一株黄色金针菇菌株及其培育方法与流程

本发明涉及一株黄色金针菇菌株及其培育方法，属于食用菌栽培
技术领域：
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背景技术：
：金针菇，因色泽金黄、菇柄细长似金针菜而得名金针菇。黄色金针菇色泽金黄，抗逆性强、产量高，生长速度快、温度适应性强、菇味浓、口感好。20世纪30年代，采用瓶栽法栽培金针菇成功。1964年，开始金针菇的品种培育工作，在生产过程中，为了消除菌柄绒毛对口感的影响，人们逐渐培育出了菌柄细而长、菌盖小而不易张开的金针菇品种。在八十年代末期以前，我国栽培的金针菇品种主要是黄色品种。1928年，日本京都的森本彦三郎选育出了菌盖、菌柄都是白色的金针菇。其色泽纯白，很适合鲜食，营养价值高、价格也高。此后我国从日本引进了纯白色品种。白色金针菇就迅速占领市场，黄色金针菇被人们冷落。白色金针菇由于出菇齐、不易受到光照的影响而改变色泽，很适合大规模生产，再加上近年来实现了固体菌种到液体菌种的栽培技术突破，促使工厂化生产金针菇产业迅速发展。然而，我国金针菇产业发展受菌种制约严重，生产用菌种完全依赖进口，中国食用菌企业每年需要付出高昂的菌种使用费，另一方面，要承担使用日本菌种的风险，近年来工厂化生产发展迅速，市场供给出现过剩，金针菇产业急需转型升级,技术创新。因此研发新菌种，进行品种改良，势在必行。影响金针菇品质的感官性状包括：颜色，菌柄长度，菌盖大小，整齐度，口感等。生理性状包括：生长周期，抗杂能力等。经过大量市场调研表明，人们对黄色金针菇的喜爱远大于白色金针菇。一直以来白色金针菇优选的都是菌柄细长，菌盖小，菇体洁白的菌株，这种白色金针菇便于工厂化管理，出菇整齐，卖相好，然而口感欠佳，市场价格正逐年降低，黄色金针菇由于生产规模小，口感好，市场需求量逐渐增大，导致产品供不应求。金针菇菌柄由于富含纤维素，不易消化，菌盖口感细滑，且便于吸收，所以菌盖较大，菌柄较细的金针菇更受欢迎，但由于菌盖大、菌柄细的金针菇在大规模工厂化管理时不宜控制菌盖大小的整齐度，且菌柄细长会导致菌体长短不一，卖相较差，因此，培育新的利于工厂化管理的黄色金针菇成为金针菇栽培行业产业升级的方向。中国专利文献cn109439649a(申请号201811381522.5)公开了一种黄色金针菇育种的选育方法,在无菌环境下，取出发菌种，接种于菌丝体培养基中，在20℃静置培养8-10d，所述菌丝体培养基每1000ml含有下述重量的原料：麦芽糖30-45g，蛋白胨10-15g、加水定容至1000ml；制备方法为：在锅内装入1000ml水，加入蛋白胨和麦芽糖，然后加水定容至1000ml，装在密封瓶中，在高压灭菌锅内110℃下灭菌处理25分钟。中国专利文献cn107881118a(申请号201711104999.4)公开了一种浅黄色金针菇jk05菌株，保藏编号为cgmccno.13879，以及由所述菌株获得的孢子、菌丝体和子实体，所述菌株在杂交育种中的应用以及所述子实体在食品加工中的应用；该发明还提供了所述菌种的培养方法以及用于培养所述子实体的栽培培养基，用以解决目前黄色金针菇生产中存在的颜色深、品相差，培养过程中“吐水”严重，不适合工厂化立瓶栽培等问题。但上述技术方案菌无法解决黄色金针菇菌盖外形大小、菌柄长短不一造成卖相差的难题。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一株黄色金针菇菌株及其培育方法。该菌株为黄色或淡黄色，菌盖大小0.5-1.0cm之间，生长整齐，生长周期短，抗杂能力强。本发明技术方案如下：一株黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001，2018年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为cgmccno.16881。上述黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001是通过利用三种市场常见的金针菇，通过紫外线--亚硝酸试剂复合诱变育种、杂交育种、拮抗实验等过程优化所选金针菇的生理性状，选育获得的适合工厂化生产的新型黄色菌株。