一种彩色结球甘蓝新种质的培育方法与流程

本发明属于植物遗传育种技术领域，具体涉及一种彩色结球甘蓝新种质的培育方法。

背景技术：

结球甘蓝(brassicaoleraceal.var.capitata)为十字花科芸薹属蔬菜作物，以叶球为食用的产品器官。其叶片为卵圆形全缘叶，叶表被蜡粉。目前国际市场上的品种只有绿色叶球的结球甘蓝及紫红色叶球的结球甘蓝(商品名：紫甘蓝)。后者叶色紫红，结球紧实，叶片较厚、质地较硬，生食或炒食，口感较硬，无明显甜味，单球重约1.5-2kg。上述结球甘蓝的适宜生长温度为10-25℃。

羽衣甘蓝(b.oleraceal.var.acephaladc.)与结球甘蓝同属于芸薹属甘蓝种(brassicaoleraceal..)，为不结球散叶变种。其叶片形态多变，依叶型及株型可以分为圆叶、皱叶、羽状叶、插花4大类型。依主要的产品用途，分为绿色叶的食用类型及彩色叶的观赏类型(ornamentalkale)。羽衣甘蓝在低温下不同品种因为花青甘等色素积累含量不同而呈现出紫色、红色、粉色、淡黄、白色等多种叶色，具有很好的观赏价值；叶片具有较高的营养价值，可以生食、炒食和加工。植株能耐-5℃以上的长期低温，以及-10℃的短暂低温。

研究表明羽衣甘蓝的良好抗冻性与其在低温胁迫下，细胞内的可溶性糖含量增加密切相关，同时可溶性糖含量的增加也使产品的甜度提高，口感改善。

低温下羽衣甘蓝细胞中花青素的积累使叶片呈现不同颜色。花青素是重要的黄酮类化合物，具有很强的抗氧化活性，能够减轻环境逆境对植株生长的伤害。同时花青素也具有非常重要的医疗保健功能，是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂；此外，花青素还是一种安全、无毒的天然食用色素。因此，花青素在园艺、医药、化妆、食品等方面具有应用潜力和研究价值。羽衣甘蓝也含有较高的叶黄素，它也是一种优良抗氧化剂，能延缓眼睛的老化及防止病变，对于避免夜盲症、视力衰退、近视、视网膜病变等有重要的作用。此外，研究表明，羽衣甘蓝还含有较丰富的硫代葡萄糖苷，其经黑芥子酶水解而形成的萝卜硫素具有显著的抗癌活力，以及抗氧化能力，是目前公认的具有防癌、抗癌的天然产物之一。

针对观光休闲农业，开展新种质创制，新品种培育，新技术研发，新创意设计，以及功能上的多样化开发具有重要的产业意义。

因此，利用结球甘蓝的结球性，观赏甘蓝的彩色叶片特性，通过有性杂交，实现相关性状控制基因的重组交换并获得纯系，是有可能快速创制出彩色结球甘蓝新种质，培育出彩色结球甘蓝新品种的；但是目前国内外均未见有相关报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何利用结球甘蓝和观赏甘蓝作为亲本，快速地培育得到彩色结球甘蓝新品种。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种彩色结球甘蓝新种质的培育方法，所述培育方法的亲本为：结球甘蓝和观赏甘蓝。

作为优选的实施方式，父本为结球甘蓝，母本为观赏甘蓝；或：母本为结球甘蓝，父本为观赏甘蓝；优选地，所述观赏甘蓝为羽衣甘蓝；更优选地，所述父本的基因型为ggsshh，所述母本的基因型为rrcchh，或：所述父本的基因型为rrsshh，所述母本的基因型为ggsshh。

作为优选的实施方式，所述培育方法包括以下步骤：

f1代获取步骤：选取亲本，通过人工辅助授粉，获得杂种f1代种子；f1代植株培养步骤：将所述杂种f1代种子培养得到f1代植株；小孢子培养步骤：取所述f1代植株进行小孢子培养，得到再生植株；双单倍体纯系培养步骤：将上述再生植株进行自交授粉，得到双单倍体纯系；田间筛选步骤：将所述双单倍体纯系进行田间筛选，得到所述彩色结球甘蓝新种质。

作为优选的实施方式，所述f1代植株培养步骤、所述田间筛选步骤中，甘蓝的结球显色期采用的栽培参数为：日间温度为20-25℃，夜间温度为5-10℃；优选地，所述日间温度为20℃，所述夜间温度为10℃。

作为优选的实施方式，所述小孢子培养步骤中，所述小孢子培养包括以下步骤：

胚状体诱导步骤：将小孢子置于胚状体诱导培养基进行胚状体诱导处理，得到待分化胚状体；分化培养步骤：将所述待分化胚状体置于分化培养基进行分化培养处理，得到分化苗；生根培养步骤：将所述分化苗置于生根培养基进行生根培养处理，得到再生植株。

