一种高效防控蔬菜灰霉病等病害的磺酰化壳聚糖微胶囊制剂的制作方法

本发明涉及一种高效防控蔬菜灰霉病等病害的磺酰化壳聚糖微胶囊制剂，属于农药制剂学研究领域。
背景技术：
：目前，在大棚温室果蔬生产过程中，因致病性真菌引起的病害尤为严重，而传统化学农药大量、频繁的使用所造成的果蔬、粮食中农药残留超标以及土壤微环境恶化等问题，已引起了社会的广泛关注，因此，研究及开发可替代化学农药的微生物制剂或生物农药具有巨大的市场潜力和应用前景。利用有益微生物进行生物防治是控制病害、减少化学污染的重要途径。其中研究比较深入的是假单胞菌属(pseudomonas)和芽孢杆菌属(bacillus)的生防细菌。假单胞杆菌是一种广泛分布于植物根际的革兰氏阴性细菌。这类细菌因其繁殖量大、与植物根围适应性好而作为植物病害生防菌得到了广泛的研究和应用。一些农业生产中危害严重的土传病害，如小麦全蚀病(gaeumannomycesgraminis)、烟草黑根腐病(thielaviopsisbasicola)、棉花立枯病(rhizoctoniasolani)以及番茄青枯病(ralstoniasolanacearum)等因荧光假单胞菌(p.fluorescens)生防菌株的应用而得到有效控制。其生防机制主要涉及5个方面：(1)抗生作用，即产生抗生性次生代谢产物，抑制病菌生长；(2)竞争作用，包括位点和营养竞争；(3)菌寄生；(4)抗菌蛋白及胞壁降解酶指分泌对病菌有毒的抗菌蛋白或多肽及分解病菌细胞壁的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶等；(5)诱导抗性，即菌体或其代谢物诱导植株产生抗性，抵抗病菌的侵染。对于一种生防菌来说，其生防作用是一种或两种以上综合的效应。这5种作用中，由于抗生代谢物(抗生素)和抗菌蛋白等，可以通过微生物发酵提取，制成大量无活体的生物农药，因而具有更广阔的应用前景，如井岗霉素、阿维菌素、申嗪霉素、bt等。随着时代的发展，我国也大力提倡研发环保新型剂型，一些环保新剂型在化学农药中的产量已在逐步上升，研究应用生物农药的环保新型剂型已是时代发展的必然趋势。壳聚糖作基质载体材料，在纳米载体的制备中已经受到越来越多的关注。壳聚糖作为药物载体不仅可以控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用、提高疏水性药物的稳定性、改变给药途径，还可以大大加强制剂的靶向给药能力，被认为是一种最具希望的高分子药物跨膜输送载体。目前，各种壳聚糖及其衍生物已被用于制备纳米载药体系。随着研究的深入，以壳聚糖为基材的纳米粒子制备方法不断发展，极大地丰富了纳米载药体系的种类和功能。但壳聚糖分子间或分子内氢键作用强，溶解性能差，导致其表面吸附能力差，液体表面张力弱，更不能形成大分子胶束。壳聚糖只能溶于酸性的水溶液，这在一定程度上限制壳聚糖的应用。如何使壳聚糖溶于中性或碱性水溶液，并适合负载不同类型的药物，这成为制备壳聚糖纳米载药体系的关键问题。壳聚糖改性的重要目的是改善其在水中的溶解性能。赋予壳聚糖及其衍生物一些新颖的理化特性可以丰富它们作为功能材料的用途，这也是近些年来研究的热点。壳聚糖衍生物的胶束具有可控的纳米尺寸，稳定性又远远超过脂质体或纳米乳之类材料，而且可生物降解的聚合物胶束没有脂质体常见的毒性，是增溶疏水农药的理想载体。合成出粒径较小、临界胶束浓度较低的壳聚糖衍生物纳米胶束，从而获得能显著延长农药缓释时间的纳米载体，制备出的壳聚糖衍生物胶束显著提高，将更适合作为农药的载体系统。灰霉病是温室大棚蔬菜经常发生且危害严重的一种病害，番茄、黄瓜等蔬菜受害一般可造成减产20％～30％，严重时可达50％以上。因为蔬菜大棚内冬春季气温低、湿度大，此病害可造成蔬菜叶片枯死，落花落果，对保护地蔬菜的产量和品质影响很大，给菜农造成较大经济损失。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效防控蔬菜灰霉病等病害的磺酰化壳聚糖微胶囊制剂，该制剂用于防治蔬菜灰霉病等病害，持效期长，对环境污染小，施药简便。本发明的制剂由藤黄绿脓菌素、丁子香酚作为有效成分，通过磺酰化壳聚糖制备成微胶囊剂。一种高效防控蔬菜灰霉病等病害的磺酰化壳聚糖微胶囊制剂，其有效成分为藤黄绿脓菌素和丁子香酚，其中藤黄绿脓菌素化学名为2,3-二氯-5-[2',6'-二羟基苯甲酰基]吡咯，其化学结构式为：微胶囊制剂中藤黄绿脓菌素占所述微胶囊制剂总重量的重量百分比为0.1～10％，丁子香酚占所述微胶囊制剂总重量的重量百分比为0.1～10％；制剂中有效成分藤黄绿脓菌素与丁子香酚的重量配比为1:3、3:5、5:5、5:3或5:1，其中制剂中有效成分藤黄绿脓菌素与丁子香酚的最佳配比为3:5。磺酰化壳聚糖的合成、结构鉴定：合成分三步进行，首先在壳聚糖的氨基上接枝强疏水性的十八醇疏水甘油醚后，再进行磺酰化，制备两亲性壳聚糖衍生物载体，合成路线如下。①十八烷氧基缩水甘油醚的合成：为获得较高产率的十八烷基缩水甘油醚，以反应物十八醇与环氧氯丙烷的摩尔比、naoh用量、反应时间、反应温度为试验因素，产率为考察指标，进行l9(43)的正交设计，十八烷氧基缩水甘油醚的合成路线为：其中：ctmab为十六烷基三甲基溴化铵；toluol：甲苯。