一种利用小鼠建立非酒精性脂肪性肝病模型的方法与流程

本发明涉及人类非酒精性脂肪性肝病模型制备领域，更具体地，涉及一种利用小鼠建立非酒精性脂肪性肝病模型的方法。
背景技术：
：非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholicfattyliverdisease,nafld）是指除酒精和其他明确的肝损害因素所致的，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。nafld自然史包括单纯脂肪变性、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化/肝硬化，甚至可发展为肝癌。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，nafld已成为世界范围内最常见的慢性肝脏疾病，全球普通成人nafld患病率为10%~30%，我国普通人群nafld患病率约为15%。在这些nafld患者中，nash患者的比例为10%~20%，nash患者10年内进展为肝硬化的概率高达25%。nafld与代谢综合征密切相关，nafld患者表现为血脂异常，胰岛素敏感，bmi值较高，并常伴有2型糖尿病和冠心病等并发症的产生。nafld造成的社会经济负担日益加重，已成为一个全球性的公共健康问题。目前很多学者对nafld的发病机理及治疗策略进行了深入详细的研究。对人类疾病的研究往往不能直接在人体进行试验，所以动物疾病模型就显得特别重要。研究nafld的发病机制，并开发治疗nafld的临床手段，必须首先了解nafld疾病发生的特点，以及nafld进展过程中体内的一系列生理变化，这些研究内容在动物模型上都能很好的体现出来，并经过合理的实验将这种变化以数据的形式展现出来。如中国发明201310312133.8公开了一种非酒精性脂肪肝病模型制备方法，具体包括以下步骤：将饲养小鼠随机分为模型小鼠和对照小鼠两组，每天记录状态并取尿液、肝组织及血液作脂质分析，然后处理实验对象，建立模型，肝组织与血液采集，将鼠肝组织标本进行常规冰冻切片，取材、普通胶水包冰冻切片、染色后封片，在对模型小鼠和对照小鼠进行病理检查，再将上述步骤得出的动态分析肝组织脂肪进行对比，但该发明采用的是野生型小鼠，野生型小鼠在构建脂肪肝模型虽然也会有较为明显的病理变化，但若利用更易患nafld的动物进行nafld模型构建，则会得到更加适合科学研究的nafld动物模型。可见，为了模拟人体nafld发病的过程，研究人员开发了多种nafld动物模型，如猪、犬、荷兰兔、wistar大鼠、sd大鼠、c57bl/6小鼠等。这些nafld动物模型在一定程度上能够模拟人体内nafld病理过程，但是由于上述模型存在体积较大、繁育周期较长、饲养空间需求较大等缺点，很多时候限制了实验室内的正常使用。本发明特别采用c57bl/6背景的tm6sf2e167k基因敲入型小鼠代替野生型c57bl/6作为研究对象。tm6sf2是nafld的一个遗传易感基因，其e167k突变会导致体内血脂异常，显著增加机体患nafld的概率。因此c57bl/6背景的tm6sf2e167k/e167k小鼠用来建立nafld模型具有明显的优势和特点，为深入研究nafld发病机制及疾病进展过程提供了可靠的方法。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种利用c57bl/6背景的tm6sf2e167k/e167k小鼠建立经高脂诱导的伴有严重血脂异常的非酒精性脂肪性肝病动物模型，本nafld模型构建方便，表型明显，非常适用于nafld的科学研究工作。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：（1）设置分组：将小鼠随机分为模型组和对照组，每组包含tm6sf2e167k/e167k小鼠8只和野生型小鼠8只；（2）饲养条件：分笼饲养于spf级动物饲养室，每笼4只小鼠，鼠龄为8周，所有小鼠先用普通维持饲料饲养一周，以便使小鼠适应环境；（3）进行建模：适应环境之后开始进行建模，模型组小鼠给予高脂饲料，对照组给予普通维持饲料，每天一次10-20g定量补给饲料，保证50g/笼；（4）建模后检测：建模8周后进行摘眼球取血并用断颈法将小鼠处死，检测小鼠血脂四项指标（tc、tg、ldl-c、hdl-c）和肝功指标（ast和alt），取小鼠新鲜肝脏组织进行匀浆，检测肝脏内tc和tg的含量，另取肝组织做石蜡和冰冻切片，分别进行h.e.和油红o染色，检测nafld建模效果。