布氏白僵菌菌剂及其应用的制作方法

本发明属于农业技术领域，具体涉及布氏白僵菌菌剂及其应用。

背景技术：

地下害虫包括蛴螬、根象甲、根叶甲、地老虎、蝼蛄、根蛆等200多种，其生活周期中至少有一个阶段生活在土壤中，取食作物、林木、花卉、牧草等植物的种子、种苗、根茎和地下果实，致使缺苗倒苗、植株因营养吸收不足而萎蔫甚至死亡，其为害隐蔽，难以预测预报。

长期以来，我国主要依赖于化学农药防治害虫，由于化学杀虫剂的大量、连年施用，农产品、土壤和水域受到农药残留污染，对人类健康已构成严重威胁和损害。害虫抗药性的增强，使得用药量不断增加，防治费用倍增；有益天敌生物被大量损伤，生态环境遭到严重破坏，导致害虫的再增猖獗。为保护生态环境、保证食品和饲料的产量、品质和安全性，应用生物防治技术大面积控制农业害虫，采取害虫可持续治理措施势在必行

昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，在自然条件下约70％的昆虫病害是真菌引起的。其致病机制复杂，不会引起害虫产生抗性，对解决害虫的抗药性问题极具潜力。因此，昆虫病原真菌作为重要的替代农药。其中，布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)是一类昆虫病原真菌，能寄生7个目的70多种昆虫，通过附着于昆虫表皮、产生芽管穿透虫体表皮侵入、消耗虫体营养、自身快速繁殖、产生毒素，造成虫体组织损害和病变死亡。

然而，田间应用发现，人工应用的白僵菌等在田间有一定的自然衰减，而其侵染目标昆虫需要一定机率和致病过程时间，因此，往往不能达到理想防治效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种布氏白僵菌菌剂。

本发明的再一目的在于提供上述布氏白僵菌菌剂的应用。

根据本发明具体实施方式的用于防治地下害虫的布氏白僵菌菌剂，包括布氏白僵菌brns50206、混合辅助剂、矿物载体和谷物载体，其中，布氏白僵菌brns50206的保藏编号为cgmccno.15993。

根据本发明具体实施方式的用于防治地下害虫的布氏白僵菌菌剂，其包括以下重量份原料：布氏白僵菌孢子粉5～50份、混合辅助剂4～10份、矿物载体20～60份、谷物载体10～70份，其中，布氏白僵菌孢子粉的含量范围25-250亿/g。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌菌剂，包括以下重量份原料：布氏白僵菌菌丝体15～25份、混合辅助剂4～10份、矿物载体20～60份、谷物载体10～70份，其中，菌丝体按含干重2.5％计算。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌菌剂，混合辅助剂为烷基丁二酸磺酸钠、半纤维素、海藻酸钠、壳聚糖按照质量比为15:5:4:1混合得到。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌菌剂，其特征在于，所述矿物载体为凹凸棒土、滑石粉、硅藻土、白炭黑、碳酸钙、陶土中的一种或多种。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌菌剂，所述谷物载体为花生荚壳粉、玉米芯粉、玉米秸粉、麦秸粉、稻秸粉、甜菜粉、蔗渣粉中的一种或多种。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌菌剂，所述布氏白僵菌菌剂还包括粘合剂0.1～6份，所述粘合剂为聚乙烯醇或羧甲基纤维素。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌菌剂，所述布氏白僵菌菌剂还包括增效剂1～4份。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌菌剂，所述增效剂为10％吡虫啉可湿性粉剂、25％噻虫嗪可湿性粉剂或20％氯虫苯甲酰胺悬浮剂。

本发明的有益效果：

本发明将布氏白僵菌brns50206做为菌剂活性组分，专性侵染昆虫而对脊椎动物安全，无毒副作用，与环境天然融合，无损无污染，是环保安全的生物农药；本发明可应用于防治农作物、林木、草坪、牧草的蛴螬、根象甲、地老虎等种类害虫中。