②n-(3-十八烷氧基-2-羟基丙基)壳聚糖的制备：取6.0g高度脱乙酰壳聚糖，以120ml2％乙酸溶解(20滴，100ml)，用20％naoh溶液沉淀(40ml)，将沉淀搅碎，抽虑，去离子水冲洗，使ph接近7.0，挤压干水份，得疏松溶胀的壳聚糖并转入250ml三口瓶。加入18.0g十八烷氧基缩水甘油醚(oge)，加入70ml异丙醇作为反应介质，63℃保温反应3h，过滤，滤饼以20ml甲苯洗涤4次，除去未反应的十八烷氧基缩水甘油醚，得到纯净的n-(3-十八烷氧基-2-羟基丙基)壳聚糖，60℃真空干燥12h备用，n-(3-十八烷氧基-2-羟丙基)壳聚糖的合成路线为：其中：isopropano为异丙醇。③n-(3-十八烷氧基-2-羟丙基)-o-磺酰基壳聚糖制备：取35ml甲酰胺溶剂于三口瓶中，在冰水浴条件下逐滴加入5ml氯磺酸，取2.0g第二步产物加入三口瓶中，升高温度至68℃，反应6h后，停止反应，倒出以20％naoh调节ph至略偏碱性，以丙酮沉淀，抽滤，滤饼以热的无水乙醇(60℃)洗涤2～3次，60℃真空干燥得微黄色粉末磺酰化壳聚糖(noscs)，n-(3-十八烷氧基-2-羟丙基)-o-磺酰基壳聚糖的合成路线为：微胶囊剂的制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚的有效组合物于烧瓶中，按照加入丙酮和乙醇混合溶剂，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的纳米载体磺酰化壳聚糖，以1滴/s的速度逐滴加40ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h以上)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮进行洗脱(洗脱3次)过滤。收集滤液定容之后进行高效液相色谱法进行检测分析。上层滤渣收集后在除水干燥，干燥后得到所制备的微胶囊剂。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明制备的壳聚糖装载农药的微胶囊制剂具有高度的环境相容性，有助于提高施药的靶向性和能有效控制特性的智能性，避免活性成分的过快降解、延长持效期、降低施药量、提高防治效果，对生物农药的研制和保障农产品安全工程建设具有重大意义。附图说明图1是本发明实施例1制备的微胶囊剂的电镜图片。具体实施方式下面的实施例是对本发明技术方案进一步说明，但本发明的内容并不局限于此(以下实施例所有组成均按重量百分比计)。实施例1、质量浓度0.6％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，微胶囊剂中藤黄绿脓菌素的质量浓度0.1％、丁子香酚的质量浓度0.5％。制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素0.125g、丁子香酚0.75g的有效组合物于烧瓶中，加入丙酮和乙醇混合溶剂100ml(丙酮与乙醇的体积比为1:1)，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的108g磺酰基壳聚糖纳米载体，以1滴/s的速度逐滴加40ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂丙三醇5ml，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮20ml后进行洗脱(洗脱3次)再过滤。上层滤渣收集后再除水干燥，干燥后得到100g质量浓度为0.6％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂中：藤黄绿脓菌素的质量为0.1g，丁子香酚的质量为0.5g，微胶囊剂的电镜图片见图1。实施例2、质量浓度0.8％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，微胶囊剂中藤黄绿脓菌素质量浓度0.3％、丁子香酚质量浓度0.5％。制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素0.375g、丁子香酚0.75g的有效组合物于烧瓶中，加入丙酮和乙醇混合溶剂100ml(丙酮与乙醇的体积比为1:1)，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的108g磺酰基壳聚糖纳米载体，以1滴/s的速度逐滴加40ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂丙三醇5ml，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮20ml后进行洗脱(洗脱3次)再过滤。