本发明属于作物抗病基因定位
技术领域：
，具体涉及一种构建甘蔗抗褐锈病基因定位抗感病池的方法。
背景技术：
：甘蔗褐锈病是由黑顶柄锈菌(puccina.melanocephalah.sydow&p.sydow)引起的一种重要病害，其主要表现为蔗叶出现大量红褐色病斑，病斑合并形成大幅不定形的坏死区域，结果蔗叶未熟先死，甚至嫩叶也是这样。造成甘蔗种质退化、产量降低，发病严重田块，一般减产15％～30％，蔗糖分降低10％～36％。该病在我国甘蔗主产区常发生流行，造成巨大的经济损失，严重影响着蔗糖产业的可持续发展。甘蔗褐锈病的发生流行与品种抗病性密切相关，大面积种植感病品种是病害流行的重要原因。生产上，大面积施药防治甘蔗褐锈病非常困难，且收效甚微，选育和种植抗病品种是防治甘蔗褐锈病最经济有效的措施。而抗病种质资源的发掘利用是抗病育种的基础和关键。甘蔗野生资源是现代甘蔗育种中抗病基因的重要来源，挖掘野生抗病基因资源提供育种利用，拓宽甘蔗抗病遗传基础，对选育抗病品种具有重要意义。滇蔗茅(erianthusrockiikeng.)是我国独有的甘蔗近缘属珍稀野生种，前期研究发现其具有高抗褐锈病特性，经分子标记检测分析未检测到已发现的褐锈病抗性基因bru1，预示滇蔗茅可能含有新的抗褐锈病基因。因此，针对有效开展甘蔗抗褐锈病育种的基础及关键切入点，利用高抗褐锈病种质资源滇蔗茅，研究明确其抗性遗传规律，发掘新抗性基因资源十分必要。抗性基因的发掘与定位，可为抗褐锈病新基因的分离克隆及开展分子育种奠定基础，对有效防控甘蔗褐锈病和确保我国蔗糖产业持续稳定发展具有重要意义。而抗褐锈病新基因发掘与定位的基础和关键，需要开发建立简便、系统性的抗感病池构建方法，构建用于抗褐锈病基因定位的抗感病池。技术实现要素：本发明的目的在于针对甘蔗抗褐锈病新基因发掘与定位的基础和关键提供一种简便、系统性构建甘蔗抗褐锈病基因定位抗感病池的方法。本发明的技术方案以下：一种构建甘蔗抗褐锈病基因定位抗感病池的方法，包括以下步骤：(1)亲本选择:分别选取高抗褐锈病不含bru1基因滇蔗茅和高感褐锈病甘蔗品种作为亲本；(2)配制杂交组合杂交：以高感褐锈病甘蔗品种作母本×高抗褐锈病不含bru1基因滇蔗茅作父本配制杂交组合，通过杂交得到f1代种子；(3)杂交组合亲本间多态性引物筛选：筛选出杂交组合在感病和抗病亲本间条带清晰、多态性明显、重复性好的ssr引物；(4)筛选真实性杂交f1代群体：每个杂交组合f1代种子播种至少1000粒，利用步骤(3)所选的ssr引物对杂交组合f1代种子苗进行杂交后代真实性鉴定，每个杂交组合筛选出真实性杂交f1代单株至少500苗；(5)田间人工接种褐锈病病菌：田间种植真实性杂交f1代确保成活至少400苗，用褐锈病病菌孢子悬浮液于傍晚喷雾田间种植的真实性杂交f1代蔗叶接种；首次接种后，第二天按前述接种方式再接种1次；(6)病情调查：接种4-5周后，调查记录各真实性杂交f1代单株发病情况，逐份材料进行调查，目测每份材料叶片褐锈病侵染面积百分率；(7)抗病性评价：根据各真实性杂交f1代单株发病情况按1-9级分级标准进行褐锈病抗性评价，其中,叶片无症状为1级高抗；叶片病斑占叶面积10％以下为2级抗病；叶片病斑占叶面积11％-25％为3级中抗；叶片病斑占叶面积26％-35％为4级中感；叶片病斑占叶面积36％-50％为5级感病1；叶片病斑占叶面积51％-60％为6级感病2；叶片病斑占叶面积61％-75％为7级感病3；叶片病斑占叶面积76％-90％为8级高感1；叶片病斑占叶面积91％-100％为9级高感2；(8)抗性遗传分析：根据真实性杂交f1代群体褐锈病抗性，按1-3级抗病:4-9级感病计算杂交后代遗传分离群体抗感分离比，杂交后代遗传分离群体抗感分离比≈3:1，表明其遗传分离群体抗褐锈病基因由显性单基因控制，将其遗传分离群体用于构建甘蔗抗褐锈病基因定位的抗感病池材料；(9)抗感病池构建：在杂交后代遗传分离群体抗感分离比≈3:1的每一个遗传分离群体中选取1级高抗材料至少10株和选取9级高感2材料至少10株，分别提取dna，每一个遗传分离群体中所选取的1级高抗材料的dna等量混合构成一个甘蔗抗褐锈病基因定位抗病池，每一个遗传分离群体中所选取的9级高感2材料的dna等量混合构成一个甘蔗抗褐锈病基因定位感病池。进一步，步骤(5)中所述的褐锈病病菌孢子悬浮液为采集带褐锈病孢子蔗叶提取病菌孢子直接用于接种，具体是：采集带褐锈病孢子蔗叶浸泡于盛有清水的塑料盆中1h，用手搓揉病叶将孢子释放至清水中，经24目分样筛过滤后配成40-50个孢子/10×10倍视野的褐锈病病菌孢子悬浮液。