树鼩行为敏化模型评估方法及评估所用的旷场实验装置与流程

本发明涉及一种树鼩行为敏化模型评估方法及评估所用的旷场实验装置。
背景技术：
：行为敏化是指反复、间断给予吗啡、甲基苯丙胺(meth)、可卡因等依赖性药物后，动物表现为自主活动增加、出现刻板行为等对依赖性药物行为效应改变的过程。行为敏化是药物成瘾的特征表现之一，与药物复吸和渴求密切相关，目前大量有关药物成瘾的研究涉及建立行为敏化动物模型。然而，这些模型建立所使用的实验动物多为大鼠或小鼠，由于啮齿类动物与人类在神经系统方面存在较大差异，故研究结果往往不能很好的反映依赖性药物对人体的神经毒性及人类对该类药物的成瘾行为。树鼩是界于啮齿类及灵长类之间的动物，相比于啮齿类动物，树鼩具有更为发达的大脑，且其在解剖学、生理学、基因组学等方面与人类更为相似，多用于神经系统方面的研究。截止目前，鲜有文献报道树鼩作为实验动物进行meth行为敏化研究，并通过旷场实验检测树鼩行为学、运动距离、速度及轨迹等指标改变，统计刻板行为评分及记录体重变化，以建立meth诱导树鼩行为敏化模型；同时现有的旷场实验装置在每次实验后均需要清洗底板，以消除实验对象在底板上留下的气味等具有标志性特征的因素，防止这些因素对实验对象造成影响，而当实验对象数量较多而需要分批次进行旷场实验时，拆下底板并进行清洗无疑会增加实验用时，而清洗时间过长无疑会影响药物在实验对象体内的药效，对实验结果造成极大的偏差。技术实现要素：本发明为了解决上述问题，提供了一种树鼩行为敏化模型评估方法及评估所用的旷场实验装置，该方法为树鼩行为敏化模型的建立提供了借鉴与指导，为更多的科研工作者提供切实可行的操作方法，方便其借助树鼩行为敏化模型研究依懒性药物的成瘾机制；旷场实验装置可在每批次实验完成后方便更换底板，减少清洗、刮干、装配等过程的用时，提高实验效率。为了实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：树鼩行为敏化模型评估方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、meth诱导树鼩行为敏化；步骤2、旷场实验检测树鼩行为学、运动距离、速度及轨迹改变，树鼩体重变化测定；步骤3、刻板行为评分，评分标准为：进一步的，所述的步骤1中meth诱导树鼩行为敏化模型的制作过程包括：a)选择成年雄性树鼩；b)连续9天在固定时间给树鼩腹腔注射meth，按树鼩体重，meth注射量为2mg/kg；c)第10天停药戒断；d)第14天给予腹腔注射meth，meth注射量为0.5mg/kg，得到meth诱导树鼩行为敏化模型。树鼩行为敏化模型评估所用的旷场实验装置，其特征在于，包括箱体、底板更换箱、移动式底盘、固定支架和摄像头，移动式底盘的底部安装有带制动万向轮，箱体固定于底板更换箱的顶部，底板更换箱固定于移动式底盘上，固定支架的立柱固定于移动式底盘的两侧，摄像头固定于固定支架的横杆上；所述的底板更换箱的前面板顶部开有底板更换缺口，底板更换缺口的中部开有卡槽，底板更换箱的箱底固定有弹簧，底板叠放于底板更换箱的弹簧上且底板的顶面紧贴于箱体的底面，底板的卡块卡在卡槽中，底板更换缺口的宽度不小于底板的厚度。进一步的，所述的弹簧设有4个，固定于底板更换箱的4个角部。本发明的有益效果是：该方法为树鼩行为敏化模型的建立提供了借鉴与指导，为更多的科研工作者提供切实可行的操作方法，方便其借助树鼩行为敏化模型研究依懒性药物的成瘾机制；旷场实验装置可在每批次实验完成后方便更换底板，减少清洗、刮干、装配等过程的用时，提高实验效率。