一种干细胞冷冻剂及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种干细胞冷冻剂及其应用。

背景技术：

细胞冷冻保存是将细胞培养物悬浮在含有冷冻保护剂的溶液中，以一定的速率降至零度以下，并在低温下长期保存的过程。细胞冷冻保存一般是保存在－80℃或液氮－196℃的低温环境中。在冷冻过程中，细胞会发生胞内外的结晶，同时细胞内外的溶液浓度也会由于结晶发生相应的改变，曝露在低温下的细胞也会随之产生不同的压力。

截至目前，有两项技术应用于干细胞的冷冻保存应用中，一种是传统的慢速冷冻，另一种则是玻璃化冻存。在这两种方法中，二甲基亚砜(dmso)是普遍采用的冷冻保护剂。客观来说，dmso广泛应用于小鼠胚胎干细胞、人类造血干细胞、人间充质干细胞、人脂肪干细胞的冷冻保存中，并在这些细胞中取得了良好的冷冻效果，然而，轻微和更严重的不良反应都是与输注含有dmso的解冻细胞产物有关。另外，dmso的难闻气味其代谢产物影响患者和工作环境。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种干细胞冷冻剂及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种干细胞冷冻剂，所述干细胞冷冻剂包括以下重量百分比的组分：1％-10％的人血白蛋白、2％-20％的透明质酸钠、5％-30％的半脱体糖(pentaisomaltose)和1％-5％的二甲基亚砜(dmso)。

本发明的干细胞冷冻剂中的人血白蛋白、透明质酸钠、半脱体糖具有良好的生物相容性，高浓度时毒性也较低，利用所述配比的人血白蛋白、透明质酸钠、半脱体糖，可以最大限度地抑制细胞内冰晶的形成，降低低温环境对所冻存细胞的损伤，因而大大较低了冻存细胞的毒性，并提高了冻存细胞经复苏培养后的存活率。本发明通过所述简单的组合配比即能够发挥人血白蛋白、透明质酸钠、半脱体糖的最大保护优势，同时在冷冻细胞程序上并无增加。

优选地，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

优选地，所述dmso占所述干细胞冷冻剂重量的1-3％。

更优选地，所述dmso占所述干细胞冷冻剂重量的1.8％。

优选地，所述人血白蛋白占所述干细胞冷冻剂重量的2％、4％、6％或者8％。

优选地，所述透明质酸钠占所述干细胞冷冻剂重量的5％、8％、12％或者15％。

优选地，所述半脱体糖占所述干细胞冷冻剂重量的10％、15％、20％或者25％。

优选地，所述干细胞冷冻剂还包括淫羊藿甙(icariin)，所述淫羊藿甙在所述干细胞冷冻剂中的含量为5-100μm。

更有选地，所述淫羊藿甙在所述干细胞冷冻剂中的含量为15-30μm。

优选地，所述干细胞冷冻剂还包括肝素。

优选地，所述干细胞冷冻剂还包括酸碱调节剂，所述酸碱调整剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)或者乙二胺四乙酸二钠(edta)。

优选地，所述干细胞冷冻剂还包括占所述干细胞冷冻剂重量1％-8％的抗氧化剂。

更优选地，所述抗氧化剂为维生素c、维生素e或卵磷脂。

本发明的干细胞冷冻剂在细胞冷冻和解冻过程中能够有效稳定细胞膜和蛋白质，并在冷冻过程中可以形成一种玻璃状基质，以此抑制潜在致命的细胞内的冰晶的形成，由此降低了细胞损伤，本发明的干细胞冷冻剂在低温环境下可有效保护蛋白质分子，可以清除由于低温产生的活性氧，同时在低温胁迫结束后帮助冻存细胞的复苏。

本发明提供了一种优选的干细胞冷冻剂，所述的干细胞冷冻剂包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量2％-5％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量5％-15％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量10％-20％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量1％-8％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、酸碱调节剂和1-2.5ie/ml的肝素。

