一种基于水源消毒的香蕉健康种植体系的制作方法

本发明属于农业种植领域，涉及一种基于水源消毒的香蕉健康种植体系。

背景技术：

香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由尖孢镰刀菌侵染而引起维管束坏死的一种毁灭性的真菌病害，几乎遍布世界上所有的香蕉产区，是世界范围内分布最广、危害最严重的植物病害之一。近年来该病在我国主产区持续爆发并不断扩大，发病率为10％-40％，严重的地区可高达90％以上。在我国，大部分香蕉种植区实行连作，种植模式单一，加上对土传病害处理不当，造成土壤微生物生态系统破坏，香蕉枯萎病发生加剧，严重威胁了我国香蕉产业的可持续发展。香蕉枯萎病病原菌的传播是造成香蕉枯萎病蔓延的重要原因，病菌残体、病土、农具、雨水、线虫、带病菌的吸芽、土壤及二级苗等均可导致病原菌的传播，其中含病原菌水源是造成其大规模传播的重要途径。目前，针对香蕉枯萎病的防控措施有检疫、栽培管理、化学防控和生物防控，其中生物防控环保、安全、经济，成为当前的热门研究课题，但是这些物理、化学和生物的防治措施都没有从传播途径入手。然而，目前国内外从传播途径上进行控制从而防控香蕉枯萎病的研究较少，因此，研究基于传播途径的香蕉枯萎病防控措施具有创新性的意义。有研究表明，熏蒸剂熏蒸土壤能有效防治土传病害，但熏蒸剂用于灌溉水源的消毒鲜有报道。

本发明专利从切断灌溉水中的病原菌入侵着手，建立了基于水源消毒的香蕉健康种植体系，具有创新性的意义，为枯萎病的防控提供新的思路和方法，提高香蕉枯萎病的防治效果。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于水源消毒的香蕉健康种植体系。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种基于水源消毒的香蕉健康种植体系：使用消毒剂对含有香蕉枯萎病病原菌的水源进行消毒处理，在香蕉种植过程中定期使用消毒处理的水源进行灌溉，从而达到香蕉健康种植的目的。

本发明所述的基于水源消毒的香蕉健康种植体系，优选使用次氯酸钠、双氧水或氨水对含有香蕉枯萎病病原菌的水源进行消毒处理。

本发明所述的基于水源消毒的香蕉健康种植体系，优选使用1000倍稀释的双氧水或500倍稀释的氨水对含有香蕉枯萎病病原菌的水源进行消毒处理。

本发明所述的基于水源消毒的香蕉健康种植体系，进一步优选通过向含病原菌灌溉水源使用稀释4000倍的次氯酸钠进行消毒处理。

本发明所述的基于水源消毒的香蕉健康种植体系，更进一步优选将含病原菌水源首先采用水库囤积，然后按照4000倍的稀释浓度，将次氯酸钠加入含病原菌水源，24小时后，取样检测，确保水中病原菌数量低于10cfu/ml。

其中所用的次氯酸钠为分析纯，活性氯含量不小于5％。

本发明所述的基于水源消毒的香蕉健康种植体系中香蕉种植土壤为未种植过香蕉的草地土壤，或为多年连续种植香蕉的发病土壤。

本发明所述的基于水源消毒的香蕉健康种植体系在防治香蕉枯萎病和/或促进香蕉植株健康种植中的应用。

有益效果：

本发明对香蕉灌溉水源进行消毒处理，以简单的操作，低廉的成本，切断了病原菌的传播，确保了香蕉种植过程中无外源病原菌的入侵，降低土壤、根际和根内病原菌数量，改善并稳定了土壤微生物群落结构，从而促进香蕉苗期健康生长，显著改善了香蕉植株的茎粗、地上部鲜重及干重、地下部鲜重状况，同时也促进了植株株高、茎粗、叶面积、生物量的增加。

基于水源消毒的香蕉健康种植体系，对香蕉苗期生长具有促进作用，减少了尖孢镰刀菌的数量，减缓了香蕉枯萎病的发生，促进香蕉健康种植。

附图说明

图1灌溉消毒后水源对土体、根际及香蕉根内尖孢镰刀菌数量的影响

图2灌溉消毒后水源对香蕉土体和根际可培养细菌数量的影响

图3灌溉消毒后水源对香蕉土体和根际可培养真菌数量的影响

图4灌溉消毒后水源对香蕉土体和根际土壤细菌和真菌数量比值的影响

图5灌溉消毒后水源对香蕉根际土壤和根内芽孢杆菌的影响

图6可培养微生物群落主成分分析

图7可培养微生物间斯皮尔曼相关性分析

具体实施方案

实施例1含病原菌水源的制备

根据稀释涂布平板计数法测定得出蕉园附近灌溉水源中病原菌的数量为1.6ⅹ10⁴cfu/ml，人工配置含相同数量病原菌水源。将香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌(foc)接种于pda培养基，28℃黑暗中培养十天，待有孢子产生时，每个平板加入无菌水5ml，用刮铲将孢子悬浮到无菌水中，于显微镜下用血球计数板计数后，稀释成蕉园附近含有相同数量病原菌的灌溉水源；其中所用的pda培养基配制方法为，以配制1l培养基为例：土豆200g，蔗糖20g，琼脂15g,蒸馏水补足至1000ml，ph自然，121℃灭菌20min。