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是不同剂量的meth对树鼩的刻板行为评分的影响图；图2是不同剂量的meth对树鼩的运动轨迹的影响图；图3是不同剂量的meth对树鼩的运动距离的影响图；图4是不同剂量的meth对树鼩的运动速度的影响图；图5是不同剂量的meth对树鼩的体重的影响图；图6是旷场实验装置的整体结构示意图；图7是所述的移动式底盘和固定支架的装置结构示意图；图8是所述的箱体俯视结构示意图；图9是所述的箱体仰视结构示意图；图10是所述的底板更换箱和底板的装配结构示意图；图11是所述的底板的结构示意图；图12是所述的底板更换箱的结构示意图。附图中，各标号所代表的部件列表如下：1-箱体，11-裙边；2-底板更换箱，21-卡槽，22-弹簧；3-移动式底盘，31-底盘，32-带制动万向轮；4-固定支架，41-横杆；5-摄像头；6-底板，61-卡块。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。树鼩行为敏化模型评估方法，包括以下步骤：步骤1、meth诱导树鼩行为敏化；步骤2、旷场实验检测树鼩行为学、运动距离、速度及轨迹改变，树鼩体重变化测定；步骤3、刻板行为评分，评分标准为：进一步的，所述的步骤1中meth诱导树鼩行为敏化模型的制作过程包括：a)选择成年雄性树鼩；b)连续9天在固定时间给树鼩腹腔注射meth，按树鼩体重，meth注射量为2mg/kg；c)第10天停药戒断；d)第14天给予腹腔注射meth，meth注射量为0.5mg/kg，得到meth诱导树鼩行为敏化模型。本实施例通过以下实验进一步验证该方法的有效性：一、meth诱导树鼩行为敏化选择40只体重140g左右的成年雄性树鼩，随机分为实验组及对照组，每组10只，实验组分别为低meth组(1mg/kg)、中meth组(2mg/kg)和高meth组(4mg/kg)，按上述剂量给予meth；对照组予以等体积生理盐水。①给药前，所有动物放入旷场试验箱适应3天，每天于试验箱检测1小时；②第4-12天期间，每组每天按体重在固定时间腹腔注射树鼩不同剂量meth或生理盐水一次，给药后放入试验箱检测1小时；③第13-16天停药戒断，不做其他处理；④第17天给予小剂量meth(0.5mg/kg)，放入试验箱检测1小时。二、检测项目通过旷场实验检测树鼩的行为学(如急速来回跑动、向后翻转跳跃及向前绕圈跳跃，流涎、易激惹、致残、摇头、震颤、排便增多、尾巴翘起呈半卷曲状且不停抖动，叫声急促、饮水增加等)、运动距离、速度及轨迹等指标改变；通过电子天平测定树鼩体重变化。三、刻板行为评分通过观看旷场实验录制的视频，并参照ghf-dodd评分方法，作出刻板行为评价，具体如下：评分行为描述0静止不动或几乎没有活动1分正常活动伴随原地反复探索，无固定方向反复探索2分沿周围快速奔跑、绕圈，反复攀爬、跳跃3分反复扭头、翘尾巴，反复抽搐打嗝背曲运动四、统计学分析实验数据采用spss统计分析软件包进行处理，数据以均数±标准差表示。树鼩刻板行为评分采用单因素方差分析；树鼩运动距离、速度及体重变化组内采用配对t检验，组间采用单因素方差分析，p<0.05表示差异显著，p≤0.01表示差异极为显著。五、结果5.1、树鼩行为学改变各实验组树鼩活动明显增加，主要表现为树鼩在旷场内急速来回跑动、向前绕圈、向后翻转跳跃等；树鼩还表现出易激惹、向前探索、摇头、攀爬、排便增多、尾巴翘起呈半卷曲状且不停抖动、叫声急促、饮水增加等行为学变化，而对照组树鼩则无上述表现。