本发明还提供一种上述任意一种干细胞冷冻剂在间充质干细胞或者造血干细胞中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种干细胞冷冻剂及其应用，本发明的干细胞冷冻剂中的人血白蛋白、透明质酸钠、半脱体糖具有良好的生物相容性，高浓度时毒性也较低，利用所述配比的人血白蛋白、透明质酸钠、半脱体糖，可以最大限度地抑制细胞内冰晶的形成，降低低温环境对所冻存细胞的损伤，因而大大较低了冻存细胞的毒性，并提高了冻存细胞经复苏培养后的存活率。本发明通过所述简单的组合配比即能够发挥人血白蛋白、透明质酸钠、半脱体糖的最大保护优势，同时在冷冻细胞程序上并无增加；本发明的干细胞冷冻剂在细胞冷冻和解冻过程中能够有效稳定细胞膜和蛋白质，并在冷冻过程中可以形成一种玻璃状基质，以此抑制潜在致命的细胞内的冰晶的形成，由此降低了细胞损伤，本发明的干细胞冷冻剂在低温环境下可有效保护蛋白质分子，可以清除由于低温产生的活性氧，同时在低温胁迫结束后帮助冻存细胞的复苏。

附图说明

图1为本发明实施例的干细胞冷冻剂应用的细胞活力检测结果图。

图2为本发明实施例的干细胞冷冻剂应用的细胞凋亡率检测结果图。

图3为本发明实施例的干细胞冷冻剂应用的细胞活力检测结果图。

图4为本发明实施例的干细胞冷冻剂应用的细胞凋亡率检测结果图。

图5为本发明实施例的干细胞冷冻剂应用的细胞活力检测结果图。

图6为本发明实施例的干细胞冷冻剂应用的细胞凋亡率检测结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例2

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例3

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量2.5％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例4

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量4％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实验例1

对实施例1-4的冷冻剂应用的效果进行检测，方法如下。

细胞培养：间充质干细胞在dulbecco改良的eagle培养基，dmem补充有10％胎牛血清(fbs)，1％青霉素/链霉素和12.5μg/ml嘌呤霉素中生长，将细胞系置于锥形瓶中，在37℃，5％co2/95％空气气氛中保持，并每2-3天传代一次。

细胞冷冻与解冻：将传代3次的细胞重悬于冷冻管中的1ml实施例1-4的干细胞冷冻剂中，细胞浓度2×10⁶个/ml，在控制速率的冰箱中冷冻保存，冷冻程序：起始温度4℃，-1℃/分钟至0℃，-2℃/分钟至-45℃和-5℃/分钟至-100℃，冷冻管是转移至液氮(-190℃)并储存直至使用。样品在它们之前冷冻保存2周、3周后解冻，将冷冻小瓶在37℃下快速解冻直到溶液中没有观察到冰。对于干细胞冷冻剂溶液去除缓慢加入新鲜培养基以抑制渗透损伤，至除去任何剩余的cpa溶液。

细胞活力检测：将上述解冻后的细胞用培养基冲洗3次，将非冷冻保存的细胞作为对照组，接种在96孔板中并培养24小时。然后，cck-8确定细胞活力通过，在450nm处检测吸光度。

细胞凋亡率测定：annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒，将实验组细胞和对照组细胞重悬于500μl结合缓冲液中，并加入5μl膜联蛋白v-fitc和pi，然后，将样品在黑暗中室温下温育15分钟，通过流动分析凋亡率细胞计数。

细胞活力检测结果如图1所示，由图1可知，在含有实施例1-4的其他冷冻剂组分的情形下，所述冷冻剂中的二甲基亚枫的含量从1％增大到4％时，冷冻后细胞解冻后的活力增加，说明冷冻效果变好，但是二甲基亚枫的含量从1.8％增大到4％时，增大的程度缓慢，考虑到二甲基亚枫的毒性，实施例1较佳。且冷冻三周后的细胞活力较冷冻两周的细胞活力略小。

