一种油用牡丹矮化抗逆品种选育技术的制作方法
本发明属木本植物育种栽培领域，更具体地，涉及油用牡丹矮化抗逆品种的选育方法。具体而言，本发明涉及一种从野生的或栽培的具有结实能力的牡丹资源中，选择矮化、抗逆、优质高产的油用牡丹品种或植株。
背景技术：
牡丹属于芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonial.)牡丹组(sect.moutandc.)植物，原毛莨科基于两个事实与毛茛科不符，1950年从中划出单独成为一个科分类单位。一是其雄蕊发育循序从内到外而毛莨科其他属植物则从外向内；二是普遍含芍药甙(paeoniflorin)和丹皮甙(paeonoside)，有别于毛莨科植物特有的两种化学成分:毛莨甙(ranunculin)和木兰花碱(magnoflorine)。牡丹组植物8个种全部原产我国，其中，革质花盘亚组6种：牡丹[p.suffruticosa，包括牡丹(原亚种，p.suffruticosasubsp.suffruticosa)和银屏牡丹(p.suffruticosasubsp.yinpingmudan)]、矮牡丹(p.jishanensis)、卵叶牡丹(p.qiui)、凤丹[洪涛教授命名为杨山牡丹(p.ostii)，沈宝安命名安徽铜陵凤凰山等地药用栽培品种为‘凤丹’(p.ostiivar.lishizhenii)，此文为叙述方便乃沿用‘凤丹’名称]、紫斑牡丹[p.rockii，包括紫斑牡丹(原亚种，p.rockiisubsp.rockii)，太白山紫斑牡丹(p.rockiisubsp.taibaishanica)]、四川牡丹[p.decomposita，包括四川牡丹(原亚种，p.decompositasubsp.decomposita)，圆裂四川牡丹(p.decompositasubsp.rotundiloba)]。肉质花盘亚组2种：滇牡丹(p.delavayi，包括原紫牡丹，p.delavayi、黄牡丹p.lutea和狭叶牡丹，p.potanini，花和叶多态性，兼有性和无性繁殖，肉质根纺锤状)、大花黄牡丹(p.ludlowii)。牡丹生态习性的经典表述为“宜冷畏热、喜燥恶湿，栽高敝向阳而性舒”。其抗逆性追溯到牡丹起源环境，据文献(余树勋，吴应祥.花卉词典.农业出版社,1993:334)记载，牡丹(p.suffruticosa)“原分布于不丹，我国西藏及国内其他山区”，解释牡丹肉质根系喜排水良好的深厚砂质壤土，富含腐殖质、疏松透气的粘土也能生长良好；地上部分叶片喜光也较耐阴，在裸露荒地，有光斑的生态林下能正常生长发育。最近关于‘凤丹’抗逆基因及其表达调控的研究，为其抗逆性强适应性广提供部分分子基础。
牡丹的用途作为中国传统中药材和中国传统名花，已有1600多年栽培历史。1998年王华芳在staden教授实验室剥离‘凤丹’种胚进行愈伤组织培养时发现‘凤丹’胚乳富含脂肪，赵孝庆2004年据此分析其牡丹籽油成分；王华芳等测试5种牡丹(‘凤丹’、牡丹、大花黄牡丹、四川牡丹和紫斑牡丹)和芍药2个居群(菏泽芍药和甘肃芍药)的种籽含油量、脂肪酸组成及含量和卫生指标，表明牡丹籽含油率约为20％(有壳)或29％(去壳)，不饱和脂肪酸含量88％以上；其中，油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量分别为23％、25％和44％，比例约为1∶1∶2；牡丹籽油中黄曲霉素b1、砷、铅、汞、铬的含量及过氧化值(以下简称食品卫生指标)均符合国家食品卫生标准。根据‘凤丹’果实发育转录组差异表达基因及其功能构建了种籽发育及其脂肪酸合成的分子调控网络机制；克隆并登录了α-亚麻酸合成的3个关键酶靶基因：硬脂酸脱氢酶(sad，kx078474)、ω-6脂肪酸脱氢酶(fad7，kx078475)，ω-3脂肪酸脱氢酶(fad3，kt717709)，为建立分子育种技术奠定基础。
牡丹选种主要是观赏品种的选育，选育颜色和花形观赏价值大的单株进行无性繁殖成为品种。主要的观赏品种来自中原地区栽培的牡丹(p.suffruticosa)的白、粉、黄、绿、红、蓝、紫、复色及其单瓣、重瓣的品种上千个；紫斑牡丹(p.rockii)品种500多个(李嘉珏,张西方,赵孝庆.中国牡丹[m].北京:中国大百科全书出版社,2011)，单瓣结实的品种被认为观赏性状不如重瓣不结实或难以结实的品种。重瓣不结实的品种一般以嫁接和分株繁殖，繁殖数量和质量局限于观赏需要。牡丹的药用品种注重药材的道地性，安徽铜陵等地普遍栽培的‘凤丹’(p.ostiivar.lishizhenii)，种子繁殖容易，栽培成本低，根皮即牡丹皮质量上乘，为药用主栽品种，也是本发明所述的油用牡丹主栽品种。
