通过组织培养获得栀子苷的方法与流程

本发明是生物技术领域，特别涉及一种采用植物细胞培养技术生产栀子苷的方法。

背景技术：

栀子为茜草科植物栀子gardeniajasmi-noidesellis的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒、消肿止痛等作用，栀子苷是栀子的次生代谢产物，其化学结构为环烯醚萜的葡萄糖苷。栀子中含40余种生物活性物质，主要为环烯醚萜类和挥发油类，而国内外公认的栀子有效成分为环烯醚萜类物质，其中含量最高的为栀子苷，又称为京尼平苷，其苷元为京尼平。

朱文佩等以不同成熟度的栀子果实为样品，采用高效液相色谱法测定，为确定最适采收期奠定基础，结果表明不同成熟度果实样品的栀子苷含量随成熟度提高而下降。这与何国振等报道的不同成熟期栀子果实中栀子苷含量变化结果一致；吴小燕等研究表明栀皮和栀仁中主要活性成分的分布是有一定特征规律的，其中环烯醚萜苷类的代表性成分栀子苷富集于栀仁(种子)中。

由于栀子是栀子果实是栀子苷主要天然获得来源，栀子苷的获取完全依赖于栀子果实，而栀子苷的含量与栀子果实成熟度呈负相关，因此通过天然途径获取栀子苷成本较高，而且产量不稳定。

通过植物细胞工程筛选产栀子细胞进行规模化培养是解决栀子来源短缺的有效途径之一。早在1989年，日本科学家就进行了栀子组织培养生产次生代谢产物的研究，而国内对栀子愈伤组织获得初生代谢产物和次生代谢产物的研究起步较晚。在获取初生代谢产物方面，石若夫等筛选出适宜栀子多糖合成的悬浮细胞株及培养条件。在获取次生代谢产物方面，钟青萍等筛选出适宜栀子愈伤组织生长和栀子黄色素产生的培养基。陈书安等为解决藏红花资源短缺问题，研究了栀子愈伤组织的诱导，筛选出藏红花素含量高、生长快速且不易褐化的栀子愈伤组织细胞系，为解决藏红花素资源短缺等问题提供了种子资源。目前还未见有通过细胞培养生产栀子苷的报道。本发明人长期从事栀子栽培和组织培养研究，旨在为药用栀子提供优质遗传资源，在以提取栀子苷为目的的药用栀子创新中，发明人尝试采用植物细胞工程技术改造种质，取得了较好的效果。

技术实现要素：

本发明的目的通过组织培养获得栀子苷，减少季节、气候和种质资源对栀子苷生产的影响。包括下述步骤：

1、果实离体前诱变处理

栀子坐果期，用秋水仙素处理栀子果，处理结束后，用清水对存活的果实进行喷雾淋洗；所述栀子果实的直径为2-3mm,秋水仙素溶液浓度为0.6-1.2％，处理时长24-36小时；进一步的，秋水仙素溶液中还添加2-6mg/tdz。

或者，对花期的栀子进行诱导，每天用浓度为0.6-1.2％的秋水仙素喷洒花芽，持续时间为3-9天。进一步的，秋水仙素溶液中还添加2-6mg/tdz。

2、诱导含多倍体细胞的愈伤组织

8月中旬采摘未成熟的新鲜栀子果实拨开取其种子并消毒，通过无菌操作将消毒处理的种子拨去种皮，并用解剖刀将脱皮的栀子仁按横切面切成两半，接种在脱分化培养基上，25℃左右室温下培养7-10天，获得种仁愈伤组织；

以2n＝22为对照，采用流式细胞仪对愈伤组织进行倍性分析。根据待测样品与对照样品荧光强度峰值的大小关系计算出待测样品的倍性，发现愈伤组织发生染色体倍增的现象占总体的85％以上，所有愈伤组织都为混倍体。

3、继代培养

将步骤2)得到的多倍体细胞系接种在ms固体培养基中，继代培养三次以上，每次继代培养的时间为7-10天。

4、栀子苷合成培养

将步骤3)得到的多倍体细胞接种在合成培养基中，25℃左右室温下培养10-20天，得到富集栀子苷次生代谢产物的细胞。

所述步骤2)中脱分化培养基是在ms培养基中添加0.5mg/l的2,4-d、0.25mg/l6-ba，1.0-3.0mg/l的辅酶a、30-40mg/l的蔗糖得到的培养基；