作为优选的实施方式，所述胚状体诱导处理中，先进行高温胁迫处理，再进行黑暗培养处理，再进行光照培养处理；优选地，所述高温胁迫处理的温度为30-35℃，时间为24-72h；优选地，所述黑暗培养处理的温度为24-26℃，至形成鱼雷期至子叶期胚状体；优选地，所述光照处理的温度为24-26℃，光照强度为1500-2500lux，时间为14-18h/d；优选地，所述分化培养处理中，温度为24-26℃，光照强度为1500-2500lux，时间为14-18h/d；优选地，所述生根培养中，温度为24-26℃，光照强度为1500-2500lux，光照时间为14-18h/d。

作为优选的实施方式，所述培育方法包括以下步骤：

f1代获取步骤：选取亲本，通过人工辅助授粉，获得杂种f1代种子；f1代植株培养步骤：将所述杂种f1代种子培养得到f1代植株；后续世代培养步骤：在所述f1代植株中选取生长健壮的植株自交留种，获得f2代种子群体，将所述f2代种子群体培养获得f2代植株；在所述f2代植株中针对目的表型选取植株，再经过连续n代自交后，获得fn代植株作为所述新种质；优选地，所述n为大于等于6，更优选为6-10。

作为优选的实施方式，所述f1代植株培养步骤、所述后续世代培养步骤中，甘蓝的结球显色期采用的栽培参数为：日间温度为20-25℃，夜间温度为5-10℃；优选地，所述日间温度为20℃，所述夜间温度为10℃。

所述培育方法得到的新种质的特征包括：

所述新种质的特征为：叶型为圆叶、波浪叶、皱叶之一；或：叶色为紫色、红色、粉色、淡黄、白色之一；或：叶球形态为紧实或半紧实，叶球重为0.5-1.0kg；或：可耐0℃～零下5℃冷害；或：可溶性总糖的含量为1.5-4.0g/100g鲜重，优选为1.8-3.5g/100g鲜重；或：原花青素的含量为10-250mg/100g鲜重，优选为60-220mg/100g鲜重；或：总黄酮含量为150-450mg/100g鲜重，优选为250-400mg/100g鲜重；或：维生素c的含量为15.0-25.0mg/100g鲜重，优选为17.0-23.0mg/100g鲜重；或：叶黄素的含量为2.3-8.5mg/100g鲜重，优选为4.4-7.5mg/100g鲜重；或：总蛋白含量为2.2-4.2g/100g鲜重，优选为2.5-4.0g/100g鲜重。

本发明的有益效果为：

1、本发明首次通过甘蓝种不同变种之间的杂交，创制出彩色结球甘蓝新种质。本发明在育种种质的选择上，选用观赏性及耐寒性强的羽衣甘蓝，以及口感较甜嫩，较适宜生食且结球性及球型较好的结球甘蓝为亲本材料，因此培育出的彩色结球甘蓝具有颜色种类丰富、色泽亮丽，观赏性强，耐寒性强，且食用品质好，口感较甜、脆，适宜生食，且具有较好结球性的特点。

2、本发明利用游离小孢子培养技术，快速纯化目的材料，并获得更多的双单倍体纯系(dh系)新种质，包括双隐形基因控制性状种质。小孢子为未成熟花粉细胞(n＝9)，在形成过程中，经历了植物有性生殖的减数分裂过程，只包含了经重组交换后的一套染色体，采用适宜的离体细胞培养技术，可以获得染色体自然加倍了的双单倍体再生植株(doublehaploidplant,dh株)，由于染色体等位位点完全纯合，所以隐性基因也能全部表达。这样就可以在1-2年内快速获得表型非常丰富、基因组完全纯合的dh纯系。在dh系中挑选田间性状表现彩色叶及结球性较好的材料即可作为目标育种亲本材料。而且，本发明在小孢子培养步骤中采用合理的参数，进一步提高了再生效率。

3、本发明也可以通过对f1自交后代的田间性状逐代选择，在6-8年内获得表现彩色叶色及结球性较好的相对纯合材料作为目标育种亲本材料。

4、本发明根据羽衣甘蓝的叶色变化显著受环境温度调控，依据叶色变化及叶球形成的生理规律，定位了彩色结球甘蓝的最佳栽培技术参数，保证了创新种质的种性表现及正确应用。通过多年对羽衣甘蓝生长及叶色变化规律的研究，得出了可以用于指导高品质彩色结球甘蓝栽培的技术参数：在日/夜温为20℃/10℃的生长环境中，彩色结球甘蓝的颜色及结球性最佳。更广泛的适宜栽培条件可以是：日/夜温为25℃/5℃。在上述温度条件下，彩色结球甘蓝不同品种的叶片呈现紫色、红色、粉色、淡黄、白色等颜色。