牡丹矮化突变体选择是获得矮化品种的简便易行方法。我国的传统名花在天然杂交和栽培过程中随机形成各种矮化突变体(矮化植物)，经过认真选择可以找到理想的矮化品种用于观赏。例如中原地区栽培的牡丹品种群，其培育5年后正常开花的株高为25-150cm，其差异之大，从中选择株高小于40cm的品种作为矮化品种是可能的。牡丹株高生长主要受赤霉素(ga)调控，牡丹植株ga生物合成途径关键步骤的调控基因及其表达、代谢抑制剂施用等均对ga合成产生干扰，植株伸长对ga反应不敏感的植株(突变体)等均具有矮化特性。到目前为止，用以控制植株高度的矮化剂绝大部分是ga生物合成的抑制剂。通过特征基因、生理反应和植株形态等多层次测试评价，筛选获得遗传稳定的矮化牡丹植株或品种。
牡丹抗逆品种的培育已由传统的抗逆生理指标测试选择逐渐转变为抗逆基因的表达鉴定筛选。dreb基因即缺水响应元件结合蛋白，能特异地结合启动子中含有dre/crt顺式元件，在低温、干旱和盐碱等逆境胁迫下，通过调节下游逆境应答基因的表达来提高植物的抗逆性；wrky基因是高等植物中最大的转录因子家族之一，被认为是植物非生物胁迫的中心调控因子，在植物抗逆过程中起到重要作用；xet基因响应干旱信号协同调控根系生长提升植株抗旱性。国家林业局重点项目“名优花卉微型化品种培育技术研究”(1996--13)实施以来，已克隆了‘凤丹’3个抗逆关键基因dreb(kt890350)、wrky(kt890351)、xet(kt890352)，紫斑牡丹基因组中同样含有dreb(kx121328)、wrky(kx121409)、xet(kx121369)基因。通过对抗逆基因的表达鉴定，筛选获得抗逆性强的牡丹植株或品种。
油用牡丹育种资料中，一种高产油量牡丹新品种选育方法(cn107896974a)以植物生长调节剂赤霉素、杀虫剂、肥料为0.5％的尿素或磷酸二氢钾溶液喷施植株，进行杂交。油用牡丹的育种方法(cn107306540a)为一种常规林木育苗方法。油用牡丹的育种方法(cn105660139a)以生长调节剂赤霉素处理种子，消毒剂甲哨唑处理种子，在广西播种育苗。一种提高油用牡丹抗旱性的育种方法(cn106866241a)聚丙烯酸钾、脯氨酸、甜菜碱处理种子不改变遗传组成的栽培方法。一种具有观赏和油用价值的牡丹新品种选育(cn105248270a)杂交和赤霉素处理种子的常规选育方法。
技术实现要素：
本发明基于林木育种程序，发明以植物生理学、生物化学与分子生物学测试分析技术测试评价矮化、抗逆的油用牡丹品种或植株的方法，初步筛选油用品种资源。对初选品种或植株进行生理生化、基因功能为基础的分子测试，评价具有遗传基础的矮化、抗逆、优质高产的油用牡丹品种或植株(单株繁殖形成品种)。
选育方法涉及油用牡丹矮化、抗逆及优质高产三种特性的优选。矮化特性基于赤霉素合成关键基因即贝壳杉烯氧化酶编码基因ko(kaureneoxidase)的鉴定及表达测试，涉及的ko基因为‘凤丹’的但不限于poko的同源基因；ga高浓度及矮化剂适当浓度处理并筛选矮化特性种子；ga高浓度及矮化剂适当浓度处理田间植株并筛选矮化突变体。本发明的矮化选育技术不同于传统施用矮化剂达到植株生理矮化效果的方式，从基因的角度选育稳定遗传的矮化材料。抗逆特性选育基于抗逆基因的鉴定及表达测试，涉及的抗逆基因为‘凤丹’的但不限于podreb2a、powrky19、poxet的同源基因；生理生化指标的测试及其隶属函数指标评价。优质高产特性基于种籽产量含油量、不饱和脂酸酸组成、食品安全卫生指标等的测试和评价。
因此，本发明提供以下各项：
1.一种油用牡丹矮化品种或植株的选育方法，所述方法包括鉴定油用牡丹矮化品种或植株的步骤，其特征在于选育赤霉素合成关键基因即贝壳杉烯氧化酶编码基因ko(kaureneoxidase)的表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较低的油用牡丹品种或植株。
2.根据以上1所述的方法，所述方法还包括用赤霉素(ga)和/或矮化剂(优选优康唑)处理和筛选矮化特性种子，和/或用赤霉素(ga)和/或矮化剂(优选优康唑)处理田间植株筛选矮化突变体。
3.根据以上1或2所述的方法，其中所述赤霉素合成关键基因ko是通过使用seqidno:1所示的ko同源序列来鉴定的，特别地，‘凤丹’的基因ko(poko)的全长序列如seqidno:2所示。
4.一种油用牡丹抗逆品种或植株的选育方法，所述方法包括鉴定油用牡丹抗逆品种或植株的步骤，其特征在于选育具有地上部分抗逆关键基因dreb2a、wrky且有表达和/或具有根系xet基因且表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较高的油用牡丹品种或植株。
