本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种中药粉防己的组培快繁方法。
背景技术：
粉防己(stephaniatetrandras.moore)又名石蟾蜍、汉防己、白木香，为防己科千金藤属多年生落叶藤本植物，生于山坡、丘陵地带的草丛及灌木林缘。粉防己是常用重要中药，以根入药，其味苦，性寒，有利水消肿、祛风止痛之功效，主治水肿鼓胀、手足挛痛、湿热脚气、癣疥疮肿、高血压等症。粉防己碱(tetrandrine)和防己诺林碱(fangchinoline)为粉防己主要药效成分，它们的含量是粉防己相关药品质量控制的主要检测指标。近期研究表明，粉防己碱在抗癌方面也有突出表现。粉防己属野生品种，分布于江西、安徽、浙江、湖北、湖南、福建、广东、广西等地。粉防己块根生长慢，更新周期长，一株野生植株采挖后，留下的残根断茎要在地下生长8-10年才可进行第二次采挖，再生非常困难。由于连年掠夺性采挖，各产地野生资源已严重萎缩，目前主要由江西、安徽提供粉防已药材，其它产地供应量已逐渐消失或产出量甚微。
目前，对于粉防己的研究主要集中在其药效学、化学成分及其提取物含量测定方法等方面，资源评价及人工种植技术的相关研究开展较少，要想进行人工种植，首要解决的问题就是优良种质的选育、繁育和栽培技术问题。粉防己雌雄异株，相关研究表明，由于野生粉防己分布较散，所以野生条件下，雌株授粉较难，很难生成果实，因此采用种子繁殖难以扩大种植。而常规的扦插繁殖存在周期长、繁殖系数低等缺点，因此建立粉防己的组培快繁方法显得尤其迫切。目前，国内外尚未有粉防己组织培养技术的报道，也未有粉防己组培快繁专利的申请。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种中药粉防己的组培快繁方法，选择粉防己带节茎段为外植体，经诱导培养、增殖培养、生根培养以及移栽等步骤，其诱导率达到了90％以上，移栽成活率达到了90％以上，实现了粉防己的组培快繁，从而实现了本发明的目的。
本发明提供的技术方案为：一种中药粉防己的组培快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取粉防己的外植体、外植体诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽；所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：wpm培养基、1.5～2mg/lzt(玉米素)、0.2～0.4mg/lga(赤酶素)、10～20mg/lch(水解酪蛋白)、25～30g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂、100～500mg/lpvp(聚乙烯吡咯烷酮)，ph为5.6～5.9。
在上述的中药粉防己的组培快繁方法中，所述的外植体诱导培养操作的方法为：将采集得到的作为外植体的粉防己消毒后剪切成2.0～2.5cm的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养40～45天即可诱导形成不定芽。
在上述的药粉防己的组培快繁方法中，所述的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：wpm培养基、1.5～2.5mg/lkt(激动素)、0.5～1.0mg/lga(赤酶素)、20～30g/l蔗糖、3.5～4.0g/l琼脂、50～100mg/lpvp(聚乙烯吡咯烷酮)，ph为5.6～5.9。
在上述的中药粉防己的组培快繁方法中，所述的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养得到的不定芽切成长1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养30～35天即可实现不定芽的增殖。
在上述的中药粉防己的组培快繁方法中，所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：white培养基、10～20mg/lch(水解酪蛋白)、0.5～1.0mg/l6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)、15～25g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂、50～100mg/lpvp(聚乙烯吡咯烷酮)，ph为5.4～5.8。
在上述的中药粉防己的组培快繁方法中，所述的生根培养操作的方法为：从增殖培养得到增殖后的不定芽的基部切取2.0～3.0cm不定芽并接种到生根培养基中培养30～35天即能实现试管苗的生根。
在上述的中药粉防己的组培快繁方法中，所述的移栽操作的具体方法为：将经生根培养操作得到的根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:2的腐殖土、泥炭土、河沙混合基质中栽培成苗即得粉防己种苗。
在上述的粉防己的组培快繁方法中，增殖培养操作、生根培养操中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为12～14小时/天。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明选择野生粉防己新生茎段为外植体，通过筛选和优化不定芽诱导、不定芽增殖、生根培养等过程的培养基配方和培养条件，经诱导、继代、生根以及移栽等步骤，实现了粉防己的快速繁殖。本发明具有诱导率高、繁殖系数高、种苗品质好、成本低、种苗生长一致等特点。
2.本发明采用植物组织培养技术建立了粉防己的组培快繁，可直接用于粉防己种苗的工厂化生产，对于促进粉防己的推广种植和保护野生粉防己植物资源具有重大意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例一
(1)外植体采集：在广西防城港市野外选取生长健壮、无明显病害的粉防己植株中上部、光照充足的带节茎段为外植体，采集后保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：将步骤(1)采集回实验室的外植体用自来水下冲洗8小时，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒30秒钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.5％的次氯酸钠溶液中消毒25分钟，无菌水冲洗10次后用无菌滤纸吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养40天即可诱导形成不定芽，诱导率达95％。所述的诱导培养基为：wpm培养基、2mg/lzt、0.4mg/lga、20mg/lch、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂、500mg/lpvp，ph为5.6。
