芥菜提取物在防治西瓜枯萎病中的应用的制作方法

本发明属于植物病害防治
技术领域：
，具体涉及芥菜提取物在防治西瓜枯萎病中的应用。
背景技术：
：西瓜枯萎病是由半知菌亚门真菌-西瓜尖镰孢菌[fusariumoxysporumf.sp.niveum(e.f.smith)wollen]侵染所致，主要靠含菌土壤传播，重茬种植土壤中病菌多，病株率可达70％左右，病残体及种子等均可传病。西瓜枯萎病可造成西瓜产量下降30％～40％，重病地块减产80％以上，甚至绝产。江西是西瓜生产大省，2010年西瓜播种面积已达6.29万hm2，产量达151.6万t。因此，西瓜在江西省农业结构调整与农民增收中发挥着重要作用，由于西瓜栽培面积迅速扩大，导致重茬西瓜面积增多，西瓜枯萎病的发生日趋普遍和严重，给西瓜生产带来巨大的经济损失和资源浪费。因此，如何科学有效地防治西瓜枯萎病的发生，减轻其危害，越来越受到广大西瓜生产者及科研工作者的重视。防治西瓜枯萎病的途径主要包括农业防治、抗病育种、生物防治和化学防治。其中，农业防治的主要措施包括轮作倒茬、土壤阳光曝晒及嫁接换根等，由于中国耕地面积有限，特别是在保护地栽培条件下，很难完全实行轮作倒茬，嫁接换根又存在成本较高和技术推广困难的缺点；抗病育种是目前防治西瓜枯萎病中最有效的一种途径，但由于病原菌容易产生变异，抗病育种工作难度较大。生物防治主要是采用拮抗微生物降低病原菌的密度，从而达到控制病害的目的，但由于生防因子具有防治效果易受环境条件的影响、抑菌范围窄等缺点，尚未成功地应用于大田。化学防治具有见效快、效果好的特点。各地对西瓜枯萎病的药剂防治工作都比较重视，筛选和研制出了一批具有一定防效的化学药剂，如菌毒清、kt乳剂、甲霜灵锰锌、恶霉灵、40％瓜枯宁等对西瓜枯萎病都有一定的防治效果。随着科学技术的进步和检测分析手段的完善，发现过去认为安全的一些化学杀菌剂有致癌或潜在致癌、致突变、致畸的可能性。另外，长期使用化学杀菌剂，容易使病原菌对其产生抗药性，降低防治效果，污染环境。一些化学杀菌剂，如克菌丹(captan)、苯菌灵(benomyl)和双胍盐类杀菌剂等，己被美国环保局明令禁止使用或在部分果实产品上限制使用。公众对大剂量使用化学杀菌剂对生态环境和人体健康带来的危害也日益关注。在绿色消费盛行的今天，广大民众和科学家都希望能使用一些更加安全，对环境友好的新物质来代替传统的化学杀菌剂。因此，寻找广谱、高效、低毒、安全的杀菌剂，特别是从天然植物中研究和筛选具有抑菌效果，对人体健康和生态环境无害的抑菌活性成分并阐明其作用机理，具有十分重要的意义，已经成为广大农业生产者和科研工作者关注的热点。芥菜属十字花科cruciferae芸薹属brassica一年或二年生草本植物，芥菜是中国的特产蔬菜，栽培历史悠久，且我国大部分地区均有栽培，是人们常食用的一种蔬菜。现代药理研究表明，芥菜具有杀虫抑菌的作用。研究发现，芥菜提取液对烟草黑胫病和烟草疫霉病具有明显的抑制作用(刘领，李继伟，常茜茜，等.芸薹属植物提取液对烤烟黑胫病发生及烟株生理特性的影响[j].植物生理学报，2017,53(6):997-1006.；李继伟，周俊学，王宇鹏，等.芸薹属植物提取液与异硫氰酸酯类制剂对烟草疫霉菌的抑制作用[j].烟草科技，2017,50(9):30-36.)。小花叶芥菜提取液能够抑制黄瓜枯萎病、黄瓜灰霉病、黄瓜立枯病和水稻稻瘟病等病原菌生长(乔世佳，李淑敏，孟令波.芸苔属植物对四种土传病原微生物生物熏蒸效果的研究[j].东北农业大学学报，2010,41(5):19-24.)。目前尚未有报道公开过芥菜提取物对西瓜枯萎病具有防治作用。技术实现要素：针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供芥菜提取物在防治西瓜枯萎病中的应用，本发明以天然的蔬菜植物为原料，制备的芥菜提取物对西瓜枯萎病的抑菌效果明显且无化学残留，对人体无健康危害，对环境无污染，有很好的应用前景。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：本发明提出芥菜提取物在防治西瓜枯萎病中的应用。进一步地，在本发明较佳实施例中，所述芥菜提取物的制备方法，包括以下步骤：将芥菜与乙醇混合得混合料，将所述混合料采用超声辅助提取。进一步地，在本发明较佳实施例中，所述芥菜与所述乙醇的质量比为1:(10～30)；优选地，所述芥菜与所述乙醇的质量比为1:(10～20)；在本发明的一些具体实施方式中，芥菜与乙醇的质量比可以为1:10、1:15和1:20。更优选地，所述芥菜与所述乙醇的质量比为1:15。进一步地，在本发明较佳实施例中，所述乙醇的质量浓度为50～90％；优选地，所述乙醇的质量浓度为80％～90％。实验表明，在该浓度下，得到的芥菜提取物的浓度较强，对西瓜枯萎病菌的抑制最高可达99.61％。进一步地，在本发明较佳实施例中，所述超声辅助提取的温度是40～80℃；优选地，所述超声辅助提取的温度为50℃。