一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法与流程

本发明属于铁皮石斛开花技术领域，具体涉及一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法。

背景技术：

铁皮石斛（dendrobiumcantenatum）又称黑节草，为兰科石斛属(dendrobium)多年生附生性草本植物，具有益胃生津和抗菌消炎等药用价值，由于其自然繁殖力很低，时间较长，市场上基本以试管苗为主。尽管其花色素雅，姿态优美，观赏价值高，一直以来药食用铁皮石斛是其主要市场，但近年来市场变动导致生产商收入减少，因此观赏性铁皮石斛的应用推广是产业出路，但是由于观赏性铁皮石斛童期时间为3-4年不仅影响了其观赏性，也使得育种过程十分耗时。显然，打破童期限制，提早开花的技术对于铁皮石斛等兰科观赏植物来说应用前景十分广阔。

floweringlocust（ft）是植物花期调控途径中最关键的基因，它位于各个成花途径如光周期途径、春化途径和自主途径中的下游，是整合来自不同花发育途径的信号网络中关键分子之一。ft受上游基因co的调控，并通过其下游ap1、soc1等花分生组织决定基因的作用来促进植物的开花。该基因表达水平的提高，对植物开花具有促进作用。

目前有关石斛兰开花调控研究大多为使用激素调控手段或者改变外部环境条件调节植物花期，不但成本高而且费时费力。使用分子生物学方法缩短植物童期简便且经济，然而目前利用分子技术调控开花在兰花的研究目前仍较少。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法。该方法铁皮石斛再生植株的获取途径不经过原球茎阶段，缩短了培养周期；预培养时拨去了膜质叶鞘有助于农杆菌的侵染，使铁皮石斛童期缩短，开花率显著增高。

一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法，以铁皮石斛幼嫩茎段为外植体瞬时表达外源早花基因；包括以下步骤：（1）幼嫩茎段采集及消毒，（2）预培养，（3）农杆菌侵染及共培养，（4）不定芽培养，（5）生根培养，（6）壮苗生根和炼苗移栽，（7）植株开花情况观察。

一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法，包括以下具体步骤：

（1）幼嫩茎段采集及消毒：选取长势良好、均匀，叶片健康的铁皮石斛幼嫩茎段和叶片，自来水冲洗10min后备用；在紫外线照射20min灭菌过的超净工作台上，先用75vol%酒精浸泡30s，后用50ml0.1wt%升汞加1μl一滴吐温80的混合液消毒8min，间隔震荡确保外植体与消毒液充分接触，无菌水冲洗6-7次保证去除残留消毒物质，置于无菌水中待用；

（2）预培养：用手术刀将消毒后的幼嫩茎段切成长度为1-1.5cm带有芽眼的茎段，用镊子轻轻将膜质叶鞘拨去，接种于不定芽诱导培养基上预培养7天；

（3）农杆菌侵染及共培养：取携带有外源早花基因ftgeneid:842859病毒表达载体的gv3101农杆菌菌液，加入终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec的液体lb培养基中，28℃、180rpm培养至od600为0.8，离心后弃上清，沉淀用ph5.6的bme液体培养基稀释至od600为0.5~0.8同时加入终浓度为20mg/l的as，得农杆菌侵染液用于转化；将步骤（2）预培养的茎段用刀片划伤，再用带有侵染液的棉花棒涂抹伤口部位，遮光培养3~5天，之后将茎段在终浓度为500mg/lcef的无菌水中清洗3~5次后用无菌滤纸吸干表面水分；

（4）不定芽培养：将茎段插入不定芽诱导培养基中培养3周，每周用终浓度500mg/lcef的无菌水清洗一次，至观察到在茎段节间处长出新芽，此时切除已褐化的茎段两端表面，接种于不定芽诱导培养基，继代增殖20~30天，令丛生芽继续生长；