进一步，步骤(1)中所述的高抗褐锈病不含bru1基因滇蔗茅为滇蔗茅云南95-19和滇蔗茅云南95-20，所述高感褐锈病甘蔗品种为粤糖03-393；进一步，步骤(2)中所配制的杂交组合为：粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19、粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20；进一步，步骤(3)中所述的ssr引物为：粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19亲本间多态性ssr引物为mssestb06引物和sc104n03-12引物，粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”亲本间多态性ssr引物为sc104n03-12引物和msscir21引物，所述mssestb06引物由mssestb06上引物和mssestb06下引物组成，所述mssestb06上引物的碱基序列如seqidno：1所示，mssestb06下引物的碱基序列如seqidno：2所示；所述sc104n03-12引物由sc104n03-12上引物和sc104n03-12下引物组成，所述sc104n03-12上引物的碱基序列如seqidno：3所示，sc104n03-12下引物的碱基序列如seqidno：4所示；所述msscir21引物由msscir21上引物和msscir21下引物组成，所述msscir21上引物的碱基序列如seqidno：5所示，msscir21下引物的碱基序列如seqidno：6所示；进一步，步骤(9)中在杂交后代遗传分离群体抗感分离比≈3:1的“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”和“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”两个遗传分离群体中，每一个遗传分离群体中选取1级高抗材料和9级高感2材料各至少10株，分别用叶片提取dna，每一个遗传分离群体中所选取的1级高抗材料的dna等量混合构成一个甘蔗抗褐锈病基因定位抗病池、每一个遗传分离群体中所选取的9级高感2材料的dna等量混合构成一个甘蔗抗褐锈病基因定位感病池。本发明的优点和有益效果：1、首次建立了一套简便、系统性构建甘蔗抗褐锈病基因定位抗感病池的方法，利用本发明方法构建的用于甘蔗抗褐锈病基因定位的抗感病池，为甘蔗抗褐锈病新基因的分离克隆及开展分子育种奠定了良好基础、提供了技术支撑，对利用抗病基因有效防控甘蔗褐锈病和确保我国蔗糖产业持续稳定发展具有重要意义和现实作用。2、本发明方法程序简化，可操作性强。本发明用抗感分离比≈3:1的2个滇蔗茅杂交组合“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”、“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”构建的抗感病池，因此，可用于甘蔗抗褐锈病基因定位。序列表中seqidno：1所示的是mssestb06上引物的碱基序列。序列表中seqidno：2所示的是mssestb06下引物的碱基序列。序列表中seqidno：3所示的是sc104n03-12上引物的碱基序列。序列表中seqidno：4所示的是sc104n03-12下引物的碱基序列。序列表中seqidno：5所示的是msscir21上引物的碱基序列。序列表中seqidno：6所示的是msscir21下引物的碱基序列。序列表中seqidno：7所示的是smc336bs*上引物的碱基序列。序列表中seqidno：8所示的是smc336bs*下引物的碱基序列。序列表中seqidno：9所示的是smc31cuq*上引物的碱基序列。序列表中seqidno：10所示的是smc31cuq*下引物的碱基序列。具体实施方式1、亲本选择本发明在众多甘蔗品种中经常规人工接种抗褐锈病鉴定和抗褐锈病基因bru1的分子检测，筛选出2个高抗褐锈病不含bru1基因滇蔗茅“滇蔗茅云南95-19”、“滇蔗茅云南95-20”和2个高感褐锈病甘蔗品种粤糖03-393、德蔗03-83作为亲本(4份材料均可通过商业渠道购买)。2、配制杂交组合杂交分别以高感褐锈病甘蔗品种作母本×高抗褐锈病不含bru1基因滇蔗茅作父本，配制“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”、“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”、“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-19”、“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-20”4个杂交组合，通过杂交得到4个杂交组合f1代种子。