实施例2灌溉水源消毒剂的选择与消毒灌溉水源制备

将次氯酸钠(分析纯，活性氯含量不小于5％，购自上海久亿化学试剂有限公司)、过氧化氢、氨水三种液态熏蒸剂分别稀释至100倍(100×)、500倍(500×)、1000倍(1000×)、2000倍(2000×)和4000倍(4000×)，将5种浓度的消毒剂工作液与灌溉水按照1:9的比例混合于三角瓶中，28℃静置培养24h，采用稀释涂布平板计数法计数消毒前后灌溉水中病原菌数量，以未添加消毒剂为对照。病原菌的相对消毒率计算公式为：病原菌的相对消毒率＝(对照处理的病原菌数量-消毒处理的病原菌数量)/对照处理病原菌的数量×100％。根据消毒剂消毒效果选择合适消毒剂浓度制备的消毒灌溉水备用。其中，次氯酸钠继续稀释至5000倍(5000×)、6000倍(6000×)进行实验，验证其消毒效果。同时，在稀释至4000倍(4000×)的次氯酸钠消毒后的水源中添加相同浓度的含病原菌水源，28℃静置培养24h后进行稀释涂布，验证二次消毒作用。结果表明，不同消毒剂对灌溉水中的病原菌均有抑制作用，不同消毒剂母液稀释500倍后，对灌溉水中病原菌消毒率均为100％。随着稀释倍数的增加，过氧化氢和氨水的消毒效果明显下降。母液稀释4000倍时，次氯酸钠仍具有100％的消毒率，而过氧化氢和氨水对病原菌的消毒效果均显著下降，将次氯酸钠继续稀释至5000倍和6000倍时，均不能完全杀灭病原菌。稀释4000倍的次氯酸钠具有最佳的消毒效果，因此本研究选用稀释4000倍的次氯酸钠消毒液对含有病原菌的水源进行消毒处理，制备消毒水源(见表1)。另，继续向稀释4000倍的次氯酸钠消毒后的水源中添加相同浓度的病原菌的实验结果显示，消毒后的水源对病原菌不再具有消毒效果。

表1不同消毒剂对水中病原菌的消毒效果

注：naclo：次氯酸钠；h2o2：过氧化氢；a：氨水；rff％：病原菌相对消毒率。

实施例3基于水源消毒的香蕉健康种植体系

3.1盆栽试验设计

盆栽试验于3月15日到5月15日在实验室的人工气候箱中进行，共设置四个处理：1)草地土灌溉消毒水源(gd)；2)草地土灌溉未消毒水源(gfoc)；3)连作蕉园土灌溉消毒水源(od)和连作蕉园土灌溉未消毒水源(ofoc)。试验设置3个重复，每重复3盆香蕉，每盆种植一株苗。每个塑料花盆(规格：外口长10cm×底长7cm×高8cm)分装250g草地土或连作蕉园土，移栽长有三片真叶的香蕉幼苗，每隔三天用注射器直接向每盆种加入50ml消毒水源和未消毒水源进行定量灌溉。

3.2样品采集

幼苗生长60天后，从每个处理的三个重复中随机选取一株健康植株采集土体土壤、根际土壤和植株根部样品。移除香蕉苗后，将土混匀，用四分法保留20克左右的土壤作为各处理的土体土壤样品。收集香蕉植株根系，抖落根系表面土壤，收集附着在根系0-2毫米的土壤作为根际土壤样品。将根系表面土壤洗净，次氯酸钠溶液消毒根系后作为根部样品。

3.3香蕉生长指标测定

每个处理随机选取三株香蕉植株，测量植株的株高、茎粗、叶长、叶宽、植株鲜重和根系鲜重，将植株70℃烘干至恒量，称取植株干重。结果表明，使用消毒处理的水源灌溉可以促进香蕉植株苗期健康生长，香蕉植株的生长状况得到明显改善，香蕉植株的株高、茎粗、叶面积和生物量均明显高于含病原菌水源处理，同时也促进了植株株高、茎粗、叶面积、生物量的增加(见表2)。

表2灌溉消毒水源对草地土和香蕉连作土壤中香蕉幼苗生长的影响

注：od，蕉园土消毒水源灌溉；gd，草地土消毒水源灌溉；ofoc，蕉园土含病原菌水源灌溉；gfoc，草地土含病原菌水源灌溉。以上数据以均值±标准偏差(n＝3)表示，星号表示t检验的显著性，.p<0.1，*p<0.05，**p<0.01。

