利用非渗透抗冻剂和开放式载具冷冻保存石斑鱼胚胎方法与流程

技术领域：

本发明属于低温生物学中鱼类胚胎超低温保存技术领域，具体地涉及一种利用非渗透抗冻剂和开放式载具冷冻保存石斑鱼胚胎方法。

技术背景：

鱼类胚胎冷冻保存研究至今只有约60年的历史。由于鱼类胚胎体积大(1-7mm)，细胞通透性低，双层膜，卵黄含量高，冷冻时极易形成内部冰晶，冷冻损伤敏感性高，其冷冻保存较鱼类精子和哺乳动物胚胎困难，仍处于探索研究阶段，尚未能应用于实际生产和种质资源库建立。

目前鱼类胚胎冷冻保存普遍使用0.25ml细管为胚胎冷冻主要承载工具，含有高浓度混合抗冻剂的玻璃化溶液为冷冻保护剂，一般采用逐步添加玻璃化液的方式进行渗透处理。但由于细管作为载具，每管最多能盛装20-25枚胚胎，单位时间内胚胎冷冻数量有限，不能进行大批量冷冻实验，限制了鱼胚冷冻保存胚胎成活数量；而且一般冷冻保护剂要想形成玻璃化的浓度至少达到40％-60％(华泽钊,任禾盛.低温生物医学技术.北京:科学出版社,1994)，当胚胎暴露于高浓度抗冻剂时间过长时，会对胚胎结构和功能造成明显损害，导致胚胎成活率和孵化率降低，甚至导致玻璃化冷冻后成活胚胎因畸形而无法继续发育和培养。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用非渗透抗冻剂和开放式载具，进行快速冷冻保存云纹石斑鱼的方法，该方法可以提高胚胎的冷冻保存效果，并且可以大大缩短冷冻过程所需时间，提高单位时间内胚胎冷冻数量。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种利用非渗透抗冻剂和开放式载具冷冻保存石斑鱼胚胎方法，所述方法包括以下步骤：

(1)非渗透性抗冻剂配制：以高温灭菌过的过滤海水为基础溶液配制1mol/l非渗透性糖溶液；所述的糖为蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的一种；

(2)石斑鱼胚胎的收集和培养：获得云纹石斑鱼受精卵，将受精卵在22-24℃海水培养，等胚胎发育至肌节期、尾芽期或胚体转动期进行冷冻保存；

(3)开放式载具制备:准备40-50ml左右塑料管和筛绢网，塑料管高100-116mm，直径28-30mm，塑料管两端开口，一端用筛绢网封口；

进一步，所述的筛绢网的网目直径为0.180mm，规格为60×60mm。

(4)胚胎冷冻：将配制好的非渗透性糖溶液加入培养皿中，并放置一定数量云纹石斑鱼胚胎，处理4-10分钟；之后将处理胚胎倒入所述步骤(3)的开放式载具，底部开口朝上垂直浸入液氮中冷冻保存；若长期保存，在冷冻20分钟后，将另一端开口封堵，置于液氮罐中长期存储；

(5)胚胎解冻和培养：将高温灭菌过的过滤海水置于玻璃烧杯中，并将过滤海水温度控制在25-35℃；将所述步骤(4)中含冷冻胚胎的开放式载具置于过滤海水中，轻轻搅动并解冻；然后，将烧杯放置于26℃的生化培养箱中，半小时后更换海水，继续培育。

本发明与现有技术相比的有益效果如下：

(1)本发明使用的抗冻剂只有非渗透性的蔗糖、海藻糖或葡萄糖，成份简单、无毒性，不会对鱼类胚胎细胞造成“溶液损伤”。其它鱼类胚胎冷冻保存液中含有渗透性较强的小分子抗冻剂(二甲基亚砜、甲醇等)，由于其毒性较强，不可避免的对胚胎造成“溶液损伤”，从而降低冷冻胚胎存活率。

(2)冷冻保存胚胎数量大，目前常用的鱼类胚胎冷冻保存开放式载具一般为0.25ml麦管，冷冻保存胚胎数量有限，每次只能冷冻保存20粒胚胎，冷冻效率低，本发明方法可以冷冻保存胚胎1000多粒，极大提高了冷冻保存效率。

(3)降温和解冻速率快，上下贯通的胚胎开放式载具可以使胚胎表面直接与液氮接触，达到快速降温的效果；在解冻时也可以直接使胚胎与25-35℃海水接触，克服了塑料麦管等冷冻载具导温效率低的缺点。

(4)冷冻胚胎成活率和孵化率高，利用本发明方法冷冻保存云纹石斑鱼胚胎成活率可达到31.30％，孵化率可达到41.28％；目前报道的成活率为5.15％(tianetal.,2018,theriogenology)。

附图说明：

图1开放式载具制作示意图；

图2开放式载具冷冻胚胎操作示意图。

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实例1：非渗透性抗冻剂处理胚胎成活率

利用过滤灭菌海水分别配制1mol/l乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、黄芪多糖、蔗糖、海藻糖，分别处理云纹石斑鱼4-6肌节期、16肌节期、尾芽期、孵化前期胚胎60min，每个样本处理300粒胚胎，重复3次。处理后胚胎在26℃培养箱中培养。胚胎培养条件：海水温度26.71±1.26℃，溶解氧6-10mg/l，ph＝7.45～8.49，海水盐度33.03±0.75‰。胚胎培养5小时后统计胚胎的成活率。

