尿刊酸在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用的制作方法

本发明涉及水产养殖的病毒性疾病防治领域，尤其涉及尿刊酸在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用。

背景技术：

对虾是一种重要的海洋经济养殖虾类。国内主要城市人均水产消费量与人均对虾消费量高度相关，2014-2016年，对虾消费需求在170万吨以上并持续稳步增长。对虾养殖是水产养殖业中最具代表性的产业之一。近年来，随着海水养殖规模的不断扩大、集约化程度的不断提高，新发病原和暴发性流行病的发生趋势均显著上升。由各类细菌、病毒感染等引起的各种疾病严重影响了对虾的养殖产业，造成了巨大的经济损失。白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)是日本囊对虾的主要病原，wssv对宿主具有泛嗜性，大多数的十足甲壳类海洋生物都会被其感染。克氏原螯虾，俗称小龙虾，是长江中下游地区重要的淡水虾。当前淡水小龙虾国内外市场的消费都呈增长趋势，需求量在不断增长。经多次证实wssv也是小龙虾养殖产业中虾病爆发的主要病原体。

日本囊对虾及克氏原螯虾作为无脊椎动物，主要依靠先天性免疫系统来抵御病原微生物，这大大增加了养殖过程中的病毒防治工作的难度。养殖池塘中的日本囊对虾及克氏原螯虾一旦暴发白斑综合症，会在短时间内大量死亡，在人工感染实验中感染了wssv的日本囊对虾及克氏原螯虾死亡率接近100％。长期以来，抗生素在日本囊对虾及克氏原螯虾病害防治中被大量使用，虽然此法可以在一定程度上防治病害，但由于抗生素的长期使用严重威胁了海洋及淡水生态平衡和水产养殖业的可持续发展，现已被严禁使用。目前无脊椎动物免疫与病害防治方面虽然已取得较大进展，但是应对wssv这种高致死率的病毒感染时，仍缺乏快速有效的防御方法。因而，寻找高效环保的wssv防治手段对病毒学研究及水产养殖业的可持续发展均具有重要的意义。

目前出现不少抗白斑综合症病毒的药物，如一种防治对虾白斑病的中西复方药物(专利号：200810152729.5)，中西复方药物为：黄连、黄芩、黄柏、栀子、黄芪多糖、葡醛内酯、维生素c，混合拌匀成粉末状。使用方法为：将药物与饲料拌在一起，选虾吃食最旺盛的时期每日喂食2次，连用5至7日。一种小龙虾wssv防治用免疫增强剂(专利号：201611090048.1)，免疫增强剂为：维生素e、酵母核酸、左旋咪唑、干扰素、聚乙二醇。其使用方法为：将上述免疫增强剂溶解至水中，搅拌混匀后喷洒至小龙虾养殖水域，3至4小时后，重复喷洒一次。但是虾体从进食药物到消化吸收需要一定的时间，而病毒的复制速度很快，上述发明所需材料种类繁多，且多用于预防，对于已爆发白班综合症的虾作用不大，且见效慢；所包含的材料多为非天然，并非来自于虾本身，是否会对虾造成副作用未知，其残留是否会对人体造成伤害也未知，其对养殖生态平衡的影响也未知。因此，是否适用于现实生产还不得而知。另外目前筛选抗白斑综合症病毒的药物时，仅考虑单一虾种，并没有对其他虾种尤其是不同水质虾种的效果，因此，适用范围单一。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供尿刊酸在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用，本发明的制剂能抑制wssv在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的复制，大幅降低由wssv感染所导致的日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡，减少日本囊对虾及克氏原螯虾养殖产业的损失。

尿刊酸在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用。尿刊酸广泛存在于哺乳动物表皮角质层，在紫外线引起的光免疫抑制过程中发挥着重要的功能。在日本囊对虾和克氏原螯虾的血细胞及淋巴组织中均有尿刊酸的合成，且当日本囊对虾及克氏原螯虾受到wssv刺激后，尿刊酸的含量急剧增多。

本发明的抗白斑综合症病毒制剂可以只包含尿刊酸单一化学物。

对于筛选尿刊酸作为抗白斑综合症病毒制剂的要求是：

1：应用面广，能够同时满足海水虾类及淡水虾类中wssv的防治工作。

2：防治结合，筛选及验证过程中都是先感染后治疗，不仅仅局限于预防，对于已爆发白斑综合症的虾同样适用。

3：安全环保，筛选药物来自虾体本身，不会破坏海洋及淡水养殖过程中的生态平衡，且在人体内的积累也不会有危害。

进一步的，所述制剂包括饲料添加剂、固体或者液体药物。

进一步的，所述制剂可用于海水虾类及淡水虾类。

进一步的，所述制剂可用于日本囊对虾和克氏原螯虾。

进一步的，所述尿刊酸能抑制白斑综合症病毒在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的复制。将尿刊酸与wssv共同注射至日本囊对虾及克氏原螯虾体内，不同时间段后检测病毒拷贝数。与对照组相比，尿刊酸处理组病毒的复制显著受到抑制。

进一步的，尿刊酸可大幅降低wssv感染导致的日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡。将尿刊酸与wssv共同注射至日本囊对虾及克氏原螯虾体内，统计5天的死亡率。与对照组相比，尿刊酸处理组的死亡率大幅降低。