此外，各实验组均可观察到刻板行为，主要表现为树鼩活动伴随反复探索，反复攀爬、跳跃，反复沿周围快速奔跑、绕圈，反复扭头、翘尾巴，反复抽搐打嗝背曲运动等。其中以高meth组表现最为典型，而对照组树鼩行为未见明显改变。5.2、树鼩刻板行为评分比较如表1及图1所示，各实验组树鼩给药后均出现刻板行为，随着meth浓度增加，刻板行为评分呈现增高趋势。与对照组比较，中、高meth组树鼩的刻板行为显著(*p＝0.041<0.05，***p<0.001)；此外，与低、中meth组相比，高meth组树鼩表现出典型的刻板行为(#p＝0.004<0.01,$p＝0.04<0.05)。表1不同剂量的meth对树鼩的刻板行为评分的影响5.3、树鼩运动轨迹比较图2反应了各组树鼩的运动轨迹，可见中meth组树鼩的活动最高，但高meth组树鼩活动反而有所下降。提示meth可诱导树鼩高活动性，然而，高剂量meth作用下，树鼩主要表现为刻板行为。5.4、树鼩运动距离比较如图3所示，与对照组比较，各实验组首次给药meth后，树鼩运动距离显著增多(gp＝0.001<0.01,ep<0.001,fp＝0.002<0.01)。在各实验组组间，进行了第12天给药后与首次给药后的比较，以及小剂量刺激给药后与首次给药后的比较，低meth组d12vsd4(t＝2.817,dp＝0.02<0.05)，d17vsd4(t＝4.078,cp＝0.003<0.01)；中meth组d12vsd4(t＝5.920,bp<0.001)，d17vsd4(t＝6.319,ap<0.001)；高meth组d12vsd4(t＝1.872,p＝0.094＞0.05)，d17vsd4(t＝1.624,p＝0.139＞0.05)。可见低、中meyh组树鼩运动距离d12、d17与d4比较差异显著，而高meth组树鼩上述比较无统计学差异。说明低、中meth在诱导树鼩行为敏化获得期及表达期中，均使树鼩活动性显著增加，而高剂量meth作用下，树鼩主要表现为刻板行为。5.5、树鼩运动速度比较如图4所示，首次给药后，与对照组比较，中、高meth组树鼩运动速度显著增多(gp＝0.001<0.01,hp＝<0.001)，而低meth组树鼩运动速度无统计学差异(p＝0.169＞0.05)；与低meth组比较，中、高meth组树鼩运动速度显著增多(p＝0.046<0.05，p＝0.004<0.01)。与运动距离相似，低meth组d12vsd4(t＝4.084,dp＝0.003<0.01)，d17vsd4(t＝5.588,cp<0.001)；中meth组d12vsd4(t＝4.139,bp＝0.003<0.01)，d17vsd4(t＝8.202,ap<0.001)；高meth组d12vsd4(t＝-3.511,fp＝0.007<0.01)，d17vsd4(t＝-6.873,ep<0.001)。说明低、中meth组在诱导树鼩行为敏化获得期及表达期中，均使树鼩运动速度显著增加；而高剂量meth组树鼩自d9起运动速度下降，原因在于此时树鼩主要表现为刻板行为。5.6树鼩体重变化如图5所示，每天给药前称量体重一次，发现体重呈现下降趋势。与首次给药前的体重相比，各实验组树鼩在d12和d17给药前体重下降十分显著(t＝-7.950,bp<0.001；t＝-8.434,ap<0.001；t＝-9.908,dp<0.001；t＝-11.466,cp<0.001；t＝-3.295,fp＝0.009<0.01；t＝-4.118,ep＝0.003<0.01)。对照组体重变化并不明显(t＝-0.369,hp＝0.721＞0.05；t＝0.561,gp＝0.589＞0.05)。