其中，超声辅助提取应用于芥菜的提取可以缩短提取时间及有效提高效率，本发明中超声的频率采用30～40khz为佳。进一步地，在本发明较佳实施例中，所述超声辅助提取的时间30～150min；优选的，所述超声辅助提取的时间90～150min；更优选，所述超声辅助提取的时间为120min。在一些具体的实施方式中，控制乙醇浓度、乙醇用量和温度一致，提取时间分别为90min、120min和150min；经实验证明，提取时间为120min提取得到的芥菜提取物对西瓜枯萎病菌具有较好的抑制效果。进一步地，在本发明较佳实施例中，与乙醇混合之前，还包括依次风干和粉碎所述芥菜，然后过30～50目筛。进一步地，在本发明较佳实施例中，混合料采用超声辅助提取之后，还包括过滤和浓缩。其中，上述过滤采用常规的过滤手段能对超声辅助提取得到的混合液进行固液分离即可，所述过滤包括但不限采用离心或者真空过滤的方式。上述浓缩采用本领域常规的浓缩方法即可，包括但不限于采用减压浓缩的方式，其中减压浓缩的真空度例如-0.09mpa，温度例如45～50℃。进一步地，在本发明较佳实施例中，所述芥菜提取物的施用浓度为0.0625～1.0g/ml。优选地，所述芥菜提取物的施用浓度为0.5～1.0g/ml。需要说明的是，其中g/ml是指芥菜干粉的质量与芥菜提取物的体积之比。例如，芥菜提取物的浓度可以是0.0625g/ml、0.125g/ml、0.25g/ml、0.5g/ml和1.0g/ml等；在本发明提供的一些具体实施方式中，上述不同浓度芥菜提取物的配制方法，可直接采用前述制备方法提取得到的芥菜提取物原液，也可将该原液进一步稀释获得。本发明提供以下最佳实施例，在下述条件下，获得的芥菜提取物对西瓜枯萎病的抑制效果能够达到98％以上，其提取方法采用以下任意一种：a.将芥菜自然风干，粉碎后过40目筛后加入芥菜重量10倍的重量百分比浓度为95％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为50℃，提取时间为120min；过滤，得到醇提取液；减压浓缩至浓度为1.0g/ml；b.将芥菜自然风干，粉碎后过40目筛后加入芥菜重量20倍的重量百分比浓度为80％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为50℃，提取时间为120min；过滤，得到醇提取液，减压浓缩至浓度为0.5g/ml；c.将芥菜自然风干，粉碎后过40目筛后加入芥菜重量20倍的重量百分比浓度为90％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为50℃，提取时间为120min；过滤，得到醇提取液，减压浓缩至浓度为0.5g/ml。本发明还提出了一种防治西瓜枯萎病的药物组合物，包括芥菜提取物以及辅料；该辅料为本领域常规的辅料，优选地，所述辅料包括助溶剂和溶剂；更优选地，所述助溶剂为吐温系列的助溶剂，例如吐温20、吐温40、吐温60和吐温80中任何一种或几种；所述溶剂为水。该组合物的剂型可以是农药领域常用的剂型，例如溶液、乳液、悬浮液或粉剂等。本发明较佳实施例提供的芥菜提取物在防治西瓜枯萎病中的应用的有益效果包括：本发明以天然的蔬菜植物芥菜为原料，以乙醇作为提取溶剂得到芥菜提取物，经实验验证该芥菜提取物对西瓜枯萎病菌具有很强的抑制作用。本发明所述含有芥菜提取物的药物组合物，无化学残留，对人体无健康危害，对环境无污染，具有很好的应用前景。附图说明图1所示为不同浓度的芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌照片；图中：第一排的培养基从左至右依次为对照培养基、添加1.0g/ml芥菜提取物的培养基、添加0.5g/ml芥菜提取物的培养基；第二排的培养基从左至右依次为添加0.0625g/ml芥菜提取物的培养基、添加0.125g/ml芥菜提取物的培养基、添加0.25g/ml芥菜提取物的培养基。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。如果无特殊说明，本发明出现的“芥菜提取物”指的是以适当的溶剂，以本领域可以接受的提取方法得到的含有或者不含有提取溶剂的芥菜提取物。本发明实施例涉及的西瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.niveum)测试菌株由江西农业大学生物工程与科学学院提供。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1芥菜提取物的制备本实施例提供一种芥菜提取物，按以下方法制备：i.将芥菜自然风干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；ii.