上层滤渣收集后再除水干燥，干燥后得到100g质量浓度为0.8％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂中：藤黄绿脓菌素的质量为0.3g，丁子香酚的质量为0.5g。实施例3、质量浓度1.0％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，微胶囊剂中藤黄绿脓菌素质量浓度0.5％、丁子香酚质量浓度0.5％。制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素0.625g、丁子香酚0.75g的有效组合物于烧瓶中，加入丙酮和乙醇混合溶剂100ml(丙酮与乙醇的体积比为1:1)，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的108g磺酰基壳聚糖纳米载体，以1滴/s的速度逐滴加40ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂丙三醇5ml，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮20ml后进行洗脱(洗脱3次)再过滤。上层滤渣收集后再除水干燥，干燥后得到100g质量浓度为1.0％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂中：藤黄绿脓菌素的质量为0.5g，丁子香酚的质量为0.5g。实施例4、质量浓度0.8％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，微胶囊剂中藤黄绿脓菌素质量浓度0.5％、丁子香酚质量浓度0.3％。制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素0.625g、丁子香酚0.45g的有效组合物于烧瓶中，加入丙酮和乙醇混合溶剂100ml(丙酮与乙醇的体积比为1:1)，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的108g磺酰基壳聚糖纳米载体，以1滴/s的速度逐滴加40ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂丙三醇5ml，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮20ml后进行洗脱(洗脱3次)再过滤。上层滤渣收集后再除水干燥，干燥后得到100g质量浓度为0.8％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂中：藤黄绿脓菌素的质量为0.5g，丁子香酚的质量为0.3g。实施例5、质量浓度0.6％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，微胶囊剂中藤黄绿脓菌素质量浓度0.5％、丁子香酚质量浓度0.1％。制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素0.625g、丁子香酚0.15g的有效组合物于烧瓶中，加入丙酮和乙醇混合溶剂100ml(丙酮与乙醇的体积比为1:1)，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的108g磺酰基壳聚糖纳米载体，以1滴/s的速度逐滴加40ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂丙三醇5ml，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮20ml后进行洗脱(洗脱3次)再过滤。上层滤渣收集后再除水干燥，干燥后得到100g质量浓度为0.8％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂中：藤黄绿脓菌素的质量为0.5g，丁子香酚的质量为0.1g。实施例6、质量浓度10.1％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，微胶囊剂中藤黄绿脓菌素质量浓度0.1％、丁子香酚质量浓度10.0％。制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素0.125g、丁子香酚15g的有效组合物于烧瓶中，加入丙酮和乙醇混合溶剂150ml(丙酮与乙醇的体积比为1:1)，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的130g磺酰基壳聚糖纳米载体，以1滴/s的速度逐滴加55ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂丙三醇8ml，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮20ml后进行洗脱(洗脱3次)再过滤。上层滤渣收集后再除水干燥，干燥后得到100g质量浓度为10.1％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂中：藤黄绿脓菌素的质量为0.1g，丁子香酚的质量为10.0g。