上述黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001液体种子的制备方法，步骤如下：(1)取黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001菌体，接种于pda培养基中，在23～26℃条件下活化至菌丝长满培养基，制得活化菌体；(2)挑取步骤(1)制得的活化菌体，接种于液体培养基中，静置45～50h，然后在23～26℃、180～220r/min条件下培养3～5天，制得一级种子；(3)将步骤(2)制得的一级种子接种于扩大培养基，接种量为5～10％(体积百分比)，在23～26℃条件下培养6～8天，制得液体种子；根据本发明优选的，所述步骤(1)中，pda培养基每升组份如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂17g。根据本发明优选的，所述步骤(2)中，液体培养基与扩大培养基每升组份如下：白砂糖20g、豆面3.3g、硫酸镁0.66g、磷酸二氢钾0.66g。上述黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001的栽培方法，步骤如下：(i)将栽培基质原料与水混合，搅拌，制备含水量65～70％的栽培基质，装瓶，制得接种基质；(ii)将步骤(i)制得的接种基质灭菌，冷却，制得灭菌接种基质；(iii)向步骤(ii)制得的灭菌接种基质中接种上述液体种子，经发菌，制得菌丝长满瓶面发菌基质；(iv)将步骤(iii)制得的菌丝长满瓶面发菌基质经搔菌，加湿，出菇管理。根据本发明优选的，所述步骤(i)中，每瓶的栽培基质盛装量为1300～1400g。根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，基质灭菌条件为-0.055mpa、122℃灭菌90分钟。根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，接种量为25～35ml/瓶根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，发菌条件为：湿度：84.6％-90.1％，二氧化碳浓度：3447ppm～3828ppm，温度：15～19℃，时间20～25天。根据本发明优选的，所述步骤(iv)中，搔菌去除老菌皮厚度为2～3厘米。根据本发明优选的，所述步骤(iv)中，加湿为加水18～22ml/瓶。根据本发明优选的，所述步骤(iv)中，出菇管理条件为：温度6～12℃、湿度85％～90％、光照强度100～150lux、二氧化碳浓度0.11％～0.15％。有益效果本发明首次通过利用三种市场常见的黄色金针菇，经紫外线--亚硝酸试剂复合诱变育种、杂交育种、拮抗实验等过程筛选获得一株适合工厂化生产的黄色金针菇菌株；该黄色金针菇较现有已知品种，拥有更大的菌盖，生长周期短，生物转化率显著高于现有已知的黄色金针菇品种，具有非常广阔的市场前景。附图说明图1是本申请所述黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001出菇后的产品照片；图2是黄色金针菇(flammulinavelutipes)杂交19出菇后的产品照片；图3是黄色金针菇(flammulinavelutipes)鲁金针一号出菇后的产品照片；图4是白色金针菇(flammulinavelutipes)日本白金针出菇后的产品照片；图5是筛选获得的黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001和yh003与杂交19(黄)、鲁金针1号(黄)、日本白金针(白)的拮抗实验结果照片；图6是筛选获得的黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001和yh003的细菌与木霉拮抗实验结果照片；图中：a为杂交19(黄)，b为鲁金针1号(黄)，c为日本白金针(白)。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。