步骤i得到的粉末中加入芥菜重量10倍的重量百分比浓度为95％的乙醇进行超声波辅助提取，超声频率为35khz，提取温度为50℃，提取时间为2小时；过滤，得到醇提取液；iii.步骤ii得到的醇提取液，在真空度-0.09mpa和温度45℃进行减压回收乙醇，制成芥菜含量为1.0g/ml的提取物，即得。实施例2-21按照下述表1提供的条件制备实施例2-21的芥菜提取物。实施例2-21提供的芥菜提取物，其制备方法中的步骤i～iii与实施例1相同，步骤ii中的各个工艺参数与实施例1不同，表1所示为各实施例步骤ii的具体的工艺参数。表1实施例2-21超声辅助提取的工艺条件试验例1芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌作用1.实验材料：(1)供试药物：实施例1制备的芥菜提取物，浓度为1.0g/ml的溶液。(2)供试菌株：西瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.niveum)由江西农业大学生物工程与科学学院提供。2.实验方法：采用生长速率法测定芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌作用，具体方法为：利用生长速率法，将浓度1.0g/ml的芥菜提取物用无菌水稀释成1.0g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml、0.125g/ml和0.0625g/ml的不同浓度的溶液，在无菌条件下，与pda培养基(pda培养基的组成和含量为：马铃薯200g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g和水1000ml，自然ph)混合制成含药培养基，用直径8mm打孔器打取活化好的供试菌的菌落边缘菌块，将其转接到含芥菜提取物的pda培养基，实验同时设置以等量无菌水替代芥菜提取物制成对照培养基作为阴性对照，每个处理重复三次，并将其置于28℃恒温培养箱中培养，3d后记录各菌落生长情况，并用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。3.实验结果经计算，芥菜提取物在1.0g芥菜粉末/ml的浓度下对西瓜枯萎病的抑菌率为99.58％，芥菜提取物对供试病原菌的抑制作用结果参见图1，从图中可以看出，与对照组相比，浓度范围为0.0625～1.0g/ml的芥菜提取物对西瓜枯萎病菌均有抑制作用，且在上述浓度范围内，芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑制率与浓度成正比，实验结果说明芥菜提取物对西瓜枯萎病菌具有抑制作用，可以有效防治这种西瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.niveum)引起的西瓜病害。试验例2芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌作用1.实验材料：①供试药物：实施例2-21制备的芥菜提取物，用无菌水配制成浓度为0.5g/ml的溶液。②供试菌株：西瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.niveum)由江西农业大学生物工程与科学学院提供。2.实验方法：生长速率法测定芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌作用，具体操作方法同试验例1。3.实验结果：实施例2-21对应的芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑制作用见下表2。表2芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌作用实施例抑菌率实施例抑菌率实施例抑菌率实施例抑菌率236.84％723.65％1216.57％1735.31％340.74％835.87％1388.89％1889.13％442.69％973.95％1451.85％1946.01％598.25％1094.79％1531.77％2043.12％699.61％1168.14％1623.39％2124.28％试验结果表明，本发明实施例2-21所述的提取工艺条件提取得到的芥菜乙醇提取物都有抑菌效果，其中，实施例5和6提供的芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑制作用最强，其抑制作用达到98％以上。其次是实施例10、18和13提供的芥菜提取物，对西瓜枯萎病菌的抑制作用在88.89％以上。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12