所述步骤（1）中的tm6sf2e167k/e167k小鼠具体为c57bl/6背景的tm6sf2e167k/e167k小鼠。所述步骤（1）中的野生型小鼠具体为c57bl/6背景的野生型小鼠。所述步骤（1）中的小鼠全部为雄性或全部为雌性。所述步骤（2）中的饲养条件，具体为：饲养室内温度为22~26°c，湿度为40%~60%，光照条件为12小时光照和12小时黑暗交替。本发明的另一个目的是提供一种根据建立的非酒精性脂肪性肝病模型在肝病研究中的应用。本发明的有益效果：（1）本发明创造性的采用c57bl/6为背景的tm6sf2e167k/e167k点突变小鼠，经高脂饲料诱导形成非酒精性脂肪性肝病模型。tm6sf2e167k/e167k点突变小鼠与野生型小鼠相比，具有易发nafld的特点，在经过高脂饲料诱导后，比野生型小鼠能表现出更明显的nafld症状。（2）本发明采用c57bl/6背景的tm6sf2e167k/e167k小鼠为对象，使用单纯的高脂高热量饲料对小鼠进行nafld建模，在较短的周期8周内，能够造出表型非常明显的nafld模型。（3）该nafld小鼠模型的血脂、肝脏脂肪含量等指标非常稳定，可重复性高。（4）本发明为建立高质量的nafld模型提供了一种非常可靠的方法，适于推广应用。附图说明图1为实施例4中对照维持饲料喂养的c57bl/6小鼠肝脏病理切片图（h.e.染色x400）；图2为实施例4中对照维持饲料喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠肝脏病理切片图（h.e.染色x400）；图3为实施例4中高脂饲料喂养的c57bl/6小鼠肝脏病理切片图（h.e.染色x400）；图4为实施例4中高脂饲料喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠肝脏病理切片图（h.e.染色x400）；图5为实施例4中对照维持饲料喂养的c57bl/6小鼠肝脏病理切片图（油红染色x400）；图6为实施例4中对照维持饲料喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠肝脏病理切片图（油红染色x400）；图7为实施例4中高脂饲料喂养的c57bl/6小鼠肝脏病理切片图（油红染色x400）；图8为实施例4中高脂饲料喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠肝脏病理切片图（油红染色x400）。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明方法中的动物饲料为高脂饲料（hfd）和普通维持饲料（nd），其中高脂饲料购买自北京蕙特比科技有限公司，产品编号为d12492，普通维持饲料购买自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，产品编号为1010011。本发明方法中spf级tm6sf2e167k/e167k小鼠和c57bl/6野生小鼠均购买自南京大学南京生物医药研究院。本发明方法中总胆固醇（tc）测定试剂盒（产品编号为a111-1）和甘油三酯（tg）测定试剂盒（产品编号为a110-1）购买自南京建成生物工程研究所。实施例1nafld动物模型的建立1.实验动物：spf级雄性c57bl/6背景tm6sf2e167k/e167k小鼠和c57bl/6野生小鼠，8周龄，体重（23±2）g。2.饲养环境：实验动物均饲养于spf级动物房，饲养室内温度为22~26°c，湿度为40%~60%，光照条件为12小时光照和12小时黑暗交替。3.分组饲养：将小鼠分为模型组和对照组，模型组包括8只tm6sf2e167k/e167k小鼠和8只野生小鼠，对照组包括8只tm6sf2e167k/e167k小鼠和8只野生小鼠，每笼饲养4只小鼠，小鼠详细分组情况如下表1所示。所有小鼠先用普通维持饲料饲养1周，之后开始建模，建模时长为8周，每天上午8点添加一次饲料，保证50g/笼，饮水供应充足，水源为无菌水，每周称量体重一次。表1.组别小鼠饲料ac57bl/6维持饲料（nd）btm6sf2e167k/e167k维持饲料（nd）cc57bl/6高脂饲料（hfd）dtm6sf2e167k/e167k高脂饲料（hfd）实施例2建模后小鼠血浆生化指标检测1.建模8周后，对所有小鼠禁食12小时，然后将小鼠处死并进行取材，对小鼠腹腔注射4%水合氯醛（0.1ml/10g）进行麻醉，然后进行摘眼球取血，将血置于含有edta抗凝剂的采血管中，摇晃均匀，4°c放置10分钟，离心分离血浆和血细胞，离心条件为4°c下1500g离心5分钟，取上层血浆。