24h；用接菌环取一菌环大小(约直径4mm)的菌落接种于含有100mllb液体培养基的250ml三角瓶中，37℃、250rpm培养24h作为种子液，然后取菌液接种到landy发酵培养基，接种量为9％，接种后于37℃、250rpm培养32-48h,培养结束后将发酵液离心(12000rpm,10min)，上清液再通过细菌过滤器，获得含脂肽的无菌发酵液。

landy培养基配方：向950ml双蒸水中加入葡萄糖20g、l-谷氨酸5g、kh2po41g、mgso4·7h2o0.5g、kcl0.5g、酵母粉1g、l-苯丙氨酸2×10-3g、mnso45×10-3g、cuso4·5h2o0.16×10-3g、feso4·7h2o0.15×10-3g，待溶质溶解后调ph值至7.0，用双蒸水补至1000ml，115℃高压灭菌20min。

3.最小抑菌浓度：将发酵液分别稀释5倍、10倍和15倍，分别用发酵液原液、5倍稀释液、10倍稀释液和15倍稀释液针对实验室保存的产黄青霉和黑曲霉进行平板抑菌实验。具体方法是分别取0.2ml产黄青霉和黑曲霉的孢子悬液(浓度为10⁶-10⁷/m)涂布pda平板，于28℃培养6hr后用直径为0.5厘米的无菌滤纸片分别蘸取发酵液原液及稀释液，贴到pda平板上，继续在28℃培养12-24hr，观察并测量抑菌圈大小。结果发现，稀释5倍发酵液(脂肽类物质的浓度为3-5μg/ml)具有最佳的抑菌效果，稀释10倍发酵液(脂肽浓度为1.2-2.5μg/ml)仍然有抑菌活性，稀释15倍发酵液失去抑菌活性。因此发酵液最低抑菌浓度为稀释10倍发酵液，脂肽类物质含量为1.2-2.5μg/ml。

4.脂肽类物质检测及浓度测定

取一定量发酵液，用naoh溶液把ph调到7.5-9.0,10000rpm离心15min，取上清，用hcl把上清液的ph调到2.0，用同体积的chcl3/ch3oh(v/v.3/1)连续萃取上清5次，合并萃取相，浓缩，用ph2.0的hcl水溶液洗涤5次，再减压蒸发去除有机相，所得到的样品做氨基酸分析，用以计算脂肽含量，脂肽含量按下式计算，其中c为脂肽浓度，mol.l^-1；v为发酵液体积，l；m为谷氨酸的质量，g；m为谷氨基酸的分子量：c＝m/(v×m)，mol.l^-1

同时用该样品进行tlc分析。将样品溶于ch2cl2，薄板层析(tlc)，展开剂为chcl3/ch3cooh(v/v.8/2)。展开之后吹干，把薄板放入密闭的容器内，于110加热1h，采用浓hcl原位水解，喷洒茚三酮并加热显色。

5.保存条件：将含有脂肽类抑菌物质的发酵液及稀释液分别保存在室温和4℃，保存不同时间后分别检验抑菌活性。结果发现这两种条件下保存到第三个月其最小抑菌浓度与新制备的发酵液的最小抑菌浓度相同，即这两种条件下保存三个月内抑菌能力没有明显变化。

6.实物模拟抑霉菌实验：选取纸张、丝绸、皮革、竹子作为材料，模拟不同材质的文物进行模拟防霉或抑霉实验。分别选取上述材料两份，一份为对照组，另一份为实验组。在对照组各种材料表面喷洒无菌水，在实验组各种材料表面喷洒不同稀释度的发酵液。喷洒后放置30min，再分别喷洒浓度为10⁶-10⁷/ml的产黄青霉和黑曲霉的孢子悬液,将各种接了菌的材料放置到pda平板的表面，提供产黄青霉和黑曲霉生长的营养。然后于28℃培养1-3天。观察产黄青霉和黑曲霉在上述几种材料上的生长情况。结果发现在对照组的纸张、丝绸、皮革、竹子上都长满了所接种的产黄青霉或黑曲霉。喷洒不同浓度的发酵液实验组，在纸张、丝绸、皮革、竹子上几乎没有霉菌生长，特别是5倍稀释发酵液，抑霉效果更明显。

7.文物抑霉菌实验

中国国家博物馆保藏的非洲木雕文物，有几个不同程度的生长了霉菌，我们首先用脱脂棉蘸上无菌水将生长的霉菌清除，然后用61号菌发酵液的无菌上清5倍稀释液制成的防霉剂进行处理，即用脱脂棉球蘸上防霉剂处理长菌部位，处理两次。结果发现用生物防霉剂处理后的效果非常好，1年半过去了，原来长菌的部位依然没有长菌。

附图说明：

图1防霉剂室温放置不同时间对黑曲霉的抑制作用，室温及4℃保存三个月抑菌效果基本保持不变

图2防霉剂室温放置不同时间对青霉的抑制作用，室温及4℃保存三个月抑菌效果基本保持不变

图3防霉剂中脂肽类的tlc检测，椭圆形中深色部分为脂肽类物质

图4防霉剂对纸张的抑霉实验，左为对照，中为抑制青霉，右为抑制黑曲霉(对照组先喷洒无菌水，然后接种霉菌孢子；实验组先喷洒防霉剂，然后喷洒霉菌孢子)