混合辅助剂保护布氏白僵菌brns50206的生物活性和田间存活能力；

增效剂与布氏白僵菌产生协同作用，加速了布氏白僵菌的侵染，提高了侵染效率；

矿物载体、谷物载体在负载和分散活性组分的同时，还具有辅助保护布氏白僵菌活性、疏松土壤环境、促进布氏白僵菌田间存活和侵染的作用；

粘合剂可在制造颗粒剂时加入，便于成型、利于投撒应用。

附图说明

图1显示本发明菌剂对小地老虎的毒力测定结果。

本发明的布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)brns50206菌株的保藏编号为cgmccno.15993，该菌株于2018年07月17日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

实施例1

(1)将菌种孢子接种到液体培养基，其中含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水，培养48-60小时，得到液体种子；然后将液体培养物接种到固体培养基，其中含谷物皮壳35～60％、麦麸35～60％、玉米粉5～10％，培养5～9天后，干燥后直接粉碎基质或分离抽提得到孢子粉；

(2)按重量比配制烷基丁二酸磺酸钠:半纤维素:海藻酸钠:壳聚糖＝15:5:4:1的混合辅助剂；

(3)将5重量份孢子粉、4重量份辅助剂与10重量份花生壳粉混合；

(4)将1重量份10％吡虫啉可湿性粉剂加入到20重量份凹凸棒土中，混合均匀；

(5)将步骤(3)、(4)得到的混合物再次混合，得到布氏白僵菌微粒剂。

实施例2

(1)将菌种孢子接种到液体培养基，其中含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水，培养48-60小时，得到液体种子；然后将液体培养物接种到固体培养基，其中含谷物皮壳35～60％、麦麸35～60％、玉米粉5～10％，培养5～9天后，干燥后直接粉碎基质或分离抽提得到孢子粉；

(2)按重量比配制烷基丁二酸磺酸钠:半纤维素:海藻酸钠:壳聚糖＝15:5:4:1的混合辅助剂；

(3)将20重量份孢子粉、6重量份辅助剂与10重量份玉米芯粉混合；

(4)将2重量份25％噻虫嗪可湿性粉剂加入到20重量份硅藻土中，混合均匀；

(5)将步骤(3)、(4)得到的混合物再次混合，得到布氏白僵菌微粒剂。

实施例3

(1)将菌种孢子接种到液体培养基，其中含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水，培养48-60小时，得到液体种子；然后将液体培养物接种到固体培养基，其中含谷物皮壳35～60％、麦麸35～60％、玉米粉5～10％，培养5～9天后，干燥后直接粉碎基质或分离抽提得到孢子粉；

(2)按重量比配制烷基丁二酸磺酸钠:半纤维素:海藻酸钠:壳聚糖＝15:5:4:1的混合辅助剂；

(3)将50重量份孢子粉、10重量份辅助剂与70重量份蔗渣粉混合；

(4)将3重量份10％吡虫啉可湿性粉剂加入到60重量份凹凸棒土中，进行混合；

(5)最后将6重量份羧甲基纤维素与上述步骤(3)和步骤(4)的混合物，再混合均匀，挤压造粒，得到布氏白僵菌颗粒剂。

实施例4

(1)将菌种孢子接种到一级液体培养基，其中含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水，培养48-60小时，得到一级液体物；然后作为菌种再转接到含二级液体培养基，其中含蔗糖2％、可溶性淀粉1％、啤酒酵母1％、胡萝卜干粉0.4-0.6％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，余量为水，培养48-72小时，得到二级液体培养物；通过离心去除大部分水分，得到浓缩菌丝体；

