本发明涉及中药提取技术和农副产品综合利用领域，尤其涉及一种杭白菊叶提取物及其制备方法和在抑菌杀菌中的应用。
背景技术：
微生物的侵袭是导致食品腐败的主要因素之一。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在微生物的作用下分解变化，产生有害物质的过程。引起食品腐败变质的微生物种类很多，主要可分为细菌、酵母菌和霉菌。其中分解蛋白质而使食品腐败变质的微生物主要是细菌，其次是霉菌和酵母菌，而细菌中主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属、梭状芽孢杆菌属和葡萄球菌属。
添加食品防腐剂是防止食品腐败的重要措施，目前食品工业中常用的食品防腐剂以化学合成的居多。研究表明，化学合成防腐剂具有致癌性、致畸性和易引起食物慢性中毒等毒副作用，因而安全、无毒、高效、广谱的天然食品防腐剂的开发利用成为当今食品工业的一个研究热点。
杭白菊是浙江省传统中药材“浙八味”之一，也是卫生部批准的首批药食同源药材，具有散风清热、平肝明目、抗炎降压等功效。人们对杭白菊花的有效成分和药理作用已进行较多研究，结果表明其中存在黄酮、多糖、萜类等化合物并具有降血压、降血糖、抗菌、抗氧化、抑菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。
授权公告号为cn102266370b的发明专利公开了一种杭白菊中抗胃癌活性物质的半仿生提取方法，该方法包括以下步骤：1)、将干燥的杭白菊粉碎后过40-60目筛，然后加入ph为2.0-2.2的缓冲液i，置于36.5-37.5℃水浴中提取1-2小时；提取结束后，过滤，弃去滤液i；2)、在步骤1)所得滤渣中加ph为7.8-8.2的缓冲液ii，置于36.5-37.5℃水浴中提取1-2小时；提取结束后，过滤，取滤液ii；滤液ii经干燥处理，得杭白菊抗胃癌提取物。
公布号为cn108030797a的发明专利申请文献公开了杭白菊提取物在制备防治心肌肥厚的药物中的应用，该杭白菊提取物由原料杭白菊经干燥、80％乙醇水溶液提取后得到。
然而，人们对杭白菊叶的研究却鲜见报道。杭白菊叶作为杭白菊产品开发中的主要副产品基本上被留在田里腐烂或被焚烧，资源未得到有效利用。鉴于次生代谢产物在植株中分布的广泛性，可以推测杭白菊叶中含有丰富的可利用资源，如黄酮、多糖、萜类等化合物，并且其中一些化合物已经得到证实。
因此，将杭白菊叶进行开发利用，既符合节约资源和保护环境的基本国策，符合可持续发展，绿色发展的理念，又有望基于杭白菊叶开发出一种天然绿色的抑菌剂，增加杭白菊的附加价值。
技术实现要素：
基于上述目的，本发明提供了一种杭白菊叶提取物及其制备方法和在抑菌杀菌中的应用，该杭白菊叶提取物具有比较好的抑菌和杀菌的效果。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种杭白菊叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)用乙醇水溶液对杭白菊叶粉末进行浸提，获得的浸提液经浓缩后，得到杭白菊叶浸膏；
(2)先用水稀释杭白菊叶浸膏，对浸膏进行大孔树脂柱层析，依次采用水和体积浓度为30～90％的乙醇水溶液进行洗脱，获得的洗脱组分，经减压浓缩和冷冻干燥，得到杭白菊叶提取物。
上文所述的杭白菊叶粉末为新鲜采摘的杭白菊叶经晒干、粉碎过筛后得到的粉末。
作为优选，步骤(1)中，所述乙醇水溶液的体积浓度为5～95％；其中杭白菊叶提取物的成分随乙醇浓度的升高而变化，在乙醇浓度为65％时，黄酮类物质含量最高，且抑菌杀菌效果最强。
作为优选，步骤(1)中，所述杭白菊叶与乙醇水溶液的料液比为1:3-10g/ml。其中，提取物的提取率随料液比的增加而增加，当料液比为1:5时，提取率到达最高点，继续增大料液比对提取率影响不大。
作为优选，步骤(1)中，采用超声浸提的方式；其中，所述超声的功率为50～300w；超声的时间为20～60min。使用超声提取提高了提取效率，而且超声时间与提取率有关，超声时间越长，提取率越高，当超声时间为30min时，提取率最高，约为15mg/g，超声功率越大，提取效率越高，当功率为200w时，提取效率达到最高，再加大功率对提取率基本无影响。
步骤(1)中，超声浸提的温度为室温；超声浸提后，通过旋转蒸发仪浓缩，其中，浓缩的温度为40～70℃。
作为优选，步骤(2)中，杭白菊叶提取物浸膏经水稀释后的浓度为0.5-2g/ml。当稀释后浓度为1.5g/ml时，具有抑菌功效的溶液洗脱成分得率最高。