5、本发明培育出的创新种质兼顾口感、美感、产量、抗冻性，为蔬菜市场和都市农业提供了新材料。

6、本发明的优点在于：(1)杂交特征：两个变种间的杂交；(2)材料创制手段：有效结合常规育种与细胞培养技术；(3)材料选择、定性手段：结合适宜栽培条件下的观赏性、食用性评价及室内品质成份检测手段。

附图说明

图1为实施例1的父本、母本、f1代杂种植株的照片。

图2为实施例1的待分化胚状体的照片。

图3为实施例1的部份再生植株当代的性状表现的照片。

图4为实施例1的新种质的照片。

图5为实施例2的父本、母本、f1代杂种植株的照片。

图6为实施例2的待分化胚状体的照片。

图7为实施例2的部份再生植株当代的性状表现的照片。

图8为实施例2的新种质的照片。

具体实施方式

本发明提供一种彩色结球甘蓝新种质的培育方法。

上述培育方法所选择的亲本为：结球甘蓝和观赏甘蓝。其中，可以父本为结球甘蓝，母本为观赏甘蓝；也可以：母本为结球甘蓝，父本为观赏甘蓝。上述观赏甘蓝为羽衣甘蓝；优选地，上述结球甘蓝为口感品质及结球性良好的自交系，上述羽衣甘蓝的叶型包括圆叶、皱叶、羽叶三种类型，叶色包括紫色、红色、粉色、淡黄、白色等多种颜色类型，可以采用帝王红、红舞、红鹰、红鸥等品种。上述父本及(或)母本具有良好的小孢子培养胚状体诱导能力。作为优选的实施方式，父本的基因型为ggsshh，母本的基因型为rrcchh；或：父本的基因型为rrsshh，母本的基因型为ggsshh。

本发明的技术方案的发明构思如下：

1、本发明选择上述亲本的原因为：

(1)从实施的可能性看，羽衣甘蓝与结球甘蓝为甘蓝种的两个变种，不存在生殖隔离，杂交亲和。

(2)从实施的有效性看，羽衣甘蓝与结球甘蓝性状差异大，但又有互补性，比如羽衣甘蓝红色，结球甘蓝绿色；羽衣甘蓝皱叶，结球甘蓝圆叶；羽衣甘蓝不结球，结球甘蓝结球紧实。

(3)从遗传上看，上述性状都是由基因控制的可遗传性状。这样双亲染色体在有性杂交过程中，同源染色体配对，染色体上的同源或部分同源dna区域发生重组交换，从而形成多种基因型的配子体(花粉或大孢子)，产生性状丰富的杂种后代，为性状选择及新材料的创制提供了遗传基础。

目前，国内外尚未有利用羽衣甘蓝及结球甘蓝两个变种之间的杂交创制新种质的研究。

2、本发明中，明确了羽衣甘蓝及结球甘蓝双亲在叶色、叶型、结球性上的遗传控制机制。

(1)羽衣甘蓝种质资源中具有深浅程度不同的红色至白色叶色类型，受基因组中黄酮类次生代谢物合成途径基因调控，其中导致红色的为花青素合成调控基因。红色对白色，红色对绿色为显性性状，受一主效上位基因控制。白色对绿色也受一主效上位基因控制。

(2)羽叶对皱叶，羽叶对圆叶，皱叶对圆叶均分别为主效基因控制的显性性状。

(3)结球甘蓝的结球性受具有加性-显性效应的多基因控制。

因此，本发明可以从创新种质纯系中针对品种培育目标选择双亲父母本材料，配制杂交组合。

3、具体而言，本发明利用羽衣甘蓝与结球甘蓝的杂交及杂种的自交，实现双亲基因组的相会，染色体的重组和交换，获得原始创新种质。

(1)羽衣甘蓝与结球甘蓝为甘蓝种的两个变种，杂交亲和。红色羽衣甘蓝与绿色结球甘蓝杂交后，f1(cc，2n＝18)表现为红色半结球类型。

(2)f1的基因组中来自双亲的叶色控制基因及结球性控制基因相聚。在减数分裂过程中，同源染色体发生重组和交换，产生类型丰富的配子体(花粉及大孢子，n＝9)，为下一步获得结合了彩色及结球性的目的材料提供了遗传基础。

(3)可以分别通过对f1杂种的自交后代(f2-f6)选育，或者利用f1的配子体(花粉及大孢子，n＝9)细胞培养，获得不同色彩，且结球性程度不同的创新种质。

4、本发明采用小孢子培养是因为：

(1)要获得性状整齐一致的f1杂种，需要双亲遗传背景纯合，而甘蓝类作物为二年生，通过自交选育获得纯系需要8-10年时间。

(2)小孢子(未成熟花粉)细胞为减数分裂后形成的配子体细胞，含单套染色体，而且已经完成了同源染色体的重组和交换。通过小孢子细胞培养，有可能在离体条件下，快速获得染色体加倍了的纯合双单倍体植株，为新材料的创制及快速纯合提供了技术基础。

