丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺的制作方法

文档序号:11217868

本发明涉及一种丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺。



背景技术:

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)又名赤参,紫丹参,红根等,是唇形科鼠尾草属多年生草本植物。丹参作为一传统中药在我国沿用已久,始载于《神农本草经》,被列为上品。《本草经疏》、《本草纲目》中都有记载。具有活血散淤、消肿止血、消炎止痛、调经止痛、扩张冠状动脉、改善心肌缺血状况、降低血压、安神静心、降血糖和抗菌等功效;对月经不调,经闭痛经,症瘕积聚,胸腹刺痛,热痹疼痛,疮疡肿痛,心烦不眠,肝脾肿大,心绞痛等病症有一定的疗效。此外,丹参还具有抗血小板凝聚、降低血液黏度及调节内外凝血系统的功能,是一种安全又可靠的治疗心脏血管疾病的天然中药。丹参主要含两类成分:一为脂溶性的二萜类化合物,二为水溶性的多聚酚酸类成分。

丹参的繁殖方式一般为种子繁殖和分根繁殖,种子萌发率比较低,分根繁殖出芽率及长势比较低。通过现代实验技术组织培养技术,又叫离体培养,指从丹参植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞,原生质体等,通过无菌操作,在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株的技术,在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养,愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

随着丹参研究的更加深入,需要进行合适的愈伤组织诱导,更好的实现组织培养技术繁殖丹参,而现有的丹参组织培养其长势、大小、颜色以及质地等都未达到最佳,并且影响后续培养的效果。



技术实现要素:

针对上述存在的问题,本发明旨在提供丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺,本发明通过优化丹参组织培养过程中愈伤组织的诱导工艺,提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地等。NAA和2,4-D浓度降低,有利于愈伤组织诱导率增加,培养条件优化,愈伤组织增值生长旺盛,整体愈伤组织诱导技术工艺优化,使得诱导出的愈伤组织质地紧密,颜色黄绿色,用来转接继代培养比较适合。

为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下:

丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺,包括以下步骤:

1)外植体取样:取丹参嫩幼叶片,进行筛分,通过清洗设备对丹参嫩幼叶片进行清理,后用纯水冲洗干净;

2)外植体消毒:冲洗干净的外植体放置于75%酒精中浸泡10-20s,匀速震荡,接着转入无菌水中冲洗3次,再用0.1%升汞浸泡消毒4-6min,过程中继续震荡,然后转入无菌水中冲洗3-5遍;

3)外植体处理:将消毒后的丹参叶片外植体放置于无菌接种盘上,用无菌解剖针固定,经无菌解剖刀片切成小碎片,避开叶柄和主叶脉;

4)外植体接种:采用无菌镊子将上述小碎片镊起,放置于MS固体培养基上,其培养基成分为MS+1.0mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+0.8mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+5.26g/L琼脂,pH5.8,高压灭菌;

5)外植体培养:接种后的外植体放置于培养箱中进行愈伤组织诱导,15天后开始统计愈伤组织诱导率、质地、颜色和生长情况。

作为优选,所述步骤(1)中的清洗设备包括清洗槽、进水管、出水管以及旋转清洗轴,所述旋转清洗轴设置在所述清洗槽内,在所述旋转清洗轴的外周上等间距设置若干清洗软毛刷。

作为优选,在清洗之前对清洗软毛刷进行消毒处理。

作为优选,所述步骤(3)中的经无菌解剖刀片切成0.5cm×0.5cm大小的小碎片。

作为优选,所述步骤(5)中的培养条件为:培养温度(27±0.5℃),光照时间12-14h,光强3000-4000Lx,T5植物培养灯管。

本发明的有益效果是:与现有技术相比,本发明的改进在于提出丹参愈伤组织诱导工艺,以及对该诱导工艺中培养基成分以及培养条件的改进,使得通过优化丹参组织培养过程中愈伤组织的诱导工艺,提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地等。NAA和2,4-D浓度降低,有利于愈伤组织诱导率增加,培养条件优化,愈伤组织增值生长旺盛,整体愈伤组织诱导技术工艺优化,使得诱导出的愈伤组织质地紧密,颜色黄绿色,用来转接继代培养比较适合。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案,下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例:,丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺,包括以下步骤:

1)外植体取样:取丹参嫩幼叶片,进行筛分,通过清洗设备对丹参嫩幼叶片进行清理,后用纯水冲洗干净;