细胞凋亡率检测结果如图2所示，由图2可知，在含有实施例1-4的其他冷冻剂组分的情形下，所述冷冻剂中的二甲基亚枫的含量从1％增大到4％时，冷冻后细胞解冻后的细胞凋亡率减小，说明冷冻效果变好，但是二甲基亚枫的含量从1.8％增大到4％时，细胞凋亡率减小的程度缓慢，考虑到二甲基亚枫的毒性，实施例1较佳。且冷冻三周后的细胞活力较冷冻两周的细胞凋亡率较大。

实施例5

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量5％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例6

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量10％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例7

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量20％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例8

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量25％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例9

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量30％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实验例2

对实施例5-9的冷冻剂应用的效果进行检测，方法同实验例1。

细胞活力检测结果如图3所示，由图3可知，在含有实施例5-9、实施例1的其他冷冻剂组分的情形下，所述冷冻剂中的半脱体糖的含量从5％增大到30％时，冷冻后细胞解冻后的活力增加，说明冷冻效果变好，但是半脱体糖的含量大于15％后，增大的程度缓慢，考虑到成本，实施例1较佳。且冷冻三周后的细胞活力较冷冻两周的细胞活力略小。

细胞凋亡率检测结果如图4所示，由图4可知，在含有实施例5-9、实施例1的其他冷冻剂组分的情形下，所述冷冻剂中的半脱体糖的含量从5％增大到30％时，冷冻后细胞解冻后的细胞凋亡率减小，说明冷冻效果变好，但是半脱体糖的含量大于15％后，细胞凋亡率减小的程度缓慢，考虑到成本，实施例1较佳。且冷冻三周后的细胞活力较冷冻两周的细胞凋亡率较大。

实施例10

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量2％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例11

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量5％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例12

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量12％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例13

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量15％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实施例14

作为本发明实施例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量20％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

实验例3

对实施例10-14的冷冻剂应用的效果进行检测，方法同实验例1。

细胞活力检测结果如图5所示，由图5可知，在含有实施例10-14、实施例1的其他冷冻剂组分的情形下，所述冷冻剂中的透明质酸钠的含量从2％增大到20％时，冷冻后细胞解冻后的活力增加，说明冷冻效果变好，但是透明质酸钠的含量大于8％后，增大的程度缓慢，考虑到成本，实施例1较佳。且冷冻三周后的细胞活力较冷冻两周的细胞活力略小。

细胞凋亡率检测结果如图6所示，由图6可知，在含有实施例10-14、实施例1的其他冷冻剂组分的情形下，所述冷冻剂中的透明质酸钠的含量从2％增大到20％时，冷冻后细胞解冻后的细胞凋亡率减小，说明冷冻效果变好，但是透明质酸钠的含量大于8％后，细胞凋亡率减小的程度缓慢，考虑到成本，实施例1较佳。且冷冻三周后的细胞活力较冷冻两周的细胞凋亡率较大。

对比例1

作为本发明对比例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量15％的半脱体糖(pentaisomaltose)、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙20μm、edta和1.8ie/ml的肝素。

对比例2

作为本发明对比例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量4％的人血白蛋白、占所述干细胞冷冻剂重量8％的透明质酸钠、占所述干细胞冷冻剂重量1.8％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、20μm的淫羊藿甙、edta和1.8ie/ml的肝素，所述透明质酸钠的分子量的范围为3.5×10⁴-5×10⁴。

对比例3

作为本发明对比例的一种干细胞冷冻剂，其包括以下组分，

占所述干细胞冷冻剂重量5％的二甲基亚砜(dmso)、占所述干细胞冷冻剂重量5％的抗氧化剂、edta和1.8ie/ml的肝素。

实验例4

对对比例1-3的冷冻剂应用的效果进行检测，方法同实验例1。

对比例1-3的冷冻剂的冷冻效果检测结果如表1所示：

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。