(3)因此，利用结球甘蓝的结球性，观赏甘蓝的彩色叶片特性，通过有性杂交，实现相关性状控制基因的重组交换，再通过小孢子培养获得纯系，是有可能快速创制出彩色结球甘蓝新种质，培育出彩色结球甘蓝新品种的。该新品种的创制技术国内外均未见有相关报道。

5、本发明的主要贡献是：利用双亲/或双亲一方具有良好小孢子培养胚状体诱导能力，使其杂种f1具有更好的dh植株生产能力，从而能从较大群体(100个dh单株左右/f1)中筛选获得不同叶色、叶型、结球性的目的材料，实现通过变种间杂交有效获得创新种质。

总之，为了培育出多彩且可口的耐寒结球甘蓝新品种，依据发明人课题组对所选材料叶色及结球性性状遗传控制机制的认识，对植物减数分裂过程中染色体重组交换机制的了解，以及对所选材料耐寒生理生化机制的研究结果，发明人课题组发明了一种创制彩色结球甘蓝新种质的技术。利用该技术，可以在较短时期内快速获得多种色彩的结球甘蓝，这些材料具有叶色、叶型丰富，观赏性强，口感好，叶球大小适中，耐寒性强的特点，填补了国际上这类种质的空白，也为类似种质的创新提供了有效技术手段。

本发明的培育方法优选采用小孢子培养技术，包括以下步骤：

步骤一、f1代获取：选取亲本，通过人工辅助授粉，获得杂种f1代种子。

步骤二、f1代植株培养：将上述杂种f1代种子培养得到f1代植株。在培养过程中，在甘蓝的结球显色期采用的参数为：日间温度为20-25℃(例如，可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃中任意值或任意二者之间的范围)，夜间温度为5-10℃(例如，可以为5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃中任意值或任意二者之间的范围)；优选地，日间温度为20℃，夜间温度为10℃。

步骤三、小孢子培养：取上述f1代植株进行小孢子培养，得到再生植株；本步骤又包括分步骤一至三。

分步骤一、胚状体诱导：将小孢子置于胚状体诱导培养基进行胚状体诱导处理，得到待分化胚状体。

上述胚状体诱导处理中，小孢子在上述诱导培养基中的终浓度为10000-100000个/ml，先进行高温胁迫处理：温度为30-35℃，时间为24-72h；再进行黑暗培养处理：温度为24-26℃，至形成鱼雷期至子叶期胚状体；再进行光照培养处理：温度为24-26℃，光照强度为1500-2500lux，时间为14-18h/d。

分步骤二、分化培养：将上述待分化胚状体置于分化培养基进行分化培养处理：温度为24-26℃，光照强度为1500-2500lux，时间为14-18h/d；得到分化苗。

分步骤三、生根培养：将上述分化苗置于生根培养基进行生根培养处理：温度为24-26℃，光照强度为1500-2500lux，光照时间为14-18h/d；得到再生植株。

上述小孢子的获取方法优选以下操作：

优选在每年的3-5月，采集供体母株(生长于带有塑料大棚的防虫网中)的花蕾；通过细胞核的dapi荧光染色和显微镜捡，确定小孢子的发育时期，取含70％单核靠边期小孢子细跑和30％双核期小孢子细胞的花蕾，将花蕾用体积比为2.5％的次氯酸钠溶液表面灭菌15分钟，无菌水清洗3次，用杵棒挤压法在b5培养液中释放出游离小孢子，再经50μm孔径尼龙网过滤悬浮液，1000rpm离心5分钟，弃上清，以b5培养液重新悬浮沉淀，再重复清洗2次后，置于胚状体诱导培养基中。

上述诱导培养基包括：kno3：100-150mg，ca(no3)2·4h2o：450-550mg，mgso4·7h2o：100-150mg，kh2po4：100-150mg，feso4·7h2o：27.5-28mg，edta·na2：37-37.5mg，ki：0.8-0.85mg，cocl2·6h2o：0.02-0.03mg，h3bo3：6-6.5mg，na2moo4·2h2o：0.2-0.3mg，mnso4·4h2o：22-22.5mg，cuso4·5h2o：0.02-0.03mg，znso4·7h2o：8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸4-6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.4-0.6mg，甘氨酸1.8-2.2mg，叶酸0.4-0.6mg，生物素0.04-0.06mg，谷氨酰胺700-900mg，丝氨酸80-120mg，谷胱甘肽25-35mg，6-苄基腺嘌呤0.8-1.2mg，蔗糖100-150g，活性炭0.10-0.30g，用水定容至1l，ph：5.8-5.9。

上述分化培养基包括：nh4no3：1600-1700mg，kno3：1850-1950mg，cacl2·2h2o400-480mg，mgso4·7h2o：350-400mg，kh2po4：150-200mg，feso4·7h2o：27.5-28mg，edta·na2：37-37.5mg，ki：0.8-0.85mg，cocl2·6h2o：0.02-0.03mg，h3bo3：6-6.5mg，na2moo4·2h2o：0.2-0.3mg，mnso4·4h2o：22-22.5mg，cuso4·5h2o：0.02-0.03mg，znso4·7h2o：8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖25-35g，琼脂8-12g，用水定容至1l，ph：5.8-5.9。