生物样品来源黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001，2018年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为cgmccno.16881。杂交19(黄)普通市售产品，可购自万辰生物科技股份有限公司；鲁金针1号(黄)普通市售产品，可购自友和菌业有限公司；日本白金针(白)普通市售产品，可购自友和菌业有限公司。培养基pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，水1l。液体菌种培养基：白砂糖20g，豆面3.3g、硫酸镁0.66g、磷酸二氢钾0.66g，水1l。栽培培养基主要原料比例：米糠35％，玉米芯33％，麸皮9％，棉籽壳6％，啤酒糟6％，大豆皮5％，碳酸钙1％，贝壳粉1％，甜菜渣4％。实施例1黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001，2018年11月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号1.6881。上述色金针菇(flammulinavelutipes)yh001具体筛选过程如下：1、实验材料根据菌丝生长和栽培品比试验，筛选出3个各具特异性和典型农艺性状的菌株(菌丝生活力强、较耐高温、优质、高产)的优良菌株(作为原始育种菌株)，杂交19(黄)、鲁金针1号(黄)、日本白金针(白)，分别编号为a、b、c作为育种材料。表1编号菌株原编号色型来源a杂交19黄色福建b鲁金针1号黄色山东c日本白金针白色日本2、选育方法：将三种初筛菌种进行复壮培养活化：将液体石蜡封存法保存的菌种活化，挑取少量菌种接入pda培养基中，适宜环境下菌丝长满表面，取培养皿中心半径为3cm圆环处菌丝，再转接1-2次。驯化：将活化好的菌种选择几支菌丝生长最旺盛的菌种继续进行纯化培养。重复上述过程，2-3次重复后出菇实验，待菌丝生长旺盛且稳定、出菇实验结果产量稳定即可。选取性状优良的菌株收集担孢子。3、孢子的分离和诱变：担孢子是有性孢子。由担子经核配、减数分裂形成的单倍体细胞。生长在担子的前端，有小梗与担子相连。成熟的担孢子由小梗弹射散出，萌发后形成初级菌丝。分别将a、b、c生长成熟的金针菇鲜子实体于无菌环境下剪去菌柄，有菌褶的一面平贴于灭菌的培养皿上，放置于18～20℃的无菌室，保持环境湿度，过夜收集孢子印。以梯度稀释法将孢子液浓度稀释至约103个/ml，作为复合诱变的材料。试剂的配制亚硝酸的处理方法亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成dna复制紊乱。hno2还能造成dna双链间的交联而引起遗传效应。(1)1mol/lph4.5醋酸缓冲液(2)0.1mol/l亚硝酸钠溶液(3)0.07mol/lph8.6磷酸氢二钠溶液以上试剂用前均要灭菌。处理方法分别取孢子悬液1ml，ph4.5醋酸缓冲液2ml及亚硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025mol/l；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液20ml，使ph下降至ph6.8左右，以终止反应。在亚硝酸处理孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。(亚硝酸不稳定，常在临使用前将nano2加入到醋酸缓冲液(ph4.5)，以生成亚硝酸。)低温、低浓度、长时间处理，存活率高，突变率也高。将处理过的孢子悬液编号为a、b、c备用。5、紫外诱变打开紫外灯(30w)预热20min。为使细胞均匀受照射，取5ml菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作9份，逐一操作。将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射lmin后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为0s、30s、lmin、2min、5min。