清洗设备包括清洗槽、进水管、出水管以及旋转清洗轴,所述旋转清洗轴设置在所述清洗槽内,在所述旋转清洗轴的外周上等间距设置若干清洗软毛刷,在清洗之前对清洗软毛刷进行消毒处理,同时也可对旋转清洗轴进行消毒处理,旋转清洗轴由电机控制旋转,在清洗槽的水平面上设置格栅,格栅的口径大小小于丹参嫩幼叶片,旋转清洗轴设置在格栅下面,格栅的一端铰接在清洗槽上,另一端可以任意上下移动,使得丹参嫩幼叶片更加方便的浸入到清洗槽内,这样在清洗的过程中就能将丹参嫩幼叶片全部浸没在水中进行清洗,而且在清洗的过程中配合软毛刷的作用使得清洗更加的彻底,为后续的无菌、无毒培养提供基础;

2)外植体消毒:冲洗干净的外植体放置于75%酒精中浸泡10-20s,过程中不断匀速震荡,增加酒精与外植体的接触面积;接着转入无菌水中冲洗3次,再用0.1%升汞浸泡消毒4-6min,过程中继续匀速震荡,然后转入无菌水中冲洗3-5遍;

现有技术是75%酒精浸泡0.5-1min,之后没有转入无菌水中,0.1%升汞浸泡消毒10-13min,消毒过程优化酒精与升汞消毒时间,降低了外植体污染和褐化的概率;

3)外植体处理:将消毒后的丹参叶片外植体放置于无菌接种盘上,用无菌解剖针固定,经无菌解剖刀片切成0.5cm×0.5cm大小的小碎片,避开叶柄和主叶脉,避开叶柄和主叶脉可以提高愈伤组织诱导的概率;

4)外植体接种:采用无菌镊子将上述小碎片镊起,放置于MS固体培养基上,其培养基成分为MS+1.0mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+0.8mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+5.26g/L琼脂,pH5.8,高压灭菌;培养基成分与现有的愈伤组织诱导技术有区别,是提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地的主要因素;

5)外植体培养:接种后的外植体放置于培养箱中进行愈伤组织诱导,15天后开始统计愈伤组织诱导率、质地、颜色和生长情况;培养条件:培养温度(27±0.5℃),光照时间12h-14,光强3000-4000Lx,T5植物培养灯管,培养条件优化,愈伤组织增值生长旺盛,使得诱导出的愈伤组织质地紧密,颜色黄绿色,用来转接继代培养比较适合。

与现代组织培养中愈伤组织诱导培养相比,本发明的优势在于,

本发明通过优化丹参组织培养过程中愈伤组织的诱导工艺,提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地等。NAA和2,4-D浓度降低,有利于愈伤组织诱导率增加,培养条件优化,愈伤组织增值生长旺盛,整体愈伤组织诱导技术工艺优化,使得诱导出的愈伤组织质地紧密,颜色黄绿色,用来转接继代培养比较适合。

在具体实验过程中,本发明以丹参叶片为外植体,通过不同激素不同的浓度梯度得到愈伤形成的最佳激素浓度配比。

实验过程中,单独使用NAA诱导愈伤形成,结果发现低浓度的NAA(低于0.8mg/L)15天后观察发现愈伤形成速度慢,仅叶片边缘形成少量愈伤,而高浓度的NAA(高于0.8mg/L)虽然能够形成完整愈伤,但是愈伤生长状况较差,且长出许多黑色不定根,不利于后期的诱导分化;

表1:不同浓度NAA对丹参叶片形成愈伤的影响

上述实验证明低浓度的2,4-D(低于0.8mg/L)愈伤生长后期会长出许多透明状须根,而高浓度的2,4-D(高于0.8mg/L)15天后观察形成的愈伤褐化现象比较严重。

表2:不同浓度2,4-D对丹参叶片形成愈伤的影响

此外,为了更好达到实验效果,本发明将6-BA、NAA、2,4-D组合使用形成不同浓度配比,14天后观察愈伤形成情况,结果表明6-BA浓度为1.0mg/L,NAA浓度为0.8mg/L,2,4-D浓度为0.8mg/L混合使用时,形成愈伤效果最好。

表3:不同浓度激素组合对丹参叶片形成愈伤的影响

外植体培养结果:

表4:外植体愈伤组织诱导工艺优化前后培养结果

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

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