5.根据以上4所述的方法，所述方法还包括对植株抗逆(例如抗寒、抗旱、抗盐碱)生理指标进行测试评价。
6.根据以上4或5所述的方法，其中dreb2a是通过使用seqidno:3所示的dreb2a同源序列来鉴定的，wrky是通过使用seqidno:4所示的wrky同源序列来鉴定的，和/或xet是通过使用seqidno:5所示的xet同源序列来鉴定的，特别地，‘凤丹’的dreb2a基因的全长序列如seqidno:6所示，‘凤丹’的wrky基因的全长序列如seqidno:7所示，和‘凤丹’的xet基因的全长序列如seqidno:8所示。
7.一种油用牡丹矮化抗逆品种或植株的选育方法，所述方法包括：
1)鉴定油用牡丹矮化品种或植株的步骤，其中选育赤霉素合成关键基因ko的表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较低的油用牡丹品种或植株；和
2)鉴定油用牡丹抗逆品种或植株的步骤，其特征在于选育具有地上部分抗逆关键基因dreb2a、wrky且有表达和/或具有根系xet基因且表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较高的油用牡丹品种或植株。
8.根据以上1、4或7中任一项所述的方法，其中所述牡丹选自杨山牡丹(paeoniaostii)‘凤丹’(p.ostiivar.lishizhenii)、牡丹(p.suffroticosa)、紫斑牡丹(p.rokii)、大花黄牡丹(p.ludlowii)和四川牡丹(p.decomposita)以及生物工程植株。
9.根据以上1、4或7中任一项所述的方法，所述方法还包括进一步对获得的油用牡丹品种或植株的种子含水量、千粒重、单株产量、脂肪酸含量和/或组成、和/或食品卫生指标进行测定和评价。
10.一种用于油用牡丹品种或植株选育的试剂盒，其包括：(1)用于确定所述油用牡丹品种或植株中的赤霉素合成关键基因ko的表达量的试剂；和/或(2)用于确定所述油用牡丹品种或植株中的抗逆关键基因dreb2a、wrky和/或xet的表达量的试剂。
发明详述
本发明根据林木育种程序和生产无公害保健用牡丹籽油的需要，建立我国特有的油用牡丹矮化抗逆品种选育技术，包括，测试鉴定赤霉素合成关键基因ko及抗逆关键基因dreb2a、wrky、xet；赤霉素合成关键基因ko及抗逆(抗寒、抗旱或抗盐碱)关键基因dreb2a、wrky、xet表达评价；抗逆生理指标测试评价；种籽产量含油量、不饱和脂酸酸组成、食品安全卫生指标测试和评价。
根据本发明的一个方面，提供一种油用牡丹矮化品种或植株的选育方法，所述方法包括鉴定油用牡丹矮化品种或植株的步骤，其特征在于选育赤霉素合成关键基因贝壳杉烯氧化酶编码基因ko(kaureneoxidase)的表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较低的油用牡丹品种或植株。本领域技术人员能够容易理解，上述比较可以是在不同油用牡丹品种之间进行比较和同一种油用牡丹品种的不同植株之间进行比较。选择的矮化油用牡丹品种或植株可以是株高相对矮小、单瓣花、结实大的品种或单株，并且同时ko表达量相对较低的品种或单株。
在该方面的一个具体实施方案中，所述方法还包括用赤霉素(ga)和/或矮化剂处理和筛选矮化特性种子，和/或用赤霉素(ga)和/或矮化剂处理田间植株筛选矮化突变体。优选地，所述赤霉素合成关键基因ko是通过使用seqidno:1所示的ko同源序列来鉴定的，特别地，‘凤丹’的基因ko(poko)的全长序列如seqidno:2所示。特别地，可以通过简并pcr扩增来鉴定ko基因，之后通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)来定量ko基因表达。以植株矮小，ko基因表达低的单株为优株。
因此，根据该方面的一个优选实施方案，提供一种油用牡丹矮化品种鉴定选育方法。