图5防霉剂对丝绸的抑霉实验，左为对照，中为抑制青霉，右为抑制黑曲霉(对照组先喷洒无菌水，然后接种霉菌孢子，培养后观察结果；实验组先喷洒防霉剂，然后喷洒霉菌孢子，培养后观察结果)

图6防霉剂对皮革的抑霉实验，左为对照，中为抑制青霉、右为抑制黑曲霉(对照组先喷洒无菌水，然后接种霉菌孢子，培养后观察结果；实验组先喷洒防霉剂，然后喷洒霉菌孢子，培养后观察结果)

图7防霉剂对竹条的抑霉实验，左对照、中为抑制青霉、右为抑制黑曲霉(对照组先喷洒无菌水，然后接种霉菌孢子，培养后观察结果；实验组先喷洒防霉剂，然后喷洒霉菌孢子，培养后观察结果)

具体实施方式：

1.发酵条件及抑霉剂的制备

将61号菌划线接种到lb平板上，37℃培养24h，选取单菌落，用接菌环取一菌环菌(直径大小约4mm)接种到含有100mllb液体培养基的250ml三角瓶中，37℃、250rpm培养24h作为种子液。种子液含菌浓度为5×10⁶-6×10⁷，od560为0.4-0.6。取种子液9ml接种到250ml三角瓶中，内装有100ml的landy培养基，于37℃、250rpm培养32-48h。培养结束后将发酵液于4℃离心(12000rpm,10min)，离心上清再经过滤膜孔径为0.24μm的细菌过滤器，无菌滤液即含有脂肽类物质的无菌发酵液原液，原液于4℃保存备用。

2.发酵液对产黄青霉和黑曲霉的平板抑菌实验

将保存的无菌发酵液分别稀释5倍、10倍和15倍，分别测定脂肽类物质的浓度。分别用发酵液原液、5倍稀释液、10倍稀释液和15倍稀释液针对实验室保存的产黄青霉和黑曲霉进行平板抑菌实验。具体方法是分别取0.2ml产黄青霉和黑曲霉的孢子悬液(浓度为10⁶-10⁷/m)涂布pda平板，于28℃培养6hr后用直径为0.5厘米的无菌滤纸片分别蘸取发酵液原液及稀释液，贴到pda平板上，继续在28℃培养12-24hr，观察并测量抑菌圈大小(图1、图2)。结果发现，稀释5倍发酵液(脂肽类物质的浓度为3-5μg/ml)具有最佳的抑菌效果，稀释10倍发酵液(脂肽浓度为1.2-2.5μg/ml)仍然有抑菌活性，稀释15倍发酵液失去抑菌活性。发酵液最低抑菌浓度为稀释10倍发酵液，脂肽类物质含量为1.2-2.5μg/ml。

3.抑霉剂中脂肽类物质检测及浓度测定

取一定量发酵液，用naoh溶液把ph调到7.5-9.0,10000rpm离心15min，取上清，用hcl把上清液的ph调到2.0，用同体积的chcl3/ch3oh(v/v.3/1)连续萃取上清5次，合并萃取相，浓缩，用ph2.0的hcl水溶液洗涤5次，再减压蒸发去除有机相，所得到的样品做氨基酸分析，用以计算脂肽含量，脂肽含量按下式计算，其中c为脂肽浓度，mol.l^-1；v为发酵液体积，l；m为谷氨酸的质量，g；m为谷氨基酸的分子量：c＝m/(v×m)，mol.l^-1

同时用该样品进行tlc分析。将样品溶于ch2cl2，薄板层析(tlc)，展开剂为chcl3/ch3cooh(v/v.8/2)。展开之后吹干，把薄板放入密闭的容器内，于110加热1h，采用浓hcl原位水解，喷洒茚三酮并加热显色。发酵液中脂肽类物质的活性检测见附图3，脂肽类物质的浓度为16.25-26.30μg/ml

4.实物抑霉菌模拟实验

选取纸张、丝绸、皮革、竹子作为材料，模拟不同材质的文物进行模拟防霉或抑霉实验。分别选取上述材料两份，一份为对照组，另一份为实验组。在对照组各种材料表面喷洒无菌水，用量为1ml/2.5cm²，在实验组各种材料表面喷洒无菌发酵液原液及不同稀释度的发酵液，用量为1ml/2.5cm²。喷洒后于室温放置30min，再分别喷洒浓度为10⁶-10⁷/ml的产黄青霉和黑曲霉的孢子悬液,用量为1ml/10cm²，将对照组和实验组的各种材料放置于一个直径为20cm的大培养皿中，放入一个蘸水的脱脂棉球，盖上皿盖，于28℃培养1-3天。观察产黄青霉和黑曲霉在上述几种材料上的生长情况。结果发现在对照组的纸张、丝绸、皮革、竹子上都长满了所接种的产黄青霉或黑曲霉。喷洒不同浓度的发酵液实验组，在纸张、丝绸、皮革、竹子上几乎没有霉菌生长，用蒸馏水稀释5倍后抑霉效果最为显著(图4-图7)。