试验比较不同体积浓度的乙醇水溶液洗脱液，发现采用水以及体积浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇水溶液进行洗脱，得到的杭白菊叶提取物抑菌效果最佳。
更优选，步骤(2)中，洗脱过程为：依次采用水以及体积浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇水溶液进行洗脱，获得各洗脱组分的混合液；可更好地将提取物中的杂质清除，提高提取物中有效成分的纯度。
作为优选，步骤(2)中，所述大孔树脂的型号为ab-8型、d-101型、或hpd-400型。树脂的型号与洗脱成分密切相关，当使用的大孔吸附树脂为ab-8型时，洗脱得到的成分抑菌效果最佳。
作为优选，步骤(2)中，各洗脱液的用量为1-5bv，流速1-3bv/h。洗脱成分的多少与洗脱液的流速及用量密切相关，同时也与最终产物的抑菌效果密切相关。
作为优选，步骤(2)中，所述减压浓缩的温度为40～70℃。
作为优选，步骤(2)中，所述冷冻干燥的温度为-20℃～-55℃，时间为24～48h。
作为优选，步骤(2)中，减压浓缩后进行凝固，而冷冻干燥前需冷藏过夜；其中，凝固温度为-15℃～-25℃，冷藏过夜的温度为-80℃；可得到干燥疏松易复溶的杭白菊提取物粉末，以期作为原料制备成药物。
本发明提供了一种上述制备方法制得的杭白菊叶提取物，主要为黄酮类物质。
本发明还提供了所述杭白菊叶提取物在抑菌杀菌中的应用。
经试验发现，采用本发明制备方法获得的杭白菊叶提取物对细菌有较好的抑菌和杀菌作用。
具体的，所述细菌为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌和枯草芽孢杆菌。
上述杭白菊叶提取物可以用于制备抑菌剂、杀菌剂以及其他抑菌、杀菌用品，例如：食品防腐剂；洗手液，牙膏等日用品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用乙醇水浸提和大孔树脂层析的方式获得了具有抑菌、杀菌作用的杭白菊叶提取物，且抑菌活性随着杭白菊叶提取物浓度的增加而增强，为以杭白菊叶提取物为基础的抑菌产品的生产和推广奠定了基础。
(2)本发明制备方法操作简单，易于产业化；采用的杭白菊叶价格低廉，原料来源丰富。
(3)本发明制得的杭白菊叶提取物抑菌谱广、毒副作用小。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下列实施例和对比例中涉及的杭白菊叶为新鲜采摘的杭白菊叶晒干后，粉碎过40目筛的粉末。
实施例1
1、杭白菊叶提取物的制备方法
具体步骤如下：
(1)将杭白菊叶按料液比1:5的比例置于体积浓度为65％的乙醇水溶液中，在200w的超声条件下，超声提取30min，再在50℃下浓缩，得到杭白菊叶浸膏；
(2)用水将杭白菊叶浸膏稀释至1.5g/ml后，使用ab-8型大孔吸附树脂进行大孔树脂柱层析，依次采用3bv的水洗脱液、2bv的体积浓度30％的乙醇水洗脱液、1.5bv的体积浓度50％的乙醇水洗脱液、3bv的体积浓度70％的乙醇水洗脱液、4bv的体积浓度90％的乙醇水洗脱液，以2bv/h的流速进行洗脱，得水洗脱部位、30％乙醇水洗脱部位、50％乙醇水洗脱部位、70％乙醇水洗脱部位、90％乙醇水洗脱部位，各洗脱部位与杭白菊叶浸膏分别于60℃减压浓缩后，于-20℃凝固，-80℃过夜后，进行冷冻干燥，冷冻干燥温度为-25℃，冷冻干燥时间为48h，收集冻干粉，即得杭白菊叶提取物。
2、抑菌杀菌实验
(1)杭白菊叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(mic)的测定。
微量肉汤稀释法，用接种环分别小心挑取上述4种标准菌株适量，接种于5ml营养肉汤中，37℃培养16h至生长对数期，激活细菌。用接种环沾取适量细菌液接种在营养琼脂斜面。用灭菌pbs洗脱缓冲液洗脱，制成细菌原液，移取适量细菌原液于无菌试管中进行等倍稀释，同时使用麦氏比浊法调节细菌浓度为106cfu/ml。将此浓度的细菌按100μl/孔接种于96孔板中，并加入100μl倍比稀释的提取物溶液，单独加入200μl细菌作为生长对照，加入药液与培养基作为空白对照。迅速置于酶标仪中，在600nm波长处测定各培养孔od值。然后置37℃孵育24h后再次测定od值。
供试药抑菌的od＝培养后od(加供试药培养孔-空白对照孔)-培养前od(各供试药培养孔-空白对照孔)。