(1)从田间搜集我国特有的牡丹品种适生区，选择同种牡丹的株高相对矮小、单瓣花、结实大的单株，以分子生物学方法测试鉴定赤霉素合成关键基因ko同源基因，取材叶片，ctab法提取dna，简并pcr，pcr所需上游引物5'ytgytgyacntgyacnggnacngcntg3'，下游引物5'ccnccntgnacracrtgncgntg3'(r:a/g，n:a/t/c/g，y:c/t)，琼脂糖凝胶电泳检测产物长度300bp，测序检测产物序列；(2)实时荧光定量pcr(qrt-pcr)测试ko基因在相同条件下相对于高大植株的地上部分表达量，ko所需上游引物5'gaatttagaggtagaagagggtaag3'，下游引物5'cacaagaacgcgacaaagacata3'，产物长度120bp，以植株矮小(与对照相比)，ko基因表达量低的单株为优株；(3)以400-1000mg/lga溶液浸种处理牡丹种子，选择大多数种子不萌发情况下萌发的植株为矮化初选材料，同时以三唑类生长延缓剂(矮化剂)优康唑50-100mg/l(多效唑等其他试剂进行等效换算)在相同条件下进行种子处理，选择萌发的植株为矮化初选材料，两类材料均进行ko鉴定和表达量测定；(4)田间生长的植株，同时进行ga高浓度和矮化剂处理，选择新枝生长对处理不敏感的植株作为矮化初选材料，之后进行ko基因鉴定和表达量分析。
根据本发明的另一方面，提供一种油用牡丹抗逆品种或植株性状的选育方法，所述方法包括鉴定油用牡丹抗逆品种或植株的步骤，其特征在于选育具有地上部分抗逆关键基因dreb2a、wrky且有表达和/或具有根系xet基因且表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较高的油用牡丹品种或植株。本领域技术人员能够容易理解，上述比较可以是在不同油用牡丹品种之间进行比较和同一种油用牡丹品种的不同植株之间进行比较。优选地，dreb2a是通过使用seqidno:3所示的dreb2a同源序列来鉴定的，wrky是通过使用seqidno:4所示的wrky同源序列来鉴定的，和/或xet是通过使用seqidno:5所示的xet同源序列来鉴定的，特别地，‘凤丹’的dreb2a基因的全长序列如seqidno:6所示，‘凤丹’的wrky基因的全长序列如seqidno:7所示，和‘凤丹’的xet基因的全长序列如seqidno:8所示。特别地，可以通过简并pcr扩增来鉴定dreb2a、wrky和/或xet基因，之后通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)来定量dreb2a、wrky和/或xet基因表达。选择具有地上部分抗逆关键基因dreb2a、wrky且有表达，根系xet基因表达量高的植株为抗逆性强的候选植株。
在该方面的一个具体实施方案中，所述方法还包括对植株抗逆生理指标进行测试评价。在本发明中，该评价是通过生理指标隶属函数值来评价的。具体地，在相同栽培条件下测定牡丹植株叶片生理生化指标，包括叶片水分饱和亏缺(lwc)、电导率(el)、叶绿素含量(chla、b、a/b)、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、超氧岐化酶(sod)活性、过氧化氢酶(pod)活性、过氧化氢酶(cat)活性、丙二醛(mda)含量，计算隶属函数值(asf)，[asf＝(xi-xmin)/(xmax-xmin),xi：指标测定值，xmax和xmin：所测指标的最大值和最小值；出现负值的情况下，用反隶属函数值＝[1-(xi-xmin)/(xmax-xmin)]计算，选择排序最顶端的植株为抗逆最强的植株。通过上述生理指标隶属函数值来评价植株抗逆生理指标的方法参考以下参考文献：zhang,b.q.,yang,l.t.,&li,y.r.(2015).physiologicalandbiochemicalcharacteristicsrelatedtocoldresistanceinsugarcane.sugartech,17(1),49-58。
因此，根据该方面的一个优选实施方案，提供一种油用牡丹抗逆品种鉴定选育方法。(1)以分子生物学方法测试是否具有抗逆关键基因dreb2a、wrky和xet同源基因，其中dreb2a和wrky取材叶片、xet取材根系，ctab法提取dna，简并pcr，dreb2a所需上游引物5'tgaggtacrtgagtcachga3'，下游引物5'acdgcdgamtgnacrgcst3'，琼脂糖凝胶电泳检测产物长度200bp，wrky所需上游引物5'tcgananaartcnganctg3'，下游引物5'gcngtnctnaabgcacgn3'(b:g/t/c)，产物长度250bp，xet所需上游引物5'gchgagatntaytcsgaatt3'，下游引物5'gcngavcantavtagaggaac3'(h:a/t/c，s:g/c，v：g/a/c)产物长度650bp，测序检测产物序列；(2)植株种植在栽培箱里进行干旱梯度处理，最干旱梯度下的植株顶端叶片出现萎蔫时采集样品，实时荧光定量pcr(qrt-pcr)测试抗逆(如抗旱)关键基因dreb2a、wrky及xet同源基因表达量，dreb2a所需上游引物5'ccgccaaagtcacctgcaat3'，下游引物5'ttcgactcccaaagaaccgt3'，琼脂糖凝胶电泳检测产物长度160bp，wrky所需上游引物5'aagggaatcctaacccaagg3'，下游引物5'tccacatgtttcctcactgg3'，产物长度165bp，xet所需上游引物5'cggaacacctctggactctg3'，下游引物5'cactgccgatttccacacat3'，产物长度188bp，选择地上部分dreb2a、wrky，根系xet表达量高的植株为抗逆性强的候选植株；(3)生理指标隶属函数值评价，在相同栽培条件下测定牡丹植株叶片生理生化指标，包括叶片水分饱和亏缺(lwc)、电导率(el)、叶绿素含量(chla、b、a/b)、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、超氧岐化酶(sod)活性、过氧化氢酶(pod)活性、过氧化氢酶(cat)活性、丙二醛(mda)含量，计算隶属函数值(asf)，[asf＝(xi-xmin)/(xmax-xmin),xi：指标测定值，xmax和xmin：所测指标的最大值和最小值；出现负值的情况下，用反隶属函数值＝1-(xi-xmin)/(xmax-xmin)计算]，选择排序最顶端的植株为抗逆最强的植株。
关于上述生理指标测定方法，叶片含水量参照lu(luetal,2006)、电解质渗透率参照lu(luetal,2009)、气孔电导率参照jones(jonesetal,2003)、叶绿素含量参照arnon(arnonetal,1949)、可溶性糖含量参照zhang(zhangetal,2015)、脯氨酸含量参照shi(shietal,2012)、可溶性蛋白质含量参照bradford(bradfordetal,1976)、抗氧化酶sod、pod、cat活性参照giannopolitis(giannopolitisetal,1977)以及氧化产物mda参照shi(shietal,2012)等进行检测。
本发明的油用牡丹矮化品种或植株的选育方法和油用牡丹抗逆品种或植株的选育方法可以组合使用，用于获得同时具有矮化和抗逆性质的油用牡丹矮化抗逆品种或植株。因此，根据本发明的另一方面，提供一种油用牡丹矮化抗逆品种或植株的选育方法，所述方法包括以下步骤：1)鉴定油用牡丹矮化品种或植株的步骤，其中选育赤霉素合成关键基因ko的表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较低的油用牡丹品种或植株；和2)鉴定油用牡丹抗逆品种或植株的步骤，其特征在于选育具有地上部分抗逆关键基因dreb2a、wrky且有表达和/或具有根系xet基因且表达量相对于其他油用牡丹品种或植株较高的油用牡丹品种或植株。本领域技术人员能够理解，步骤1)和2)的顺序没有具体限制，可以先进行抗逆选育，然后进行矮化选育，或者反之亦然。
本发明的上述油用牡丹矮化和/或抗逆品种或植株的选育方法可以广泛适用于各种油用牡丹，包括但不限于杨山牡丹(paeoniaostii)‘凤丹’(p.ostiivar.lishizhenii)、牡丹(p.suffroticosa)、紫斑牡丹(p.rokii)、大花黄牡丹(p.ludlowii)和四川牡丹(p.decomposita)以及生物工程植株。特别优选杨山牡丹‘凤丹’(paeoniaostiivar.lishizhenii)。
相应地，本发明还提供一种基因同源序列分析及简并引物设计方法，以获得赤霉素合成关键基因ko、抗逆关键基因dreb2a、wrky、xet保守序列及引物。特别地，通过利用phytozomev.11.0.6数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)将osko2(koetal,2008)，fpdreb2a(ay536056)(xiuetal,2016),tawrky19(niuetal,2012)以及mtxet(dq855285)(wangetal,2008)的基因序列作为参照序列进行在线检索，检索结果表明下列17种植物ko、dreb2a、wrky、xet基因同源性较高，包括油菜(brassicarapa)，拟南芥(arabidopsisthaliana)，木瓜(caricapapaya)，橙(citrussinensis),大豆(glycinemax)，棉花(gossypiumraimondii)，苜蓿(medicagotruncatμla)，水稻(oryzasativa)，杨树(popμlustrichocarpa)，碧桃(prunuspersica)，芦苇(ricinuscommunis)，番茄(solanumlycopersicum)，高粱(sorghumbicolor)，可可树(theobromacacao)，小麦(triticumaestivum)，葡萄(vitisvinifera)和玉米(zeamays)，得到拟用于克隆牡丹ko、dreb2a、wrky、xet基因的相应同源序列，并且通过实验验证其可行性和广泛适用性。另外，根据以上17种植物同源基因比对获得的同源序列，设计简并引物，引物由primerpremier5.0software(premierbiosoftinternational，paloalto，california，usa)设计。