3、杂交组合亲本间多态性引物筛选选取84对甘蔗ssr引物，经过对杂交组合亲本间多态性ssr引物大量筛选实验，从中筛选出感病和抗病亲本间条带清晰、多态性明显、重复性好的“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”亲本间多态性ssr引物为mssestb06引物和sc104n03-12引物，“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”亲本间多态性ssr引物为sc104n03-12引物和msscir21引物，“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-19”亲本间多态性ssr引物为mssestb06引物和smc336bs*引物，“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-20”亲本间多态性ssr引物为mssestb06引物和smc31cuq*引物。所述mssestb06引物由mssestb06上引物和mssestb06下引物组成。所述sc104n03-12引物由sc104n03-12上引物和sc104n03-12下引物组成。所述msscir21引物由msscir21上引物和msscir21下引物组成。所述smc336bs*引物由smc336bs*上引物和smc336bs*下引物组成。所述smc31cuq*引物由smc31cuq*上引物和smc31cuq*下引物组成。4、筛选真实性杂交f1代群体“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”、“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”、“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-19”、“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-20”4个杂交组合f1代种子各播种至少1000粒，利用步骤3各杂交组合亲本间多态性引物对各杂交组合f1代种子苗进行杂交后代真实性鉴定，每个杂交组合筛选出真实性杂交f1代单株至少500苗。所述各引物的反应体系和反应程序是：20μl反应体系中含ddh2o8.5μl、2×easytaqpcrsupermixforpage9.0μl、dna模板0.5μl、上下游引物各1.0μl(10μg/μl)。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。真实性杂交f1代判别：后代扩增条带均来自父母本，判定为真杂种；后代扩增条带中含有父母本以外的杂带，判定为假杂种；后代扩增条带仅含有母本条带，判定为自交种。5、田间人工接种褐锈病病菌：7月分别将“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”、“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”、“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-19”、“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-20”4个杂交组合真实性杂交f1代单株移植田间，每个杂交组合种植5行区、每行80苗、7天后补苗1次、确保成活至少400苗，正常管理。10月从云南省弥勒发病蔗田采集带褐锈病孢子病叶保湿带回实验室提取病菌孢子直接用于接种。发病蔗叶浸泡于盛有2/3清水塑料盆中1h，用手搓揉病叶将孢子释放至清水中，经24目分样筛过滤后配成40-50个孢子/10×10倍视野的褐锈病病菌孢子悬浮液，于傍晚用高压机动喷雾器喷雾田间种植的真实性杂交f1代蔗叶接种。接种量控制在褐锈病病菌孢子悬浮液在蔗叶上不流淌为宜。首次接种后，第二天按前述相同接种方式再接种1次。6、病情调查接种4-5周后，调查记录各真实性杂交f1代单株发病情况，逐份材料进行调查，目测每份材料叶片感病状况及侵染面积百分率。(7)抗病性评价：根据各真实性杂交f1代单株发病情况按1-9级分级标准进行褐锈病抗性评价，其中,叶片无症状为1级高抗；叶片病斑占叶面积10％以下为2级抗病；叶片病斑占叶面积11％-25％为3级中抗；叶片病斑占叶面积26％-35％为4级中感；叶片病斑占叶面积36％-50％为5级感病1；叶片病斑占叶面积51％-60％为6级感病2；叶片病斑占叶面积61％-75％为7级感病3；叶片病斑占叶面积76％-90％为8级高感1；叶片病斑占叶面积91％-100％为9级高感2。其中,“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”真实性杂交f1代群体中297个单株表现1-3级抗病，103个单株表现4-9级感病。“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”真实性杂交f1代群体中295个单株表现1-3级抗病，105个单株表现4-9级感病。“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-19”真实性杂交f1代群体中60个单株表现1-3级抗病，340个单株表现4-9级感病。