(2)按重量比配制烷基丁二酸磺酸钠:半纤维素:海藻酸钠:壳聚糖＝15:5:4:1的混合辅助剂；

(3)将15重量份菌丝体、4重量份辅助剂与10重量份麦秸粉混合；

(4)将1重量份10％吡虫啉可湿性粉剂加入到38重量份硅藻土和6重量份碳酸钙中，混合均匀；

(5)将步骤(3)、(4)得到的混合物再次混合，得到布氏白僵菌微粒剂。

实施例5

(1)将菌种孢子接种到一级液体培养基，其中含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水，培养48-60小时，得到一级液体物；然后作为菌种再转接到含二级液体培养基，其中含蔗糖2％、可溶性淀粉1％、啤酒酵母1％、胡萝卜干粉0.4-0.6％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，余量为水，培养48-72小时，得到二级液体培养物；通过离心去除大部分水分，得到浓缩菌丝体；

(2)按重量比配制烷基丁二酸磺酸钠:半纤维素:海藻酸钠:壳聚糖＝15:5:4:1的混合辅助剂；

(3)将20重量份菌丝体、7重量份辅助剂与35重量份玉米芯粉混合；

(4)将1.5重量份25％噻虫嗪可湿性粉剂加入到46重量份硅藻土中，混合均匀；

(5)将5重量份羧甲基纤维素与步骤(3)和步骤(4)的混合物混合均匀，挤压造粒，得到布氏白僵菌颗粒剂。

实施例6

(1)将菌种孢子接种到一级液体培养基，其中含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水，培养48-60小时，得到一级液体物；然后作为菌种再转接到含二级液体培养基，其中含蔗糖2％、可溶性淀粉1％、啤酒酵母1％、胡萝卜干粉0.4-0.6％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，余量为水，培养48-72小时，得到二级液体培养物；通过离心去除大部分水分，得到浓缩菌丝体；

(2)按重量比配制烷基丁二酸磺酸钠:半纤维素:海藻酸钠:壳聚糖＝15:5:4:1的混合辅助剂；

(3)将25重量份菌丝体、10重量份辅助剂与70重量份麦秸粉混合均匀；

(4)将4重量份20％氯虫苯甲酰胺悬浮剂加入到38重量份凹凸棒土和16重量份白炭黑中，混合均匀

(5)将5重量份聚乙烯醇与步骤(3)、步骤(4)的混合物再混合均匀，挤压造粒，得到布氏白僵菌颗粒剂。

实施例7布氏白僵菌制剂的杀虫毒力测试

从玉米田中采集小地老虎(agrotisypsilon)幼虫，在实验室内进行杀虫毒力测定。设置以下4个处理组：布氏白僵菌孢子粉、上述实施例1的布氏白僵菌微粒剂、10％吡虫啉可湿性粉剂和对照。

处理步骤如下：1)从田间取回土壤，过筛后经160℃2小时烘烤，凉至室温；2)经测算，孢子粉的含量为320亿孢/g、微粒剂中含量为19.2亿孢/g和含0.003g吡虫啉/g；3)称取1g孢子粉，用544ml0.1％吐温80水润湿并稀释，然后加入到3199g土壤中，混拌均匀，得到含孢量1×10⁷/g、含水量17:100(v:w)的处理土壤；4)称取20g微粒剂，用649ml0.1％吐温80水润湿并稀释，然后加入到3820g土壤中，混拌均匀，得到含孢量1×10⁷/g、含15.6×10^-6g吡虫啉/g、含水量17:100(v:w)的处理土壤；5)称取0.468g10％吡虫啉可湿性粉剂，510ml用0.1％吐温80水稀释，然后加入到3000g土壤中，混拌均匀，得到含15.6×10^-6g吡虫啉/g、含水量17:100(v:w)的处理土壤；6)量取510ml0.1％吐温80水，加入到3000g土壤中，混拌均匀，得到对照土壤；7)将上述土壤分别分装到养虫盒中，每盒约50g，各放入1头试虫。每处理60头(盒)，以20头为1组，分3组重复。置于24-26℃室温饲养2周，于第4、6、8、10、12、14天检查死亡虫数，根据死亡率和死亡速率评价杀虫作用，结果见表1、图1。