上述生根培养基包括：nh4no3：800-850mg，kno3：900-1000mg，cacl2·2h2o：200-240mg，mgso4·7h2o：175-200mg，kh2po4：75-100mg，feso4·7h2o：27.5-28mg，edta·na2：37-37.5mg，ki：0.8-0.85mg，cocl2·6h2o：0.02-0.03mg，h3bo3：6-6.5mg，na2moo4·2h2o：0.2-0.3mg，mnso4·4h2o：22-22.5mg，cuso4·5h2o：0.02-0.03mg，znso4·7h2o：8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖10-20g，琼脂8-10g，用水定容至1l，ph：5.8-5.9。

上述培育方法利用游离小孢子培养技术，快速纯化目的材料，并获得更多的双单倍体纯系(dh系)新种质，包括双隐形基因控制性状种质。小孢子为未成熟花粉细胞(n＝9)，在形成过程中，经历了植物有性生殖的减数分裂过程，只包含了经重组交换后的一套染色体，采用适宜的离体细胞培养技术，可以获得染色体自然加倍了的双单倍体再生植株(doublehaploidplant，dh株)，由于染色体等位位点完全纯合，所以隐性基因也能全部表达。这样就可以在1-2年内快速获得表型非常丰富、基因组完全纯合的dh纯系。在dh系中挑选田间性状表现彩色叶及结球性较好的材料即可作为目标育种亲本材料。

步骤四、田间筛选：

将上述再生植株进行田间筛选，得到上述彩色结球甘蓝新种质。该田间筛选的培养过程中，在甘蓝的结球显色期采用的环境参数为：日间温度为20-25℃，夜间温度为5-10℃；优选地，日间温度为20℃，夜间温度为10℃。

上述结球显色期指的是：甘蓝的生长过程中结球并显色的时期。该时期的起始时间为：比现有的常规品种的甘蓝的“结球期”的开始时间早5天；该时期的终止时间为：比现有的常规品种的甘蓝的“结球期”的结束时间晚15天。

由于叶片颜色及结球性都与植株生长的环境温度有关，而再生植株(dh植株)当代由于是组培苗，其生长发育受出瓶苗田间定植时间的影响，性状表现不充份，因此应在第二年进一步对每一个再生单株的自交后代进行适期播种下的性状表现调查，才能选出具足够目标性状典型性的优良dh系。

本发明的培育方法也可以采用田间性状逐代选择技术，包括以下步骤：

f1代获取步骤：选取亲本，通过人工辅助授粉，获得杂种f1代种子；

f1代植株培养步骤：将上述杂种f1代种子培养得到f1代植株；由于亲本采用的是纯系，所以f1代植株性状整齐一致。

后续世代培养步骤：选取生长健壮的所述f1代植株2-3株自交留种，获得f2代种子群体，进一步培育获得f2代植株；f2代各单株性状分离，针对目的表型，在f2代植株中选择单株，经过连续n代的自交-选择-自交循环后，获得fn代植株作为所述新种质；其中，n为大于等于6，更优选为6-10。

上述f1代植株培养步骤、后续世代培养步骤中，甘蓝的结球显色期采用的栽培参数为：日间温度为20-25℃，夜间温度为5-10℃；优选地，所述日间温度为20℃，所述夜间温度为10℃。

采用上述培养方法所获得的彩色结球甘蓝新种质的特征包括：

叶型为圆叶、波浪叶、皱叶之一；叶色为紫色、红色、粉色、淡黄色、白色之一；

叶球形态为紧实或半紧实，叶球重为0.5-1.0kg；

可耐0℃～零下5℃冷害；

营养成份及口感品质更好，具体表现在大部份株系的营养成份表现超亲优势，口感较甜脆。代表性指标为：(1)可溶性总糖的含量为1.5-4.0g/100g鲜重，优选为1.8-3.5g/100g鲜重；(2)原花青素的含量为10-250mg/100g鲜重，优选为60-220mg/100g鲜重；(3)总黄酮含量为150-450mg/100g鲜重，优选为250-400mg/100g鲜重；(4)维生素c的含量为15.0-25.0mg/100g鲜重，优选为17.0-23.0mg/100g鲜重；(5)叶黄素的含量为2.3-8.5mg/100g鲜重，优选为4.4-7.5mg/100g鲜重；(6)总蛋白含量为2.2-4.2g/100g鲜重，优选为2.5-4.0g/100g鲜重。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例采用小孢子培养来获得彩色结球甘蓝新种质。