2.利用全自动生化分析仪检测步骤1中的血浆中tc、tg、ldl-、hdl-c、alt和ast的含量，各组小鼠血浆生化指标结果如表2所示（x±s，n=6）。表2.组别tctgldl-chdl-caltasta2.46±0.070.54±0.090.38±0.041.32±0.1336.46±3.03146.33±20.45b2.54±0.120.57±0.110.50±0.06a1.26±0.0740.25±2.69142.36±17.58c3.37±0.06a,b0.97±0.10a,b0.79±0.09a,b0.96±0.05a,b39.94±4.73157.86±26.42d3.61±0.09a,b,c1.18±0.07a,b,c0.96±0.05a,b,c0.83±0.04a,b,c43.81±4.26a154.79±16.39注：tc、tg、ldl-c、hdl-c的单位为mmol/l，alt和ast的单位为u/l。a：与a组比较，p<0.01；b：与b组比较，p<0.01；c：与c组比较，p<0.01。本实施例表明高脂喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠与其他三组小鼠相比tc、tg、ldl-c均有显著升高，并且hdl-c有明显降低（p<0.01），高脂喂养的c57bl/6小鼠相较于维持饲料喂养的两组小鼠其tc、tg、ldl-c有明显的升高，并且hdl-c有显著降低（p<0.01），此外，除高脂喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠与维持饲料喂养的c57bl/6小鼠之间alt有显著差异外，其余各组间alt和ast水平无明显差异，表明经高脂建模后，各组小鼠肝脏没有出现明显损伤，根据nafld病情发展判断，本发明中模型为单纯性脂肪肝，以上数据表明tm6sf2e167k/e167k小鼠在血清脂质提升上的优势较明显。实施例3建模后小鼠肝脏脂质水平检测每只小鼠取2块100mg新鲜肝脏组织，按照tc检测试剂盒和tg检测试剂盒的说明书各加入0.9ml裂解液进行匀浆，各自匀浆液一部分用来检测tc和tg的含量，一部分用来测定其中的蛋白浓度，肝脏组织中的tc和tg浓度需要根据每毫克蛋白浓度来校正，各组小鼠肝脏tc和tg变化表结果如表3所示（x±s，n=4）。表3.组别tctga32.48±3.61187.65±13.43b35.13±4.72189.43±17.02c48.27±4.86a,b434.46±63.23a,bd58.55±3.86a,b,c551.84±46.95a,b,c注：tc和tg的单位为mmol/kg。a：与a组比较，p<0.01；b：与b组比较，p<0.01；c：与c组比较，p<0.01。本实施例显示高脂饲料喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠相较于其他三组，肝脏中tc和tg的含量明显升高（p<0.01），高脂喂养的c57bl/6小鼠相较于维持饲料喂养的两组小鼠，其肝脏中tc和tg的含量也显著升高（p<0.01），表明高脂饲料喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠和c57bl/6小鼠都成功建立了脂肪肝模型，但tm6sf2e167k/e167k小鼠的效果要显著优于c57bl/6小鼠。实施例4肝脏组织病理学检测具体以一只小鼠为例，眼眶取血后，断颈法将小鼠处死，剖开小鼠腹部，取新鲜肝脏一块，分为两份，一份用10%中性福尔马林固定液固定，用于做石蜡切片进行h.e.染色；另一份用于做石蜡切片进行油红o染色。由病理切片可以看出，维持饲料喂养的c57bl/6和tm6sf2e167k/e167k小鼠肝组织结构完整，细胞核质饱满，肝细胞内脂滴含量较少（图1-2,5-6）。高脂饲料喂养的c57bl/6小鼠肝脏细胞有较为明显的气球样变和脂肪浸润，脂质小滴含量较对照组明显增加，应发展为轻中度脂肪肝（图3和7）。高脂饲料喂养的tm6sf2e167k/e167k小鼠肝细胞内出现大量空泡，脂肪变非常明显，脂滴数量较其他组明显增加，已发展为重度脂肪肝（图4和8），该实施例进一步说明tm6sf2e167k/e167k小鼠nafld建模成功。综上所述，本发明利用c57bl/6背景的tm6sf2e167k/e167k小鼠经高脂饲料诱导成功构建了nafld模型，该模型小鼠患有严重的血脂异常，并且肝脏中脂质积累明显。本发明为研究nafld发病机理及疾病进展过程提供了一种新型的动物模型，具有极佳的应用价值。当前第1页12