进一步的，所述尿刊酸的添加量为200mm的浓度尿刊酸50μl/虾。

本发明通过研究代谢组在日本囊对虾和克氏原螯虾抵御wssv感染过程中的功能，发现尿刊酸可能是宿主抗病毒感染过程中的关键物质，体外合成所述尿刊酸并注射至日本囊对虾及克氏原螯虾中能显著wssv的复制，效率高，可大幅降低由wssv感染所导致的日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡。因此尿刊酸有望成为防治wssv感染的新药物，广泛应用于水产养殖过程中wssv的防治。其作为新型药物相较于以往的传统药物，不仅应用面广，能够同时满足海水虾类及淡水虾类中wssv的防治工作，且尿刊酸在哺乳动物及虾蟹类生物中广泛存在，其作为药物不会破坏海洋及淡水养殖过程中的生态平衡，尿刊酸在体内的积累也不会对人体造成危害，有利于海水及淡水水产养殖业的长期可持续发展。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)本发明的抗白斑综合症病毒制剂可以只包含尿刊酸单一化学物，目前多为多种物质的混合物，本发明更易应用于实际生产。

(2)本发明应用面广，能够同时满足海水虾类及淡水虾类中wssv的防治，抗wssv效率高且安全环保，可能成为一种新型的防治wssv感染的药物。

(3)本发明尿刊酸的筛选及验证过程中都是先感染后治疗，不仅仅局限于预防，对于已爆发白斑综合症的虾同样适用，而现有技术多为提高虾的免疫力，预防wssv的侵染。

(4)本发明尿刊酸来自虾体本身，不会破坏海洋及淡水养殖过程中的生态平衡，且在人体内的积累也不会有危害。

(5)本发明尿刊酸可显著抑制wssv在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的复制，大幅降低由wssv感染所导致的日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡。

附图说明

图1为利用wssv及pbs缓冲液处理日本囊对虾及克氏原螯虾后，血细胞及淋巴组织中尿刊酸的gc-mc检测结果图；

图2为尿刊酸及pbs对照组对日本囊对虾体内wssv复制的影响；将尿刊酸或pbs溶液混合wssv后注射至日本囊对虾体内，检测wssv感染0、24、48和72小时后wssv的拷贝数；

图3为尿刊酸及pbs对照组对克氏原螯虾体内wssv复制的影响；将尿刊酸或pbs溶液混合wssv后注射至克氏原螯虾体内，检测wssv感染0、24、48和72小时后wssv的拷贝数；

图4为尿刊酸及pbs对照组对wssv致死日本囊对虾的影响；将尿刊酸或pbs溶液混合wssv后注射至日本囊对虾体内，统计wssv感染5天内日本囊对虾的死亡率；

图5为尿刊酸及pbs对照组对wssv致死克氏原螯虾的影响；将尿刊酸或pbs溶液混合wssv后注射至克氏原螯虾体内，统计wssv感染5天内克氏原螯虾的死亡率。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：

筛选日本囊对虾及克氏原螯虾体内抗wssv感染关键物质的试验

将体重10g左右的日本囊对虾及20g左右的克氏原螯虾在室内水温25℃、每天换水1/5条件下暂养3天后，用1ml注射器于虾第2-3腹节肌肉注射50μl/只pbs缓冲液或wssv感染液。分别在注射后的0h、4h、6h、24h取虾血细胞及淋巴组织，用于gc-mc检测。

结果见图1。结果表明尿刊酸在日本囊对虾及克氏原螯虾受到wssv感染后含量显著增加，尤其是6h和24h，其含量相较于pbs对照组急剧增多。

实施例2：

尿刊酸抑制wssv在日本囊对虾及克氏原螯虾体内增殖的试验

给日本囊对虾及克氏原螯虾注射50μl/只wssv感染液，24h后再注射50μl/只尿刊酸溶液(200mm)或pbs溶液，wssv感染0h、24h、48h、72h后，将虾背部肌肉剪取适量，用组织基因组dna提取试剂盒(tiangen)抽提总dna，然后再用takara的premixextaqtm(probeqpcr)的试剂盒检测目的基因的特异片段，检测条件为95℃预变性4min；95℃5s，52℃30s，72℃20s，循环45次。用于荧光定量pcr的引物分别为p1，p2。

p1:5’-atgtctgcatctttaat-3’；p2:5’-ttatgacacaaacctat-3’。

结果见图2及图3，尿刊酸注射后48h和72h，日本囊对虾及克氏原螯虾体内wssv的拷贝数显著低于pbs及空白对照组，表明尿刊酸可以显著抑制wssv在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖。

实施例3：

尿刊酸降低wssv感染后日本囊对虾及克氏原螯虾累积死亡率的试验

按实施例2的方法实施wssv感染及尿刊酸(或pbs)注射实验。wssv感染后每天观察3次，及时捡出死亡和濒死虾，记录死亡数并持续观察5天。

结果见图4及图5，不同处理组日本囊对虾及克氏原螯虾的死亡率随时间而升高，pbs注射组及未处理组的死亡率相近，而wssv+尿刊酸注射组的死亡率显著性地低于wssvalone注射组。表明wssv感染日本囊对虾及克氏原螯虾后，注射尿刊酸可大幅降低由wssv感染所导致的虾死亡。