(1)亲本选取：如图1所示，母本：羽衣甘蓝红色皱叶类型自交系07-dh-33，为发明人课题组自羽衣甘蓝品种帝王红(f1,购自农友种苗公司)中培养得到的dh纯系的自交后代，前期研究表明，其具有良好的小孢子培养胚状体诱导能力；其表型特征为：红色(rr,red)皱叶(cc,curly)散叶(hh)类型自交系(基因型rrcchh)。父本：结球甘蓝口感品质及结球性良好的高代自交系15-10，分离自中甘21(f1商品种，中蔬种业科技(北京)有限公司)，特征为：绿色(gg，green)全缘叶(ss，smooth)，口感品质及结球性(hh,head)良好的自交系(基因型ggsshh)。

(2)获取f1代植株：通过人工辅助授粉，获得杂种f1代种子；再将该杂种f1代种子栽培得到f1代杂种植株；该栽培过程中，甘蓝结球显色期时，甘蓝处于日/夜温为25℃/5℃的生长环境中。由于红色(rr)对绿色(gg)表现为显性，皱叶(cc)对全缘叶(ss)表现为显性，结球性表现为受具有加性-显性效应的多基因控制，f1杂种植株将表现为红色波浪叶，半结球类型(基因型rgcshh)。

(3)获取小孢子：优选在每年的3-6月，采集供体母株(即上述f1杂种植株，生长于带有塑料大棚的防虫网中)的花蕾；通过细胞核的dapi荧光染色和显微镜捡，确定小孢子的发育时期，取含70％单核靠边期小孢子细跑和30％双核期小孢子细胞的花蕾，将花蕾用体积比为2.5％的次氯酸钠溶液表面灭菌15分钟，无菌水清洗3次，用杵棒挤压法在b5培养液中释放出游离小孢子，再经50μm孔径尼龙网过滤悬浮液，1000rpm离心5分钟，弃上清，以b5培养液重新悬浮沉淀，再重复清洗2次后，置于胚状体诱导培养基中。(4)胚状体诱导：将终浓度为10000个/ml的小孢子置于胚状体诱导培养基，先进行高温胁迫处理：温度为33℃，时间为24h；再进行黑暗培养处理：温度为25℃，至形成鱼雷期至子叶期胚状体；再进行光照培养处理：温度为25℃，光照强度为2000lux，光照时间为16h/d，共7d；得到待分化胚状体。

图2中，a图为本实施例双亲之一具有良好的小孢子培养能力的f1杂种诱导形成的待分化胚状体。(5)分化培养：上述待分化胚状体置于分化培养基进行分化培养处理：温度为25℃，光照强度为2000lux，光照时间为16h/d；得到分化苗。

(6)生根培养：将上述分化苗置于生根培养基进行生根培养处理：温度为25℃，光照强度为2000lux，光照时间为16h/d；得到再生植株。

上述诱导培养基包括：kno3：125mg，ca(no3)2·4h2o：500mg，mgso4·7h2o：125mg，kh2po4：1250mg，feso4·7h2o：27.8mg，edta·na2：37.3mg，ki：0.83mg，cocl2·6h2o：0.025mg，h3bo3：6.2mg，na2moo4·2h2o：0.25mg，mnso4·4h2o：22.3mg，cuso4·5h2o：0.025mg，znso4·7h2o：8.6mg，肌醇100mg，烟酸5mg，吡哆醇0.5mg，硫胺素0.5mg，甘氨酸2.0mg，叶酸0.5mg，生物素0.05mg，谷氨酰胺800mg，丝氨酸100mg，谷胱甘肽30mg，6-苄基腺嘌呤1.0mg，蔗糖130g，活性炭0.20g，用水定容至1l，ph：5.9；过滤灭菌。

上述分化培养基包括：nh4no3：1650mg，kno3：1900mg，cacl2·2h2o：440mg，mgso4·7h2o：370mg，kh2po4：170mg，feso4·7h2o：27.8mg，edta·na2：37.3mg，ki：0.83mg，cocl2·6h2o：0.025mg，h3bo3：6.2mg，na2moo4·2h2o：0.25mg，mnso4·4h2o：22.3mg，cuso4·5h2o：0.025mg，znso4·7h2o：8.6mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，吡哆醇0.5mg，硫胺素0.10mg，甘氨酸2.0mg，蔗糖30g，琼脂10g，用水定容至1l，ph：5.8；高压灭菌。

上述生根培养基包括：nh4no3：825mg，kno3：950mg，cacl2·2h2o：220mg，mgso4·7h2o：185mg，kh2po4：85mg，feso4·7h2o：27.8mg，edta·na2：37.3mg，ki：0.83mg，cocl2·6h2o：0.025mg，h3bo3：6.2mg，na2moo4·2h2o：0.25mg，mnso4·4h2o：22.3mg，cuso4·5h2o：0.025mg，znso4·7h2o：8.6mg，肌醇100mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.5mg，硫胺素0.10mg，甘氨酸2.0mg，蔗糖15g，琼脂8g，用水定容至1l，ph：5.9；高压灭菌。