（5）生根培养：选取株高为2-3cm，具有2-3片真叶的不定芽接种至诱导生根培养基中，培养5~10天看到根系形成；

（6）壮苗生根和炼苗移栽：将生根的不定芽切除原带的茎段，转移至壮苗生根培养基中，培养30~60天，试管苗长至3cm以上；将具有3-4片叶，4-5条根生长良好而且根系发达的试管苗移出组培室，于常温下开盖炼苗，7-10天后移栽至日光温室中；使用长镊子轻柔地将培养基与小苗一起取出，保护根茎部不受伤，随后以清水轻柔洗去附着在根上的培养基，再用0.2wt%多菌灵浸泡消毒1h，以防栽培后的石斛苗根腐烂或生霉，在阴凉通风处晾根半天至根发白即移栽至含等质量比营养土、蛭石和树皮的基质中；移栽后最初一周不宜接受强光照，空气湿度宜保持在80%~90%，一周后，幼苗旧根开始伸长，空气湿度保持在70%-80%，逐渐增加光照。

（7）植株开花情况观察：移栽后6个月起开始观察统计植株开花情况，每个月统计一次。

上述步骤（2）、（4）中不定芽诱导培养基为：1/2ms+2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.4~5.8。

上述步骤（5）中诱导生根培养基为：1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.4~5.8。

上述步骤（6）中壮苗生根培养基为：1/2ms+1mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+100g/l香蕉汁+3g/l卡拉胶，ph值为5.4~5.8。

本发明的有益效果：

（1）采用的铁皮石斛再生植株获取途径不经过原球茎阶段，缩短了培养周期。

（2预培养时拨去了膜质叶鞘有助于农杆菌的侵染。

（3）使用该发明获得的铁皮石斛移栽后10个月有20.2%~25.9%的植株开花，开花率显著增高，童期缩短。

（4）使用该发明获得的植株并非转基因植株，不存在转基因安全性问题。

附图说明：

图1：铁皮石斛开花情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。

实施例1携带有拟南芥早花基因ft的病毒表达载体的构建

从ncbi数据库获得拟南芥早花基因ftgeneid:842859的基因序列，并以此基因序列为模板设计引物atft-lic-f和atft-lic-r，引物氨基酸序列为：

atft-lic-f：cgacgacaagaccctatgcaaatccgaaacagtataaatatgtgtagag

atft-lic-r：cgacgacaagaccctatgtctataaatataagagac

以拟南芥cdna为模板，使用引物atft-lic-f和atft-lic-r扩增获得拟南芥早花基因ft，使用不依赖连接的克隆（lic）法将拟南芥早花基因ft插入经psti酶切的ptrv2e载体，转化大肠杆菌dh5α，经验证后获得携带有拟南芥早花基因ft的病毒表达载体ptrv2e-atft。

ptrv2e-atft质粒转化农杆菌感受态gv3101，备用。

实施例2

一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法，包括以下具体步骤：

（1）幼嫩茎段采集及消毒：选取长势良好、均匀，叶片健康的铁皮石斛幼嫩茎段和叶片，自来水冲洗10min后备用；在紫外线照射20min灭菌过的超净工作台上，先用75vol%酒精浸泡30s，后用50ml0.1wt%升汞加1μl吐温80的混合液消毒8min，间隔震荡确保外植体与消毒液充分接触，无菌水冲洗6次保证去除残留消毒物质，置于无菌水中待用；

（2）预培养：用手术刀将消毒后的幼嫩茎段切成长度为1cm带有芽眼的茎段，用镊子轻轻将膜质叶鞘拨去，接种于不定芽诱导培养基（1/2ms+2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.6）上预培养7天；

（3）农杆菌侵染及共培养：取携带有拟南芥早花基因ft的病毒表达载体ptrv2e-atft的gv3101农杆菌菌液，加入终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec的液体lb培养基中，28℃、180rpm培养至od600为0.8，离心后弃上清，沉淀用ph5.6的bme液体培养基稀释至od600为0.5同时加入终浓度为20mg/l的as，得农杆菌侵染液用于转化；将步骤（2）预培养的茎段用刀片划伤，再用带有侵染液的棉花棒涂抹伤口部位，遮光培养3天，之后将茎段在终浓度为500mg/lcef的无菌水中清洗3次后用无菌滤纸吸干表面水分；