当生长对照孔内细菌明显生长，实验才有意义，od差值越小，表明细菌数越少，药物的抑菌活性越强。含供试药培养孔的od低于或等于空白对照孔的od，该培养孔的药物浓度即为mic。
(2)杭白菊叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的最小杀菌浓度(mbc)的测定。
于培养了24h的96孔板中吸取100μl含供药细菌液，涂布于营养琼脂培养板上，置于37℃恒温培养箱中培养24h后，观察菌落数，菌落数低于药物浓度即为mbc。
3、总黄酮、多糖含量测定
标准曲线制作：(1)精密吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00ml置于10ml的比色管中，往每只比色管中加入5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀放置6分钟，再加入10％的硝酸铝溶液0.30ml,摇匀，放置6min接着加入4％的氢氧化钠4ml,加入60％的乙醇溶液至刻度线定容，摇匀，放置15min.最后在波长510nm处测定吸光度。
(2)配制葡萄糖溶液(0.1mg/ml)作为标准品；精密吸取0.2ml；0.4ml；0.6ml；0.8ml；1.0ml；1.2ml葡萄糖溶液于试管中，加水补足至2ml，精密加入5％苯酚溶液1ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5ml，沸水浴中反应15min后，取出立即进行冰水浴，冷却至室温后于490nm处进行检测。
样品测定：取样品按标准品测定步骤进行检测吸光度，按相应标准曲线，计算相应成分含量。
上述实验分组如下:
杭白菊叶粗提物组：杭白菊叶粗提物；
杭白菊叶水洗脱物组：杭白菊叶粗提物浸膏使用3bv水洗脱得到的成分；
杭白菊叶30％醇洗脱物组：杭白菊叶粗提物浸膏依次使用3bv水、2bv30％乙醇洗脱后收集的30％醇洗脱成分；
杭白菊叶50％醇洗脱物组：杭白菊叶粗提物浸膏依次使用3bv水、2bv30％乙醇、1.5bv50％乙醇洗脱后收集的50％醇洗脱成分；
杭白菊叶70％醇洗脱物组：杭白菊叶粗提物浸膏依次使用3bv水、2bv30％乙醇、1.5bv50％乙醇、3bv70％乙醇洗脱后收集的70％醇洗脱成分；
杭白菊叶90％醇洗脱物组：杭白菊叶粗提物浸膏依次使用3bv水、2bv30％乙醇、1.5bv50％乙醇、3bv70％乙醇、4bv90％乙醇洗脱后收集的90％醇洗脱成分；
杭白菊叶全水洗脱物组：白菊叶粗提物浸膏仅使用13.5bv水洗脱得到的成分；
杭白菊叶全醇洗脱物组：白菊叶粗提物浸膏仅使用13.5bv90％乙醇洗脱得到的成分。
4、实验结果
(1)杭白菊叶粗提取物与纯化产物得率及总黄酮含量对比
表1杭白菊叶提取物提取率与总黄酮含量结果对比
(2)杭白菊叶提取物最小抑菌浓度(mic)的测定
表2杭白菊叶提取物的mic结果
(3)杭白菊叶提取物最小杀菌浓度(mbc)的测定
表3杭白菊叶提取物的mbc结果
由上可知，杭白菊叶粗体物具有一定的抑菌效果，但效果一般，经过纯化后，抑菌效果明显改善，且使用不同浓度的溶液依次洗脱，得到的90％乙醇洗脱物具有最佳的抑菌杀菌效果。证明杭白菊叶是一种天然防腐剂的潜在来源。
实施例2
本实施例对实施例1杭白菊叶提取物制备方法中浸提液(乙醇水溶液)的体积浓度做了梯度试验，分别为：5％乙醇、20％乙醇、35％乙醇、50％乙醇、65％乙醇、80％乙醇、95％乙醇。
比较了90％乙醇洗脱组分对四种细菌的最小抑制浓度。其余条件与实施例1相同。实验结果如下：
表4杭白菊叶提取物不同提取条件下提取率与总黄酮含量结果对比
表5不同乙醇浓度提取所得杭白菊叶提取物的mic结果
由上可知，使用65％乙醇为提取溶剂得到的提取物具有最高的黄酮含量，且具有最佳抑菌效果；虽然乙醇浓度为80％时，抑菌作用与65％时相同，但是出于节约资源考虑，选用65％的乙醇作为提取溶剂。
实施例3
本实施例对实施例1杭白菊叶提取物制备方法中纯化使用的大孔树脂进行了筛选，分别为ab-8型、d-101型、hpd-400型大孔树脂，比较了90％乙醇洗脱组分对四种细菌的最小抑制浓度。其余条件与实施例1相同。实验结果如下：
表6不同大孔树脂纯化的杭白菊叶提取物黄酮含量及mic结果
由上结果可知，选用ab-8型大孔树脂，对杭白菊叶提取物中的抑菌物质具有最佳的纯化作用。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。