表1布氏白僵菌及制剂对小地老虎的毒力作用

结果表明，布氏白僵菌孢子导致死亡率为79.3％，lt50为8.25天，而布氏白僵菌微粒剂或颗粒剂提高死亡率达到93.1％，lt50缩短为6.46天，证明菌株对小地老虎有高毒力作用，配方菌剂提高了侵染速率和死亡率。

实施例8布氏白僵菌制剂的药效试验

以大黑鳃金龟(holotrichiaoblita)2龄幼虫对上述实施例1-6的布氏白僵菌微粒剂和颗粒剂进行杀虫毒力测定。设置以下8个处理：布氏白僵菌孢子粉、上述实施例1-6的布氏白僵菌微粒剂或颗粒剂(编号为菌剂i、菌剂ii、菌剂iii、菌剂iv、菌剂v、菌剂vi)和对照。

处理步骤如下：1)从田间取回土壤，过筛后经160℃2小时烘烤，凉至室温；2)经测算，孢子粉的含量为320亿孢/g、菌剂1含量为19.2亿孢/g、菌剂2含量为51.2亿孢/g、菌剂3含量为38.4亿孢/g、菌剂4含量为6.1亿cfu/g、菌剂5含量为5.3cfu亿孢/g、菌剂6含量为4.8cfu亿孢/g；3)称取1g孢子粉，用544ml0.1％吐温80水润湿并稀释，然后加入到3199g土壤中，混拌均匀，得到含孢量1×10⁷/g、含水量17:100(v:w)的处理土壤；4)按重量分别称取15.6g菌剂i、5.9g菌剂ii、7.8g菌剂iii、49.2g菌剂iv、56.6g菌剂v、62.5g菌剂vi，各用510ml0.1％吐温80水润湿并稀释，然后加入到(3000-m)g土壤中(m为菌剂的重量)，混拌均匀，得到含量1×10⁷/g、含水量17:100(v:w)的各菌剂处理土壤。6)量取510ml0.1％吐温80水，加入到3000g土壤中，混拌均匀，得到对照土壤；7)将上述土壤分别分装到养虫盒中，每盒约50g，各放入1头试虫。每处理60头(盒)，以20头为1组，分3组重复。置于24-26℃室温饲养2周，于第4、6、8、10、12、14天检查死亡虫数，根据死亡率和死亡速率评价杀虫作用，结果见表2。

表2布氏白僵菌及制剂对大黑鳃金龟的毒力作用

结果表明，布氏白僵菌孢子导致死亡率为62.8％，lt50为9.35天，而布氏白僵菌微粒剂或颗粒剂提高死亡率达到71.3～84.1％，lt50缩短为6.56天，证明菌株对大黑鳃金龟有高毒力作用，配方菌剂提高了侵染速率和死亡率。

实施例8布氏白僵菌制剂的田间药效试验

在花生田间进行金龟子幼虫防控试验。在大约4亩的花生地中选取中央部分间隔划定为21个5m×5m的小区，3横×7纵排列，进行以下处理：上述实施例1的布氏白僵菌微粒剂按每亩100g用量处理和200g用量处理，上述实施例4的布氏白僵菌颗粒剂按每亩100g用量处理和200g用量处理，10％吡虫啉可湿性粉剂按在微粒剂或颗粒剂中等同用量即每亩3g和6g处理，空白对照处理。每处理设3小区重复，在小区随机分配排列。处理方法：在花生播种时，将菌剂或药剂用大约1kg细土稀释，撒施到种穴中然后点种。种植过程按常规统一管理。在花生收获时在每小区中部随机5点取样，每样点3棵连续植株，调查花生虫果率和产量，并检查植株周围20cm方块内的蛴螬残余数量，评价菌株防治害虫蛴螬的作用效果，结果如表3所示。

表3布氏白僵菌制剂防治花生田间蛴螬效果

结果表明，田间使用本发明的布氏白僵菌制剂后，花生好果数和重量显著提高，虫果率和虫口减退率较对照组有较大幅度的提高。因此，田间应用布氏白僵菌菌剂能够减少蛴螬危害，从而降低虫果率，增加花生产量。