（4）不定芽培养：将茎段插入不定芽诱导培养基（1/2ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+20g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.6）中培养3周，每周用终浓度500mg/lcef的无菌水清洗一次，至观察到在茎段节间处长出新芽，此时切除已褐化的茎段两端表面，接种于不定芽诱导培养基（1/2ms+2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶）中继代增殖30天，令丛生芽继续生长；

（5）生根培养：选取株高为2cm，具有2片真叶的不定芽接种至诱导生根培养基（1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.6）中，培养10天看到根系形成；

（6）壮苗生根和炼苗移栽：将生根的不定芽切除原带的茎段，转移至壮苗生根培养基（1/2ms+1mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+100g/l香蕉汁+3g/l卡拉胶，ph值为5.6），培养60天，试管苗长至3cm；将具有3片叶，4条根生长良好而且根系发达的试管苗移出组培室，于常温下开盖炼苗，7天后移栽至日光温室中；使用长镊子轻柔地将培养基与小苗一起取出，保护根茎部不受伤，随后以清水轻柔洗去附着在根上的培养基，再用0.2wt%多菌灵浸泡消毒1h，以防栽培后的石斛苗根腐烂或生霉，在阴凉通风处晾根半天至根发白即移栽至含等质量比营养土、蛭石和树皮的基质中；移栽后最初一周不宜接受强光照，空气湿度宜保持在90%一周后，幼苗旧根开始伸长，空气湿度保持在70%，逐渐增加光照。

（7）植株开花情况观察：移栽后6个月起开始观察统计植株开花情况，每个月统计一次。移栽后6个月便有少量植株开花。移栽后10个月，使用该方法获得的植株开花率高达25.9%。而常规组培移栽苗对照在移栽10个月后的开花率仅为2.4%。

实施例3

一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法，包括以下具体步骤：

（1）幼嫩茎段采集及消毒：选取长势良好、均匀，叶片健康的铁皮石斛幼嫩茎段和叶片，自来水冲洗10min后备用；在紫外线照射20min灭菌过的超净工作台上，先用75vol%酒精浸泡30s，后用50ml0.1wt%升汞加1μl吐温80的混合液消毒8min，间隔震荡确保外植体与消毒液充分接触，无菌水冲洗7次保证去除残留消毒物质，置于无菌水中待用；

（2）预培养：用手术刀将消毒后的幼嫩茎段切成长度为1.5cm带有芽眼的茎段，用镊子轻轻将膜质叶鞘拨去，接种于不定芽诱导培养基（1/2ms+2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.6）上预培养7天；

（3）农杆菌侵染及共培养：取携带有拟南芥早花基因ft病毒表达载体ptrv2e-atft的gv3101农杆菌菌液，加入终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec的液体lb培养基中，28℃、180rpm培养至od600为0.8，离心后弃上清，沉淀用ph5.6的bme液体培养基稀释至od600为0.8，同时加入终浓度为20mg/l的as，得农杆菌侵染液用于转化；将步骤（2）预培养的茎段用刀片划伤，再用带有侵染液的棉花棒涂抹伤口部位，遮光培养5天，之后将茎段在终浓度为500mg/lcef的无菌水中清洗5次后用无菌滤纸吸干表面水分；

（4）不定芽培养：将茎段插入不定芽诱导培养基（1/2ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+20g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.4）中培养3周，每周用终浓度500mg/lcef的无菌水清洗一次，至观察到在茎段节间处长出新芽，此时切除已褐化的茎段两端表面，接种于不定芽诱导培养基（1/2ms+2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.4）中继代增殖20天，令丛生芽继续生长；

（5）生根培养：选取株高为3cm，具有3片真叶的不定芽接种至诱导生根培养基（1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.4）中，培养5天看到根系形成；

（6）壮苗生根和炼苗移栽：将生根的不定芽切除原带的茎段，转移至壮苗生根培养基（1/2ms+6-ba1mg/l+naa0.5mg/l+30g/l蔗糖+100g/l香蕉汁+3g/l卡拉胶，ph值为5.4），培养30天，试管苗长至4cm；将具有4片叶，5条根生长良好而且根系发达的试管苗移出组培室，于常温下开盖炼苗，7天后移栽至日光温室中；使用长镊子轻柔地将培养基与小苗一起取出，保护根茎部不受伤，随后以清水轻柔洗去附着在根上的培养基，再用0.2wt%多菌灵浸泡消毒1h，以防栽培后的石斛苗根腐烂或生霉，在阴凉通风处晾根半天至根发白即移栽至含等质量比营养土、蛭石和树皮的基质中；移栽后最初一周不宜接受强光照，空气湿度宜保持在90%，一周后，幼苗旧根开始伸长，空气湿度保持在85%，逐渐增加光照。