(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养30天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到5.5倍。所述的增殖培养基为：wpm培养基、2.5mg/lkt、1.0mg/lga、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂、100mg/lpvp，ph为5.6。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培30天即能实现试管苗的生根，生根率达到95.8％。所述的生根培养基为：white培养基、20mg/lch、1.0mg/l6-ba、25g/l蔗糖、4.0g/l琼脂、100mg/lpvp，ph为5.4。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:2的腐殖土、泥炭土、河沙混合基质中栽培成苗即得粉防己种苗，移栽30天后成活率达到95％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为3000lx，光照时间为14小时/天。
实施例二
(1)外植体采集：在广西玉林市野外选取生长健壮、无明显病害的粉防己植株中上部、光照充足的带节茎段为外植体，采集后保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：将步骤(1)采集回实验室的外植体置于自来水下冲洗4小时，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒25秒钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.5％的次氯酸钠溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养42天即可诱导形成不定芽，诱导率达到92％。所述的诱导培养基为：wpm培养基、1.8mg/lzt、0.3mg/lga、15mg/lch、28g/l蔗糖、3.5g/l琼脂、300mg/lpvp，ph为5.7。
(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养32天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到5.0倍。所述的增殖培养基为：wpm培养基、2.5mg/lkt、1.0mg/lga、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂、100mg/lpvp，ph为5.6。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养32天即能实现试管苗的生根，生根率达到93.0％以上。所述的生根培养基为：white培养基、20mg/lch、1.0mg/l6-ba、25g/l蔗糖、4.0g/l琼脂、100mg/lpvp，ph为5.4。(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:2的腐殖土、泥炭土、河沙混合基质中栽培成苗即得粉防己种苗，移栽30天成活率达到93％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为27℃，光照强度为2800lx，光照时间为13小时/天。
实施例三
(1)外植体采集：在广西梧州市野外选取生长健壮、无明显病害的粉防己植株中上部、光照充足的带节茎段为外植体，采集后保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：将步骤(1)采集回实验室的外植体置于自来水下冲洗4小时，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒20秒钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.5％的次氯酸钠溶液中消毒18分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃全黑暗培养45天即可诱导形成不定芽，诱导率达到90％。所述的诱导培养基为：wpm培养基、1.5mg/lzt、0.2mg/lga、10mg/lch、25g/l蔗糖、3.0g/l琼脂、100mg/lpvp，ph为5.9。
(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1.5～2.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养35天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到4.5倍。所述的增殖培养基为：wpm培养基、1.5mg/lkt、0.5mg/lga、20g/l蔗糖、3.5g/l琼脂、50mg/lpvp，ph为5.9。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养35天即能实现试管苗的生根，生根达到90.0％以上。所述的生根培养基为：white培养基、10mg/lch、0.5mg/l6-ba、15g/l蔗糖、3.0g/l琼脂、50mg/lpvp，ph为5.8。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:2的腐殖土、泥炭土、河沙混合基质中栽培成苗即得粉防己种苗，移栽30天后成活率达90％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2500lx，光照时间为12小时/天。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。