结果显示，利用蔗糖、海藻糖和葡萄糖处理胚胎成活率和孵化率较高，具体结果见表1。

表1七种非渗透性冷冻保护剂处理后的不同时期云纹石斑鱼胚胎的成活率和孵化率

实例2：非渗透性抗冻剂浓度和处理时间

根据实例1中表1结果，选择蔗糖作为非渗透性抗冻剂。用灭菌过滤海水为基础溶液配0.5-2m的蔗糖溶液。在立体显微镜下选择肌节期和尾芽期发育阶段的云纹石斑鱼胚胎进行处理。在室温下，将胚胎置于含不同摩尔浓度的蔗糖溶液的培养皿中平衡4-9分钟。使用显微镜观察处理过的胚胎的形态，具体结果见表2，利用1m蔗糖处理肌节期胚胎6-7min、处理尾芽期胚胎5-7min，70-80％的胚胎呈现出脱水状态，胚胎显现凹球体，此时为最适处理条件。

表2不同浓度蔗糖液处理不同时间后的云纹石斑鱼胚胎形态统计

“+”，显微镜下70-80％的胚胎呈现出脱水状态，圆形胚胎体积的一半凹球体，此时摩尔浓度和处理时间为最适条件；

“-”,非最适条件。

实例3：云纹石斑鱼肌节期胚胎冷冻保存

具体方法如下：

(1)非渗透性抗冻剂配制：以高温灭菌过的过滤海水为基础溶液配制1mol/l蔗糖溶液；

(2)石斑鱼胚胎的收集和培养：人工繁殖云纹石斑鱼受精卵，将受精卵在22-24℃海水培养，利用倒置生物显微镜观察胚胎发育，等发育至肌节期进行冷冻保存；

(3)开放式载具制备：准备50ml锥形底离心管和0.180mm筛绢网。首先，切割掉离心管底端的锥形部分，约3cm高。再将离心管盖中间切割出一个直径为25mm的圆形开口，并将60×60mm的0.180mm筛绢网居中放置在瓶体和盖子之间拧紧，如图1所示；

(4)胚胎冷冻：将配制好的蔗糖液加入培养皿中，并放置一定数量云纹石斑鱼胚胎，处理4-10分钟。之后将培养皿中的胚胎倒入所述步骤(3)中制备好的胚胎冷冻开放式载具，开口朝上垂直浸入液氮(-196℃)中冷冻保存24小时，如图2所示。若长期保存，可在20分钟后，将所述步骤(3)中切割掉的锥形部分倒置插入开放式载具底部开口，封口后置于液氮罐中长期存储；

(5)胚胎解冻：将高温灭菌过的过滤海水置于玻璃烧杯中，用水浴锅将烧杯内水温控制在26℃。将所述步骤(4)中含冷冻胚胎的开放式载具置于烧杯中，轻轻搅动水体直至水中没有明显块状物。然后，将烧杯从水浴锅中取出，放于温度设置为26℃的生化培养箱中，半小时后更换海水。

将烧杯中的胚胎转移至8l透明培养箱中，采用微充气、微流体水培养，水温控制在26±1℃，ph为7.45～8.4，盐度为30‰，溶解氧为6-10mg/l。云纹石斑鱼肌节期胚胎冷冻保存结果具体见表3。

表3云纹石斑鱼肌节期胚胎的冷冻成活统计

实例4：云纹石斑鱼尾芽期胚胎冷冻保存

(6)在立体显微镜下选择云纹石斑鱼尾芽期胚胎进行冷冻保存。用高温灭菌的过滤海水为基础溶液，配1m的蔗糖溶液。将胚胎在室温下置于含1m蔗糖溶液的培养皿中分别平衡5、6和7min后，将胚胎置于自制开放式载具中，直接插入液氮(-196℃)中，在冷冻20分钟后，将切割掉的锥形部分倒置插入开放式载具底部开口，封口后置于液氮罐中长期存储；其它步骤同实施例3。

将高温灭菌过的过滤海水置于玻璃烧杯中，设置水浴锅温度为26℃，待烧杯内外水温一致时，将含冷冻胚胎的开放式载具置于烧杯中，轻轻搅动水体直至水中没有明显块状物。然后，将烧杯从水浴锅中取出，放于温度设置为26℃的生化培养箱中。半小时后，将烧杯中的胚胎转移至8l透明培养箱中，采用微充气、微流体水培养，水温控制在26±1℃，ph为7.45～8.4，盐度为30‰，溶解氧为6-10mg/l。云纹石斑鱼尾芽期胚胎冷冻保存结果具体见表4。

表4云纹石斑鱼尾芽期胚胎的冷冻成活统计

实例5：利用麦管冷冻保存云纹石斑鱼尾芽期胚胎

在立体显微镜下选择云纹石斑鱼尾芽期胚胎进行冷冻保存。用高温灭菌的过滤海水为基础溶液，配制35％pmg3s玻璃化液。将胚胎在室温下置于含35％pmg3s溶液的培养皿中，用五步法每步分别平衡5、6和7min后，将胚胎吸入0.25ml的麦管中，两端用封口器封口后，直接插入液氮(-196℃)中冷冻保存24小时。

将高温灭菌过的过滤海水置于玻璃烧杯中，设置水浴锅温度为26℃，待烧杯内外水温一致时，将含冷冻胚胎的麦管置于烧杯中，轻轻搅动直至解冻，剪开麦管将胚胎释放胚胎。然后，将烧杯从水浴锅中取出，放于温度设置为26℃的生化培养箱中。半小时后，将烧杯中的胚胎转移至8l透明培养箱中，采用微充气、微流体水培养，水温控制在26±1℃，ph为7.45～8.4，盐度为30‰，溶解氧为6-10mg/l。云纹石斑鱼尾芽期胚胎利用麦管冷冻保存结果具体见表5。

表5利用麦管冷冻保存云纹石斑鱼尾芽期胚胎成活率统计

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。