(7)获得双单倍体纯系：将上述再生植株出瓶过渡后，于9月底左右定植于日光温室，冬季考察其显色及结球情况(图3)，春季考察开花结籽情况(也是染色体倍性考察)，自交授粉，收获种子获得双单倍体纯系(dh系)。

植物的小孢子细胞培养胚状体形成及植株再生能力受遗传基因控制，由于本实施例中在起始亲本选择上，注意选用单亲或双亲具有较好小孢子细胞离体胚状体形成能力的材料，因此f1杂种的幼嫩花粉培养具有高效的dh植株获得能力(比常规材料dh植株生产能力高出4-6倍)，产生了数目众多，表型多样的dhs群体，每一dh单株具有特异遗传背景，且完全纯合。

图3为本实施例的部份dh单株(dh1-8)当代的性状表现。可见，由于f1植株在配子体形成前发生的双亲染色体的重组交换，在小孢子再生株中，出现了许多双亲没有的表型，如红色结球类型，白色结球类型，粉色抱球类型等等，叶型上也出现了皱叶、波浪叶、圆叶多种类型。其中白色、圆叶类型为双隐性性状表现，也只有在dh材料中，才能一次性获得该类型材料。

(8)田间筛选新种质：将上述双单倍体纯系(dh系)自交后代种子于第二年8月初播种，9月中旬前定植于北京地区塑料大棚或不加温日光温室，常规管理；结球显色期中，日/夜温为20℃/10℃。11月中旬至12月中旬调查叶色及结球性情况，筛选获得叶型美观、叶色艳丽、结球性较好的优良dhs系dh1-dh6，即为本实施例得到的新种质(图4)。图4中dh-1即为图3中dh-7，可见dh系的性状遗传稳定。

优选出来的彩色结球甘蓝dhs系dh1-dh6的类型及特征：

叶型：圆叶、波浪叶、皱叶；

叶色：红色、粉色、白色；

叶球：紧实或半紧实，叶球重为0.5-1.0公斤。

食用品质：品尝显示，叶片质地较柔嫩，口感较甜，适宜生食或炒食。

营养成份：检测显示，本实施例得到的彩色结球甘蓝富含花青素(按照ny/t2640-2014检测)、叶黄素(按照gb5009.248-2016检测)等生物活性物质，其总蛋白(按照gb5009.5-2016检测)总黄酮(按照db43/t476-2009检测)、可溶性总糖(按照ny/t1278-2007检测)的含量都高于双亲或单亲。

抗逆性；田间实地栽培结果表明，彩色结球甘蓝抗寒性强，能耐0℃～零下5℃冷害。

dh1-dh6材料的性状如下：

dh-1:圆叶，球叶叶缘略皱，叶色深紫红色。叶球重1.0公斤。耐-5℃冻害。

dh-2：圆叶，球叶叶缘具大波浪，叶色红粉。叶球重0.5公斤。耐-3℃冻害。

dh-3：圆叶，球叶叶缘具显著褶皱，叶色粉红。叶球重0.7公斤。耐-3℃冻害。

dh-4：圆叶，球叶叶缘具大波浪，叶色白净。叶球重0.6公斤。耐0℃冷害。

dh-5：圆叶，球叶叶缘略有褶皱，叶色白(叶缘稍带绿色)。叶球重0.7公斤。耐0℃冷害。

dh-6：圆叶，球叶叶缘显著褶皱，叶色白绿。叶球重1.0公斤。耐0℃冷害。

dh1-dh6的营养成份含量参见表1：

dh1-dh6的总蛋白(g/100g鲜重)为：2.77-4.05，可溶性总糖(g/100g鲜重)为：1.8-3.5，总黄酮(mg/100g鲜重)为：250-350，vc(mg/100g鲜重)为：18.2-22.0，叶黄素(mg/100g鲜重)为：4.44-7.5，原花青素(mg/100g鲜重)为：11-220。

实施例2

本实施例采用小孢子培养来获得彩色结球甘蓝新种质。

(1)亲本选取：如图5所示，母本：结球甘蓝口感品质及结球性良好的自交系05-10，基因型ggsshh，分离自“中甘21”(中蔬种业科技(北京)有限公司)；父本：羽衣甘蓝红色圆叶类型自交系05-dh-51，基因型rrsshh，为本发明人课题组自羽衣甘蓝品种红鹰(f1,购自农友种苗公司)中培养得到的dh纯系的自交后代，前期研究表明，其具有良好的小孢子培养胚状体诱导能力。

(2)获取f1代植株：通过人工辅助授粉，获得杂种f1代种子；再将该杂种f1代种子栽培得到f1代杂种植株；该栽培过程中，甘蓝结球显色期时，甘蓝处于日/夜温为20℃/10℃的生长环境中。如图5所示，该f1杂种植株(基因型rgsshh)将表现为红色圆叶，半结球类型。