相应地，本发明还提供一种油用牡丹材料简并pcr测试及产物检测方法，测试鉴定赤霉素合成关键基因ko、抗逆关键基因dreb、wrky、xet。简并pcr操作在pcr仪上进行(abi,veriti96,usa)。反应试剂包括200ngdna模板，10×mgso4(fermentas)2.5μl，2mmdntp(fermentas)2.5μl，上游引物4μl，下游引物4μl，2.5utaqdnapolymerase(fermentas)0.25μl，剩余量由无核酸酶水补齐，引物浓度均为10μlmol/l，总体系25μl。pcr反应程序为94℃，10min；94℃，45s；(ko52℃、dreb2a60℃、wrky54℃、xet58℃)，30s；72℃，45s。40次循环后72℃，10min。pcr产物经由1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物长度分别为ko，300bp；dreb2a，200bp；wrky，250bp；xet，650bp。测序检测产物正确性。
相应地，本发明还提供一种油用牡丹材料的实时荧光定量pcr测试方法，获得赤霉素合成关键基因ko、抗逆关键基因dreb、wrky、xet表达测试。实时荧光定量操作在abi7000系统(abi7000sequencedetectionsystem)上进行。反应试剂包括200ng/μlcdna模板2μl，
在本发明的矮化/抗逆品种或植株选育方法的一个具体实施方案中，所述方法还包括进一步对获得的油用牡丹品种或植株的种子含水量、千粒重、单株产量、脂肪酸含量和/或组成、和/或食品卫生指标进行测定和评价，以获得矮化抗逆优质高产的油用牡丹品种。
因此，本发明还提供一种油用牡丹优质高产测试评价方法。(1)搜集开花单瓣，结实量大的品种进行种籽含水量、千粒重等测试，估算单位面积种籽产量；(2)测定种籽含油量，脂肪酸组成、主要不饱和脂肪酸油酸、亚油酸、α-亚麻酸含量和它们的总含量；(3)脂肪酸中的黄曲霉毒素b1(μg/kg)、无机砷(以as计)(mg/kg)、铅(pb)mg/kg、汞(hg)mg/kg、镉(cd)mg/kg、酸值koh(mg/g)、过氧化值(mmol/kg)；根据测定的牡丹种质资源的种籽产量、脂肪酸含量和组成、食品卫生指标等进行评价，高产、优质、安全的牡丹籽油品种资源作为选择的油用牡丹品种；(4)以qrt-pcr进行荧光定量pcr测定不饱和脂肪酸合成关键基因表达量，关键基因包括但不限于sad(硬脂酸脱氢酶)、fad3(脂肪酸脱氢酶)、fad7并以ubiquitin为内参基因。选择这些关键基因表达量相对较高的品种或植株。
具体地，关于牡丹籽油含量和组成的微量测定方法，可以如下进行：种籽剥壳60℃或低温真空干燥至恒重，称重法测定含水量，磨成粉末，取其10-15mg，加入1-2ml2.5％-3.5％硫酸甲醇(体积/体积：v/v)，15-25μg丁化羟基甲苯(bht)，500μg十七硫酸甘油酯(c17:0)，85℃-95℃处理1.5-2h，加入100-180μl9％nacl(w/v)，700μl乙烷提取反应物即脂肪酸甲酯(fames)，加入150-200μl乙烷或乙酸乙酯溶解fames，取溶液进行gc检测。根据gc检测样品体积、脂肪酸含量和组成换算单位种籽提取的脂肪酸含量和组成。
关于牡丹籽油卫生健康综合指标测定体系，黄曲霉毒素b1按gb/t5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素b1的测定》，无机砷(as)按gb/t5009.11-2003《食品中总砷及无机砷的测定》，铅(sb)按gb5009.12-2010《食品安全国家标准食品中铅的测定》，总汞(hg)按gb/t5009.17-2003《食品中总汞及有机汞的测定》，镉(cd)按gb/t5009.15-2003《食品中镉的测定》；酸值按gb/t5530-2005《动植物油脂酸值和酸度测定》，过氧化值按gb/t5538-2005《动植物油脂过氧化值测定》。测定数据，黄曲霉毒素b1、无机砷(as)、铅(pb)按中华人民共和国国家标准gb19641-2005《植物油料卫生标准》判定。