六、结论本实施例中使用树鼩作为研究对象，采用不同剂量meth(1mg/kg,2mg/kg,4mg/kg)连续给药9天诱导行为敏化形成；随后停药戒断4天诱导行为敏化转换；最后于d17通过小剂量meth(0.5mg/kg)诱导行为敏化表达。在树鼩行为敏化形成期及表达期内，每天观察树鼩行为学变化，检测其运动距离、速度及轨迹等指标改变，并统计刻板行为评分及记录体重变化。在meth诱导树鼩行为敏化行为学方面，相比于对照组，各实验组树鼩活动明显增加，各组的运动轨迹图进一步反映meth诱导了树鼩的高活动性(如图2)。此外，各实验组树鼩给药后均出现刻板行为，同时，刻板行为的程度随meth剂量的升高而增强，中、高meth组树鼩的刻板行为评分明显高于对照组，且高meth组树鼩的刻板行为评分明显高于低、中meth组(详见表1，图1)。说明各剂量meth均可诱导树鼩行为敏化形成，其中低、中剂量时主要引起树鼩高活动性，刻板行为出现较少，而高剂量时主要引起树鼩刻板行为，因此树鼩活动下降。在meth诱导树鼩行为敏化形成期及表达期中，树鼩运动距离及速度的结果相似，首次给药后，各实验组树鼩运动距离较对照组增高显著(详见图3)，中、高meth组树鼩运动速度较对照组增高显著(详见图4)；在低、中剂量meth作用下，各实验组树鼩的运动距离及速度都呈现上升趋势，d12及d17与d4比较，上述两个指标的升高在统计学上具有显著差异性(详见图3，4)。然而，高剂量meth作用时，树鼩运动距离的增高无统计学意义，且树鼩运动速度自d9起，还出现了下降趋势(详见图3，4)。考虑小剂量meth剂量依赖性的引起树鼩运动距离及运动速度增加，而刻板行为变化较轻微；在大剂量meth作用时，树鼩的运动距离及运动速度反而受到抑制，此时刻板行为表现明显。上述结果与已报道的文献结果相一致。此外，各实验组树鼩的体重随着实验进行呈明显的下降趋势，与d4相比，各实验组树鼩在d12和d17给药前体重显著下降，这与meth诱导树鼩行为敏化的过程有关。在行为敏化形成期及表达期，树鼩运动距离及速度显著上升，行为上表现为反复探索、急速来回跑动、向后翻转跳跃、向前绕圈跳跃、易激惹、排便增多等改变，因此树鼩的体能消耗增大，体重随之下降。通过旷场实验检测树鼩行为学、运动距离、速度及轨迹等指标改变，并统计刻板行为评分及记录体重变化，本实施例中所采用的低、中、高三种剂量meth(1mg/kg,2mg/kg,4mg/kg)均能诱导建立树鼩行为敏化模型，其中理想的给药剂量为2mg/kg。meth诱导树鼩行为敏化模型的成功建立，可为今后依赖性药物的成瘾机制研究提供良好的实验动物模型。如图6-12所示,树鼩行为敏化模型评估用旷场实验装置，包括箱体1、底板更换箱2、移动式底盘3、固定支架4和摄像头5，箱体1固定于底板更换箱2的顶部，底板更换箱2固定于移动式底盘3上，固定支架4的立柱固定于移动式底盘3的两侧，摄像头5固定于固定支架的横杆41上；所述的底板更换箱2的前面板顶部开有底板更换箱2，底板更换缺口的中部开有卡槽21，底板更换箱2的箱底的四个角部各固定有1个弹簧22，底板6叠放于底板更换箱的弹簧22上且底板6的顶面紧贴于箱体1的裙边11上，底板的卡块61卡在卡槽21中，底板更换缺口的宽度不小于底板6的厚度。在使用该旷场实验装置后，将顶层的底板6从底板更换箱2前面板的底板更换缺口处抽出，下一块底板6在底板更换箱2底部的弹簧的挤压作用下向上运动，底板6的卡块61沿卡槽21向上滑动直至底板6的顶面紧密地贴合在箱体1底部的裙边11上，此时可继续进行下一批次的树鼩行为敏化模型的旷场实验，节省了更换、清洗、擦干、装配等过程，提高实验的效率和精确度。当前第1页12