实施例7、质量分数10.1％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，微胶囊剂中藤黄绿脓菌素质量浓度10.0％、丁子香酚质量浓度0.1％。制备方法：准确称取待装载的有效成分藤黄绿脓菌素12.5g、丁子香酚0.15g的有效组合物于烧瓶中，加入丙酮和乙醇混合溶剂150ml(丙酮与乙醇的体积比为1:1)，磁力搅拌下溶解有效成分藤黄绿脓菌素、丁子香酚后加入上述所制备的130g磺酰基壳聚糖纳米载体，以1滴/s的速度逐滴加55ml三蒸水，继续搅拌4h使溶剂充分挥发，加入抗冻剂丙三醇8ml，然后转移到培养皿里，减压真空除气泡及未挥发的有机溶剂，随后转入-80℃冰箱预冻(2h)。样品放入冷冻干燥机中进行干燥，加入丙酮20ml后进行洗脱(洗脱3次)再过滤。上层滤渣收集后再除水干燥，干燥后得到100g质量浓度为10.1％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂，藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂中：藤黄绿脓菌素的质量为10.0g，丁子香酚的质量为0.1g。实施例8、室内抑菌活性试验把藤黄绿脓菌素原药和丁子香酚原药分别配制成20μg/ml的母液，置于4℃冰箱中备用。母液再用适量的无菌水溶解后，在单剂室内抑菌活性测定的基础上，按藤黄绿脓菌素与丁子香酚母液的质量比分别为1∶5、3∶5、5∶5、5∶3、5∶1进行配比，采用生长速率抑制法测定混剂的抑制率。在初筛的基础上，将藤黄绿脓菌素、丁子香酚母液及5种混配组合各设置5个梯度的质量浓度。以药剂有效成分在培养基中的浓度为毒理试验浓度，配制成含有药剂的马铃薯蔗糖琼脂培养基。采用无菌水作空白对照ck。测试方法将保留的番茄灰霉病病菌转接到psa平皿中，在25℃活化72h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5mm的菌饼，并转接到配比稀释配制的含药psa列平皿和空白对照平皿中。每个处理重复3次。于25℃培养5d，待对照中菌落约长至平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。以药剂浓度对数值为自变量x、菌丝生长平均抑制率的概率值为因变量y，计算出毒力回归方程和相关系数r，根据回归方程求出各药剂的抑制中浓度ec50值及共毒系数，结果见表1。表1各药剂对番茄灰霉病的室内毒力测定(5d)由表1可以看出，藤黄绿脓菌素、丁子香酚、藤黄绿脓菌素与丁子香酚各个配比混配对番茄灰霉病的抑制中浓度ec50值按序(1:5、3:5、5:5、5:3和5:1)分别为1.63、1.86、2.56、3.34和5.90μg/ml；藤黄绿脓菌素与丁子香酚各个配比混配的共毒系数按序(1:6、1:4、1:2、1:1和2:1)分别为133.05、149.01、129.36、123.62和118.56。藤黄绿脓菌素与丁子香酚配比为1:5、3:5、5:5和5:3具有增效作用，其中配比为3:5时增效作用最明显。实施例9、田间药效试验试验田在江苏省扬州市邗江区沙头镇省现代农业产业园的番茄温室大棚内，前茬为辣椒，试验地土壤肥沃，沙壤质褐土，ph值7.2，有机质含量2.5％(质量浓度)。番茄灰霉病常年发生。各处理药剂分别为空白对照组、对照1(质量浓度0.5％藤黄绿脓菌素悬浮剂)、对照2(质量浓度0.3％丁子香酚可溶性液剂)、实施例1(质量浓度0.6％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂)、实施例2(质量浓度0.8％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂)、实施例3(质量浓度1.0％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂)、实施例4(质量浓度0.8％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂)和实施例5(质量浓度0.6％藤黄绿脓菌素·丁子香酚微胶囊剂)。施药时间为2019年7月15日，在番茄结果期灰霉病发生初期施药，东西两端各设4行的保护行，所有试验小区的栽培管理条件一致，能满足试验要求。每个小区面积30m2，3次重复，采用随机区组排列。药后14d进行调查统计，每小区采用五点取样法，每点调查2株，每株自上至下调查10片叶，调查各级病叶片数量，并计算各处理对番茄灰霉病的防控效果。各制剂对番茄灰霉病的防控效果见表2。表2各制剂对番茄灰霉病的防控效果(14d)各处理防效效果(％)对照组/0.5％藤黄绿脓菌素悬浮剂66.43±1.550.3％丁子香酚可溶性液剂72.41±1.81实施例187.52±1.93实施例294.77±1.71实施例398.17±1.03实施例492.65±0.97实施例584.51±1.14当前第1页12