“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-20”真实性杂交f1代中37个单株表现1-3级抗病，363个单株表现4-9级感病。根据真实性杂交f1代群体褐锈病抗性，按1-3级抗病:4-9级感病计算杂交后代遗传分离群体抗感分离比，杂交后代遗传分离群体抗感分离比≈3:1，如表1所示，“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”杂交后代遗传分离群体抗感分离比297r:103s≈3:1，“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”杂交后代遗传分离群体抗感分离比295r:105s≈3:1，“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-19”杂交后代遗传分离群体抗感分离比60r:340s≈1:6，“德蔗03-83×滇蔗茅云南95-20”杂交后代遗传分离群体抗感分离比37r:363s≈1:10。其中，“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”、“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”两个组合杂交后代遗传分离群体抗感分离比均≈3:1，表明其褐锈病抗病基因由显性单基因控制，该两个真实性杂交f1代遗传分离群体均可构建褐锈病抗感病池用于甘蔗抗褐锈病基因定位。表1各杂交f1代群体褐锈病抗性遗传分析结果杂交组合抗感分离比褐锈病抗性遗传类型粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19297r:103s≈3:1抗病基因为单基因显性遗传粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20295r:105s≈3:1抗病基因为单基因显性遗传德蔗03-83×滇蔗茅云南95-1960r:340s≈1:6抗病基因为隐性遗传德蔗03-83×滇蔗茅云南95-2037r:363s≈1:10抗病基因为隐性遗传9、抗感病池构建：从杂交后代遗传分离群体抗感分离比≈3:1的“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-19”和“粤糖03-393×滇蔗茅云南95-20”两个遗传分离群体中，每个遗传分离群体随机选取1级高抗材料10株和9级高感2材料10株，分别用其叶片提取dna(dna提取按常规植物dna提取试剂盒说明书操作)。每个遗传分离群体中所选取的1级高抗的10株材料的dna等量混合构成一个甘蔗抗褐锈病基因定位抗病池、每个遗传分离群体中所选取的9级高感2的10株材料的dna等量混合构成一个甘蔗抗褐锈病基因定位感病池。共构建两个甘蔗抗褐锈病基因定位抗病池和两个甘蔗抗褐锈病基因定位感病池。序列表<110>云南省农业科学院甘蔗研究所<120>一种构建甘蔗抗褐锈病基因定位抗感病池的方法<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgatcccctcctcctcctccaatg24<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tccactccacacctgacctgaccac25<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agttgacccggactatgtgg20<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tggaagctctttctatgcctg21<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cgccagccacataaaagg18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgaccaggagttcatcaa18<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7attctagtgccaatccatctca22<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8catgccaacttccaaacagac21<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9catgccaacttccaatacagact23<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10agtgccaatccatctcagaga21当前第1页12