(3)获取小孢子：与实施例1的操作相同。

(4)胚状体诱导：与实施例1的操作相同，待分化胚状体(如图6所示)。

(5)分化培养：上与实施例1的操作相同。

(6)生根培养：与实施例1的操作相同。

(7)定植：与实施例1的操作相同。

(8)筛选新种质：与实施例1的操作相同，筛选获得全缘叶，但叶色表现为红色、粉色、淡黄、白色等的dhs系dh7-dh9，即为本实施例得到的新种质(图7)。再次证明了依据叶色、叶型控制基因的遗传规律进行彩色结球甘蓝种质创新的准确可靠性。

优选出来的彩色结球甘蓝dhs系示例材料性状如下：

dh-7：圆叶，球叶为全缘叶，叶色深紫红色，亮丽。叶球重0.8公斤。耐-5℃冻害。

dh-8：圆叶，球叶为全缘叶，叶色红粉。叶球重0.8公斤。耐-3℃冻害。

dh-9：圆叶，球叶为全缘叶，叶色淡黄。叶球重0.7公斤。耐0℃冷害。

dh7-dh9的营养成份含量参见表1：

dh7-dh9的总蛋白(g/100g鲜重)为：3.55-4.15，可溶性总糖(g/100g鲜重)为：2.1-3.1，总黄酮(mg/100g鲜重)为：270-390，vc(mg/100g鲜重)为：17.6-22.8，叶黄素(mg/100g鲜重)为：6.35-8.54，原花青素(mg/100g鲜重)为：18-240。

表1：彩色结球甘蓝新种质与双亲的营养成份测定

实施例1-2中筛选出来的新种质彩色结球甘蓝优良dhs系具有叶色丰富：红色、粉色、淡黄、白色；叶片质地较柔嫩；抗寒性强；口感较甜的特点，适宜生食或炒食。叶球重约0.5-1.0公斤；如图8所示，各dhs系内性状高度整齐一致，遗传稳定。

实施例3

本实施例采用传统育种方法来获得彩色结球甘蓝新种质。

(1)亲本选取：与实施例1相同。

(2)获取f1代植株：通过人工辅助授粉，获得杂种f1代种子；再将该杂种f1代种子在栽培得到f1代杂种植株。在该栽培过程中，甘蓝结球显色期时，甘蓝处于日/夜温为25℃/5℃的生长环境中。如图1所示，该f1杂种植株将表现为红色波浪叶，半结球类型。

(3)获取f2代植株：将上述f1代植株开花期选取健壮单株2-3株自交授粉，得到f2代种子，栽培得到材料表型性状表现充份的f2代植株；上述栽培中采用的参数为：日/夜温为20℃/10℃的生长环境中。

由于f1植株细胞中含有来自双亲的染色体，配子体形成前的染色体重组交换及分离，导致双亲控制叶型、叶色、结球性的基因发生重组、分离，从而在f2代中产生表型的多样性。

(4)获取f3代植株：在上述f2代植株中选择目的表型单株若干(一般为2-3株)，分别编号，继续单株自交留种获得f3代种子，栽培得到f3代植株。

(5)获取f4-f6代植株：在上述f3代植株中选择目的表型单株若干(一般为2-3株)，分别编号，继续单株自交留种获得f4代种子，栽培得到f4代植株；

再在上述f4代植株中选择目的表型单株若干(一般为2-3株)，分别编号，继续单株自交留种获得f5代种子，栽培得到f5代植株；

再在上述f5代植株中选择目的表型单株若干(一般为2-3株)，分别编号，继续单株自交留种获得f6代种子，栽培得到f6代植株。

该f6代植株即可作为杂种配制的亲本用于杂交育种。

步骤(2)-(5)中，甘蓝在结球显色期的温度为：日/夜温25℃/5℃。

甘蓝类作物为常异花授粉植物，要得到遗传背景相对较纯的材料需要连续自交6代以上，这样获得的f6代植株至按照相同方法得到的f10代植株才能作为杂种配制的亲本(即新种质)用于杂交育种。上述f10代之后的后续世代的获得方法相同。

对比例1

本对比例的其他12个试验组采用的亲本、操作方式均与实施例1基本相同，区别在于：在步骤(2)获取f1代植株中，采用的日/夜温度。详见下表：

表2：f1代的彩色结球甘蓝呈色与环境温度的关系

对比例2本对比例中，步骤(1)中选取的亲本为市场上普通品种的羽衣甘蓝或结球甘蓝，参照实施例1的步骤(2)的操作，得到常规f1杂种；再参照实施例1的步骤(3)、(4)的操作得到胚状体，如图2的b图所示；由此可见，采用实施例1的07-dh-33(市场品种“帝王红”中获得的dh株系)、中甘21作为亲本，得到的胚状体的质量明显较好。所以，选择具有较好的细胞培养能力的亲本则更有利于自f1植株的小孢子获得数量更多、质量更好的胚状体。