关于测试评价牡丹籽产量和质量的方法，籽粒、籽仁、籽壳含油量可以如下进行：以中华人民共和国国家标准gb/t5512-2008，食品中脂肪测定方法测定，用索氏抽提法提取脂肪，扦样、分样按gb5491执行，试剂为分析纯无水乙醚(不能用石油醚代替乙醚，因为它不能溶解全部的植物脂类物质)。将样品放在抽提筒内，以水浴蒸馏乙醚进行冷凝回流浸提，直到样品脂肪含量不再增加为止；称量脂肪含量(精度为0.1mg)。
关于牡丹品种牡丹籽油提取及产量测定，以牡丹籽为原料，利用超临界co2萃取提取牡丹籽油，选用新鲜、饱满、无虫害的牡丹籽，称量(g)，进行脱壳、风选、破碎处理，牡丹仁破碎至4-6掰以上为宜，55-65℃干燥；用hblft-3t型负压系统进行牡丹籽油粗提取，脱酸脱水后进行超临界co2萃取。萃取时萃取塔温度设为35℃-42.5℃,压力为33-36.5mpa，二氧化碳流量为25-30l/h，时间55-65min，分离塔收集萃取物即脂肪，称量(g)，计算油得率：(萃取物质量/牡丹籽质量)×100％，根据得油率和单位面积牡丹籽产量即可计算单位面积牡丹籽油产量。与上述方法对应，本发明还提供一种用于油用牡丹品种或植株选育的试剂盒，其包括：(1)用于确定所述油用牡丹品种或植株中的赤霉素合成关键基因ko表达量检测的试剂；和/或(2)用于确定所述油用牡丹品种或植株中的抗逆关键基因dreb2a、wrky和/或xet的表达量的试剂。该试剂盒可以用于本发明所述的用于油用牡丹矮化和/或抗逆品种或植株选育的方法中。用于确定基因ko、dreb2a、wrky和/或xet的表达量的试剂如在荧光定量pcr(qrt-pcr)中使用的试剂是本领域技术人员基于本申请说明书的公开内容能够容易地确定的。
附图说明
图1.图1显示不同品种的牡丹中ko同源基因的表达量；
图2.图2显示5株‘凤丹’poko基因表达量；
图3.图3分别显示不同品种的牡丹中dreb2a(图3中的(a))、wrky(图3中的(b))、xet(图3中的(c))同源基因的表达量；和
图4.矮化剂处理的牡丹‘凤丹’植株(左：对照；右：矮化剂处理的牡丹‘凤丹’植株)。
序列说明
seqidno:1-赤霉素合成关键基因ko同源序列
seqidno:2-‘凤丹’的基因ko(poko)的全长序列
seqidno:3-dreb2a同源序列
seqidno:4-wrky同源序列
seqidno:5-xet同源序列
seqidno:6-‘凤丹’的dreb2a基因的全长序列
seqidno:7-‘凤丹’的wrky基因的全长序列
seqidno:8-‘凤丹’的xet基因的全长序列
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。应当注意，下面描述的实施例是示例性的，仅用于举例说明本发明，而不能解释为对本发明的限制。
实施例1‘凤丹’矮化优株选育
按照发明详述部分所述的方法，分别对已知为紫斑牡丹、矮化‘风丹’和普通‘风丹’的多个植株进行株高测量、poko基因的鉴定以及poko基因表达量的测定。结果分别如以下表1和表2所示。
表1矮化‘风丹’、普通‘风丹’及紫斑牡丹株高
表2矮化‘风丹’、普通‘风丹’及紫斑牡丹ko基因表达测试数据
从上述结果可以看出，牡丹品种和植株之间的株高与其ko基因的表达量成正相关。因此，可以基于牡丹品种和植株中的ko基因的表达量来筛选牡丹矮化品种和/或植株。
基于上述发现，发明人以qrt-pcr技术测试5株(5个重复)‘凤丹’(杨山牡丹，paeoniaostiivar.lishizhenii)品种相对矮小，开花单瓣，结实量大，已鉴定具有poko基因的植株的poko基因表达量，结果见图2，同样显示poko基因的表达量与植株高度成正相关。因此，挑选ko基因表达低的单株为优株。
以‘凤丹’为例，根据该方法筛选出株高小于40cm，冠幅与株高一致，具有ko基因且其绝对定量在6.5×1014拷贝/μl以下的‘凤丹’作为优株。在北京田间种植基地筛选，平均每500株‘凤丹’能筛选出20-30株符合上述条件的优株(不同条件下筛选出的优株数量不同)。
实施例2油用牡丹抗逆品种鉴定选育技术
‘凤丹’(p.ostiivar.lishizhenii)、牡丹(p.suffroticosa)、紫斑牡丹(p.rokii)等3种牡丹满足开花单瓣，结实量大，不饱和脂肪酸组成及含量高的品种要求。按照发明详述部分所述的方法，以qrt-pcr技术测试dreb2a(地上部分)、wrky(地上部分)、xet(根系部分)同源基因表达量，结果分别见图3中的(a)、(b)和(c)和以下表3、4和5所示，在正常生理条件下，几种牡丹存在dreb2a、wrky和xet，且有表达。