所述步骤3)中继代培养用的培养基为在ms培养基的基础上添加1.0-3.0mg/l的naa和2.0-4.0mg/l6-ba得到的培养基；

所述步骤4)合成培养所用的培养基在ms液体培养基中添加苯丙氨酸400mg/l，酪氨酸350mg/l，5-氮杂胞苷30-60um，蔗糖30-60g/l，ph调整到5.5-6.5；

本发明获得了富含栀子苷的细胞，解决了栀子细胞生长与栀子苷含量下降之间的矛盾，减少了受自然条件的影响和限制。

附图说明

图1是含有混合多倍体细胞的愈伤组织；

图2是本发明的技术路线

具体实施方式

为了更好理解本发明，通过如下实施例进一步说明，但并不是对本发明的限定。

实施例1利用栀子仁离体细胞规模培养生产栀子苷

1、果实离体前诱变处理

栀子坐果期，用浸透秋水仙素溶液的脱脂棉球包裹栀子果实，并用保鲜膜严密包裹，处理结束后，去除保鲜膜和棉球，用清水对存活的果实进行喷雾淋洗；所述栀子果实的直径为2-3mm,秋水仙素溶液浓度为1.2％，处理时长36小时；进一步的，秋水仙素溶液中还添加4mg/tdz。

2、诱导含多倍体细胞的愈伤组织

8月中旬采摘未成熟的新鲜栀子果实拨开取其种子并消毒，通过无菌操作将消毒处理的种子拨去种皮，并用解剖刀将脱皮的栀子仁按横切面切成两半，接种在脱分化培养基上，25℃左右室温下培养10天，获得含多倍体细胞的愈伤组织。

其中脱分化培养基是在ms培养基中添加0.5mg/l的2,4-d、0.25mg/l6-ba，3.0mg/l的辅酶a、40mg/l的蔗糖得到的培养基；

3、继代培养

将步骤2)得到的多倍体细胞系接种在ms固体培养基中，继代培养三次以上，每次继代培养的时间为10天。

其中继代培养用的培养基为在ms培养基的基础上添加3.0mg/l的naa和4.0mg/l6-ba得到的培养基。

4、栀子苷合成培养

将步骤3)得到的多倍体细胞接种在合成培养基中，25℃左右室温下培养15天，得到富集栀子苷次生代谢产物的细胞。

其中合成培养所用的培养基在ms液体培养基中添加苯丙氨酸400mg/l，酪氨酸350mg/l，60um5-氮杂胞苷，60g/l蔗糖，ph调整到6.0；

实施例2利用栀子仁离体细胞规模培养生产栀子苷

1、果实离体前诱变处理

对花期的栀子进行诱导，每天用浓度为0.6-1.2％的秋水仙素溶液喷洒花芽，持续时间为3-9天，其中秋水仙素溶液中还添加2-6mg/tdz。

2、诱导多倍体愈伤组织

8月中旬采摘未成熟的新鲜栀子果实拨开取其种子并消毒，通过无菌操作将消毒处理的种子拨去种皮，并用解剖刀将脱皮的栀子仁按横切面切成两半，接种在脱分化培养基上，25℃左右室温下培养10天，获得具有多倍体细胞的种仁愈伤组织；

其中脱分化培养基是在ms培养基中添加0.5mg/l的2,4-d、0.25mg/l6-ba，1.0mg/l的辅酶a、30mg/l的蔗糖得到的培养基。

3、继代培养

将步骤2)得到的多倍体细胞系接种在ms固体培养基中，继代培养三次以上，每次继代培养的时间为10天；

其中继代培养用的培养基为在ms培养基的基础上添加3.0mg/l的naa和4.0mg/l6-ba得到的培养基。

4、栀子苷合成培养

将步骤3)得到的多倍体细胞接种在合成培养基中，25℃左右室温下培养10-20天，得到富集栀子苷次生代谢产物的细胞。

其中合成培养所用的培养基在ms液体培养基中添加苯丙氨酸400mg/l，酪氨酸350mg/l，5-氮杂胞苷50um，蔗糖40g/l，ph调整到6.0。

实施例3栀子愈伤组织中栀子苷含量测定

用高效液相色谱(hplc)法测定实施例1和实施2培养物中栀子苷的含量，与栀子仁中栀子苷含量进行比较，结果见下表。

表1对照实验结果(n＝3)

四个样品经本发明提供的方法进行培养后，得到的组织中栀子苷含量均显著增加，其中按照实施例1的方法增幅较高，按照实施例2的方法增幅略低。