（7）植株开花情况观察：移栽后6个月起开始观察统计植株开花情况，每个月统计一次。移栽后6个月便有少量植株开花。移栽后10个月，使用该方法获得的植株开花率高达20.2%。而常规组培移栽苗对照在移栽10个月后的开花率仅为2%。

实施例4

一种促进铁皮石斛童期开花的分子方法，包括以下具体步骤：

（1）幼嫩茎段采集及消毒：选取长势良好、均匀，叶片健康的铁皮石斛幼嫩茎段和叶片，自来水冲洗10min后备用；在紫外线照射20min灭菌过的超净工作台上，先用75vol%酒精浸泡30s，后用50ml0.1wt%升汞加一滴吐温80的混合液消毒8min，间隔震荡确保外植体与消毒液充分接触，无菌水冲洗6次保证去除残留消毒物质，置于无菌水中待用；

（2）预培养：用手术刀将消毒后的幼嫩茎段切成长度为1.3cm带有芽眼的茎段，用镊子轻轻将膜质叶鞘拨去，接种于不定芽诱导培养基（1/2ms+2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.8）上预培养7天；

（3）农杆菌侵染及共培养：取携带有外源开花早花基因ft病毒表达载体的gv3101农杆菌菌液，加入终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec的液体lb培养基中，28℃、180rpm培养至od600为0.9，离心后弃上清，沉淀用ph5.6的bme液体培养基稀释至od600为0.57，同时加入终浓度为20mg/l的as，得农杆菌侵染液用于转化；将步骤（2）预培养的茎段用刀片划伤，再用带有侵染液的棉花棒涂抹伤口部位，遮光培养4天，之后将茎段在终浓度为500mg/lcef的无菌水中清洗4次后用无菌滤纸吸干表面水分；

（4）不定芽培养：将茎段插入不定芽诱导培养基（1/2ms+6-ba2.0mg/l+naa0.5mg/l+20g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.8）中培养3周，每周用终浓度500mg/lcef的无菌水清洗一次，至观察到在茎段节间处长出新芽，此时切除已褐化的茎段两端表面，接种于不定芽诱导培养基（1/2ms+2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.8）中继代增殖25天，令丛生芽继续生长；

（5）生根培养：选取株高为2.5cm，具有2.5片真叶的不定芽接种至诱导生根培养基（1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+3g/l卡拉胶，ph值为5.8）中，培养8天看到根系形成；

（6）壮苗生根和炼苗移栽：将生根的不定芽切除原带的茎段，转移至壮苗生根培养基（1/2ms+6-ba1mg/l+naa0.5mg/l+30g/l蔗糖+100g/l香蕉汁+3g/l卡拉胶，ph值为5.8），培养45天，试管苗长至3cm；将具有3片叶，5条根生长良好而且根系发达的试管苗移出组培室，于常温下开盖炼苗，8天后移栽至日光温室中；使用长镊子轻柔地将培养基与小苗一起取出，保护根茎部不受伤，随后以清水轻柔洗去附着在根上的培养基，再用0.2wt%多菌灵浸泡消毒1h，以防栽培后的石斛苗根腐烂或生霉，在阴凉通风处晾根半天至根发白即移栽至含等质量比营养土、蛭石和树皮的基质中；移栽后最初一周不宜接受强光照，空气湿度宜保持在90%，一周后，幼苗旧根开始伸长，空气湿度保持在80%，逐渐增加光照。

（7）植株开花情况观察：移栽后6个月起开始观察统计植株开花情况，每个月统计一次。

移栽后6个月有少量植株开花。移栽后10个月，使用该方法获得的植株开花率高达23%。而常规组培移栽苗对照在移栽10个月后的开花率仅为2.2%。

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<110>福建农林大学

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