表3三种牡丹dreb2a基因表达测试数据
表4三种牡丹wrky基因表达测试数据
表5三种牡丹xet基因表达测试数据
与此同时，按照发明详述部分所述的方法，对上述牡丹植株的叶片生理生化指标(叶片含水量、电导率、气孔导度、叶绿素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量，抗氧化酶sod、pod、cat活性，过氧化物mda含量等)进行测定，评估其抗逆性能。结果如以下表6所示
表6表明，在生理水平上‘凤丹’隶属函数值最大，与其抗逆性强适应性广的特性相符；牡丹以‘凤丹’为砧木嫁接繁殖的植株隶属函数值略高于紫斑牡丹，也在一定程度上反映了‘凤丹’抗性强适应性广的特点。
结合图3和表6可以看出，牡丹品种和植株的抗逆性质与其根系xet基因的表达量成正相关。基于以上测试结果，以‘凤丹’为例，在实施例1的基础上，抗逆优株选择基于植株地上部分抗逆关键基因dreb2a、wrky、xet的表达鉴定。在北京田间种植基地进行筛选，平均每100株矮化‘凤丹’能筛选60-80株符合上述条件的优株。
实施例3矮化剂优康唑处理筛选矮化牡丹植株
实验植株为田间正常生长的‘凤丹’植株；矮化剂分别为：矮壮素、比久、优康唑、多效唑、缩节胺；商购来源和处理剂量浓度分别为：
矮壮素(北京永乐店农机化工厂)
比久(河北省邢台市农药厂)
优康唑(江苏省建湖县农药厂提供)
多效唑(江苏省建湖县农药厂提供)
缩节胺(江苏省建湖县农药厂提供)
矮壮素(a)0.1％，0.2％，0.35％，0.5％，1％五个浓度，
优康唑(b)10，20，30，40，50，100ppm六个浓度，
缩节胺(c)2000ppm，3200ppm，4000ppm三个浓度，
化控ii号(d)100，500，1000，2000ppm四个浓度；
化控ii号由多效唑与缩节胺配制成含20w％有效成分的乳油，两者的重量比例为1∶5。该试剂与单用多效唑相比，使用安全，残留少，无毒副作用。该试剂由中国农业大学化控中心提供。
施用方式为萌芽涂抹处理方式；实验重复数按数理统计要求至少为小样本11个重复，一般为50个以上重复。按4因素4水平正交表(中国科学院数学研究所概率统计室编.常用树立统计表.北京：科学出版社，1979：60)进行实验。
当年生枝条开花之后测定株高生长量、新梢长度、冠幅等。数据进行方差分析(王兴仁,张录达,王华方.正交试验设置重复的必要性和统计分析方法.土壤通报，2000，31(3)：135-139)。实验数据(yij)总体(n)＝16×5＝80，总平方和(sst)＝∑∑(yij-y)2，其中，i＝1,2,3,……,16；j＝1,2,3,4,5；y为总体平均数＝∑∑(yij)/n。实验因素平方和(ssj)＝(tj1+tj2+tj3+tj4)/20；tij为第j列中数字i所对应的实验数据之和(i＝1，2，3，4；j＝1，2，3，4，5)；随机误差平方和sse＝sst-(∑ssj)，自由度(df＝(5-1)×16＝64。
‘凤丹’当年抽枝平均长32.9±1.9cm,往年缩枝平均长11.2±2.3cm，新枝直径8.33±0.9cm；矮化剂优康唑(ko调控的生化步骤抑制剂)处理，对当年抽枝有显著抑制效应(表7，p＜0.001)，而化控ii号、缩节胺和矮壮素的矮化效应不显著。处理筛选到株高显著矮化的植株(图4)。
表7矮化剂灌根的风丹抽枝长度方差分析表。星号表示差异显著性，***：f0.01(3,64)＝4.11
实施例45种牡丹籽油食品卫生指标测定评价
在国家认证的实验室(国家粮油质量监督检验中心)对实施例2中所述的5种牡丹的籽油卫生指标进行测试，所检5种资源样品的黄曲霉毒素b1、砷(as)、铅(sb)符合植物油卫生标准gb19641－2005规定，其他所检验项目检验数据如表8所示。汞(hg)小于0.1mg/kg，其中大花黄牡丹含量最低0.0019mg/kg；镉(cd)含量小于0.2mg/kg，其中，牡丹栽培种的含量最低。送检的5种资源种籽样品，所含油脂的酸值大花黄牡丹籽最低，而紫斑牡丹最高；过氧化值紫斑牡丹最低，而四川牡丹最高；但尚未出现两个指标均高的情况。食品卫生指标，包括黄曲霉毒素b1,无机砷(以as计)、铅(pb)、汞(hg)、镉(cd)等符合国家食品卫生标准允许范围内。
‘凤丹’籽亩产通常为400-600斤，矮化密植亩产通常为600斤以上。
表8牡丹籽油安全卫生指标测定值
参考文献
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