3.4微生物数量测定

采用平板稀释涂布计数法测定各处理总细菌、总真菌、尖孢镰刀菌、芽孢杆菌和假单胞菌数量。选取合适稀释梯度，吸取100ul土壤稀释液至相应平板，均匀涂布。总细菌采用lb培养基，真菌采用马丁氏培养基，尖孢镰刀菌采用komada培养基，假单胞菌采用假单胞菌cfc选择性培养基，芽孢杆菌采用lb培养基添加抗生素(倒平板前在低于50℃的培养基中添加1％的多粘菌素2ml，1％放线菌酮4ml)。将每克土壤形成的菌落数(colonyformingunit，cfu)取对数值，以lgcfu每克土壤表示。各样品中每克土壤的细菌菌落数与真菌菌落数的比值即为可培养细菌与真菌的比值(b/f)。

所述培养基配方见表3。

表3培养基名称及其配方

结果表明，在草地土壤和连作蕉园土壤中，灌溉消毒水源处理的香蕉土体、根际和根内尖孢镰刀菌数量均极显著少于灌溉含病原菌水源处理(p<0.001)。在草地土壤中，灌溉含病原菌水源处理的香蕉土体、根际和根内病原菌数量分别为灌溉消毒水源处理的2.32、3.26和3.13倍；在连作蕉园土壤中，灌溉含病原菌水源处理的香蕉土体、根际和根内病原菌数量分别为灌溉消毒水源处理的1.68、2.53和1.62倍。以上结果表明，灌溉含病原菌水源能够使尖孢镰刀菌在香蕉土体土壤、根际和根内显著富集(如图1所示)。

与灌溉含病原菌水源相比，灌溉消毒水源改变了香蕉土体和根际可培养细菌和真菌数量，同时对土体和根际可培养细菌和真菌数量比值产生了影响。在草地土和连作蕉园土中，灌溉消毒水源处理的土体可培养细菌数量均显著高于灌溉含病原菌水源处理(图2a)，可培养真菌数量均明显低于含病原菌水源处理(图3a)，土体b/f也显著高于灌溉含病原菌水源处理(p<0.01)(图4)。灌溉含病原菌水源处理的香蕉根际可培养细菌和真菌数量在草地和连作蕉园土壤中均明显高于灌溉消毒水源处理(图2b,3b)，b/f值也明显高于灌溉消毒水源处理(图4)。以上结果表明，灌溉消毒水源处理显著提高了香蕉土体土壤的b/f值，灌溉含病原菌水源处理则明显提高了根际土壤的b/f值。

灌溉消毒水源和含病原菌水源处理的香蕉根际土壤芽孢杆菌和假单胞菌的数量发生了明显改变。灌溉含病原菌水源处理的香蕉根际芽孢杆菌和假单胞菌的数量均明显多于灌溉含病原菌水源处理。与灌溉消毒水源处理相比，根际芽孢杆菌(图5a)数量在草地土壤和连作蕉园土壤中分别高出14.35％和46.98％(p<0.001)，假单胞菌(图5b)则分别高出69.23％(p<0.001)和96.39％(p<0.001)。以上结果表明，灌溉含病原菌水源处理明显增加了香蕉根际土壤芽孢杆菌和假单胞菌数量。

基于bray-curits距离的主成分分析结果表明，灌溉消毒水源和含病原菌水源处理间香蕉土壤样品的可培养微生物群落组成存在明显差异(amova，p<0.01)，第一、二主坐标轴分别解释了总变异的52.92％和29.08％。表明，灌溉消毒水源和含病原菌水源处理分别形成了显著不同的土壤可培养微生物群落(如图6所示)。

土体土壤可培养细菌、真菌、尖孢镰刀菌，根际土壤可培养细菌、真菌、尖孢镰刀菌、芽孢杆菌、假单胞菌和根内尖孢镰刀菌间的斯皮尔曼相关性分析结果表明，在土体土壤中，可培养细菌数量与土体和根际土壤中尖孢镰刀菌数量均呈显著负相关关系(p<0.01)；可培养真菌与土体、根际土壤和根内尖孢镰刀菌数量均呈显著正相关关系；土体尖孢镰刀菌数量与根际尖孢镰刀菌数量呈显著正相关关系(p<0.01)。土体土中尖孢镰刀菌入侵时，可培养细菌数量减少，可培养真菌和尖孢镰刀菌的数量增加。在根际土壤中，可培养细菌与土体和根际土壤尖孢镰刀菌数量均呈显著正相关关系(p<0.1)；可培养真菌与根际尖孢镰刀菌数量呈显著正相关关系(p<0.1)；假单胞菌与土体土壤(p<0.001)、根际土壤和根内尖孢镰刀菌的数量均呈显著正相关关系；芽孢杆菌与根内尖孢镰刀菌数量呈显著负相关关系(p<0.05)。根际中尖孢镰刀菌入侵时，可培养微生物群落结构发生了明显改变，可培养细菌、可培养真菌和假单胞菌数量均明显减少。(如图7所示)。

综上所述，灌溉用环保消毒剂次氯酸钠进行消毒处理的无病原菌水源，能够显著减缓病原菌在土壤中传播和香蕉根际中的富集，促进香蕉植株的健康种植，基于水源消毒的香蕉健康种植体系对于香蕉枯萎病的防控具有参考意义，为防控香蕉枯萎病提供了新的研究思路，有望提高香蕉枯萎病的综合防控效果。