分别编号为a1、a2、a3、a4、a5；b1、b2、b3、b4、b5；c1、c2、c3、c4、c5、。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。稀释菌悬液按10倍稀释至10-6，从中取出0.lml加入到pda培养基平板中，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。经计算，致死率为83％。6、单单杂交育种观察孢子萌发情况，待培养基上出现肉眼可见微小菌落时，用接种针挑取单个菌落转接于pda平板上，将灭菌的盖玻片斜插入菌落边缘培养基中，在24℃培养箱中培养2～3d，待菌丝爬上盖玻片后取出盖玻片，在普通光学显微镜下观察有无锁状联合，菌丝无锁状联合的为所需单核体。从中筛选出菌丝健壮，长势快，颜色正常的菌株分别为a3、b3、c4。单核菌丝配对杂交将筛选出的金针菇单核体两两配对接入平板内培养，具体方法如下：1号：a3、b3平板2号：a3、c4平板3号：b3、c4平板在无菌条件下用灭菌的吸管吸取直径约0.8cm的菌块于pda平板上培养，两个菌块间距1cm，24℃培养箱培养3～5d。当两个融合的单菌落中间形成突起的融合线时，在无菌环境下挑取融合处菌丝到另一pda培养基上培养，亦将灭菌的盖玻片斜插入菌落边缘培养基中，在24℃培养箱中培养2～3d，待菌丝爬上盖玻片后取出盖玻片，用单核菌丝检验方法检验融合是否成功。结果，2号平板并未发现锁状联合。将有锁状联合的菌丝转接到pda斜面培养基中培养，进行扩繁和菌种保藏。与原种分别进行拮抗实验，1号与a、b菌株，3号与b、c菌株均有明显的拮抗线产生。说明1号和3号菌株均为突变的新型菌株，其中1号由杂交19(黄)、鲁金针1号(黄)担孢子经化学诱变和紫外诱变后杂交得到，3号由鲁金针1号(黄)、日本白金针(白)担孢子经化学诱变和紫外诱变后杂交得到。试生产试验复筛将所得菌种接入液体培养基培养，后进行瓶栽实验，每个杂交种直接用母种接种16瓶，25℃培养室恒温黑暗培养。待菌丝长满菌瓶。所装培养基均为新型棉籽壳培养基，该培养基原料为：米糠35％，玉米芯33％，麸皮9％，棉籽壳6％，啤酒糟6％，大豆皮5％，碳酸钙1％，贝壳粉1％，甜菜渣4％。结果为1号18d，3号19d菌丝长满瓶面。7、新菌株选育结果经进一步栽培出菇试验对比，确定其中yh001、yh003为农艺性状及产量、品质基本符合育种要求的优良菌株。经拮抗试验、酯酶同工酶谱分析、issrdna指纹图谱分析、遗传稳定性等多相测定，初步鉴定均为新菌株。完成了对yh001、yh003菌株的系列栽培试验，明确了其栽培农艺性状。通过栽培试验初步鉴定，其生物转化率较原始菌株均提高15％以上，其yh001达到125％左右、yh003达到110％左右，且优质商品率较高，耐温性、抗病性较强。yh001号子实体金黄色，菇丛密集整齐。菌盖为0.5-1.2cm；菌褶乳黄色，离生；菌柄长13～16cm，粗细均匀，光滑柔韧。菌丝生长最适温度22～28℃，子实体生长温度6～23℃，适宜出菇温度范围较宽，耐高温，比常规黄色品种出菇温度高5℃以上。该菌株出菇较快，生物转化率125％左右；抗细菌性斑点病、木霉菌等病杂菌能力强，较亲本菌株污染率低5％以上。具有两亲本菌株的杂交互补优势。yh003号子实体颜色淡黄色，出菇整齐，菇丛密集。菌盖1-1.5cm，开伞迟缓；菌褶白色，离生；菌柄长14～17cm，粗细均匀，光滑柔韧，近基部有细密、白色绒毛。菌丝生长最适温度22～28℃，子实体生长温度范围5～21℃，较耐高温，比常规浅黄品种出菇温度高4～5℃。该菌株出菇较慢，生物转化率110％左右；抗杂菌能力不强。具体情况如下表2所示：表2菌株子实体颜色发菌周期生长周期子实体性状生物转化率yh001(l-001)黄色2045菌柄粗壮，菌帽较大125％yh001(l-003)黄色2248菌柄细长，菌盖较小110％杂交19黄色2149菌柄细长，菌盖较小80％鲁金针1号黄色2049菌柄粗壮，菌帽较小90％日本白金针白色2352菌柄细长，菌盖较小128％实施例2上述黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001液体种子的制备方法，步骤如下：(1)取黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001菌体，接0.5cm2菌种一块于pda培养基中，在25℃条件下活化至菌丝长满培养基，制得活化菌体；(2)挑取步骤(1)制得的活化菌体，用250ml三角瓶装入100ml液体培养基，在121℃下灭菌30min，接入步骤(1)制得的2cm2左右活化菌体，静置48小时，然后在25℃下震荡培养，摇床转速为200r/min，培养5天；(3)将步骤(2)制得的一级种子600ml接种于700l扩大培养基，在25℃条件下培养7天，制得液体种子；上述黄色金针菇(flammulinavelutipes)yh001的栽培方法：步骤如下：(1)干料搅拌十分钟，加水搅拌四十分钟，至含水量68％左右，传送带传送至装瓶车间；(2)使用自动装瓶设备，每瓶装料1300-1400g；(3)灭菌预热：要提前预热至30℃，让灭菌炉内冷气排出去，避免灭菌炉内过冷，造成过多冷凝水形成；启动灭菌炉；连续抽真空两次，第一次抽到压力达到-0.055mpa时，停止，等压力恢复到0.010mpa时，开始第二次抽真空，使压力达到-0.055mpa；直接升温到122℃灭菌90分钟；排水：从第二次抽真空结束，压力恢复到正压力开始，到灭菌行程结束；闷制：关闭排水阀，闷制20分钟；排气：使灭菌炉内压力降为0；冷却室出炉。(4)液体接种设备，可通过电脑设置喷射时间，接种量为30ml/l，接种接种量30ml/瓶，接种32瓶。(5)发菌培养每天测量空气湿度、瓶间温度和二氧化碳浓度，培养22天菌丝长满瓶面；湿度：84.6％～90.1％；二氧化碳浓度：3447～3828ppm；温度：15～19℃；(6)搔菌搔菌加湿：将发菌培养后菌瓶瓶口处老菌皮挖掉大约2.5厘米左右，喷淋加湿，然后再进行催蕾育菇管理。菌瓶从发菌室通过传送带送入搔菌车间，由搔菌机进行搔菌处理，该搔菌机包含自动开盖装置，瓶盖从这里回收进入装瓶车间，搔菌废弃料回收，定时向外输送。加湿后的菌瓶由地下传输通道进入育菇房。(7)出菇培养温度：控制在6～12℃。湿度：空气相对湿度85％～90％。光照：光照强度为100～150lux，光源位置不能改变，否则子实体散乱。二氧化碳：浓度达0.11％～0.15％可促使菌柄伸长。实施例3与原始菌株拮抗性试验如图5所示，将金针菇原始菌株杂交19、鲁金针1号和日本白金针按上中下的顺序接种于pda培养基上面，并在平板的左右两边接种yh001、yh003菌株，每个接种点相距平板圆心3cm，避光条件下25℃恒温培养箱培养至菌丝生长接触后，再培养7天，观察其拮抗线清晰度及宽度。结果表明，yh001与yh003对比原始菌株拮抗线明显，其中与日本白金针拮抗线最宽，确定与原始菌种遗传特性不同。抗病性实验木霉和假单胞杆菌是金针菇栽培过程中的主要病害。以金针菇的致病菌木霉和假单胞杆菌为指示剂，进行对峙培养，通过观察菌落的生长和拮抗带的宽度来判断yh001抗病能力。菌种活化：将金针菇、木霉、假单胞杆菌的菌株分别放在pda培养基中以25℃的温度进行活化培养，长满培养皿后作为备用。在菌种使用前，用直径0.5cm的打孔器制备菌饼。抗木霉和假单胞杆菌能力测定方法：使用直径90mm的定量培养皿，每皿用定量蠕动泵定量加入40mlpda培养基凝固。相距中心2cm的上下两个方向分别接入直径0.5cm的金针菇yh001、yh003的菌饼并25℃培养3天，后于左右两个方向分别接入木霉、假单孢杆的菌饼，对峙培养4天后观察测量拮抗线的宽度、菌落生长宽度，并且持续观察抑制带的颜色、大小变化。菌株抗病情况如表3所示：表3结果见上表，结果表明，yh001对比yh003具有较强的抗木霉和假单胞杆菌能力。金针菇在工厂化栽培过程中，容易爆发细菌病害，出现烂菇病，而yh001菌株抗细菌能力强，可以减轻病害，因此有广阔的应用前景。出菇后的产品照片如图1所示。对比例1采用如实施例2所述的方式进行杂交19(黄)的栽培，栽培结果如图2所示。对比例2采用如实施例2所述的方式进行鲁金针1号(黄)的栽培，栽培结果如图3所示。对比例3采用如实施例所述的方式进行日本白金针(白)的栽培，栽培结果如图4所示。当前第1页12