本发明属于植物栽培技术，具体涉及一种快速繁殖闹羊花组培苗的方法。
背景技术：
：闹羊花为杜鹃花科闹羊花属植物rhododendronmolleg.don，又名羊踯躅，羊踯躅华，羊踯躅花，玉枝，羊不吃草，羊不食草，搜山虎，老虎花等，分布于我国长江流域至南部各地，生长于山坡、灌丛或草丛中。闹羊花以花入药，每年四、五月花初开时采收，阴干或晒干后入药。《中国药典(2015版)》记载，闹羊花味辛，性温；有大毒。归肝经。具有祛风除湿，散瘀定痛之功效。用于风湿痹痛，偏正头痛，跌扑肿痛，顽癣。用量0.6～1.5g，浸酒或入丸散，外用适量，煎水洗。因闹羊花易引起严重的不良反应，所以不宜多服、久服；体虚者及孕妇禁用。闹羊花虽有毒，但对治疗风湿痹痛，偏正头痛，跌扑肿痛，顽癣有很好的疗效，本发明通过组织培养的方法可一年四季不间断提供闹羊花种苗，满足药农种植需求。技术实现要素：发明目的：针对上述现有技术，本发明提供一种规模化高效繁殖闹羊花组培苗的方法。技术方案：本发明所述的一种快速繁殖闹羊花组培苗的方法，包括以下步骤：(1)从闹羊花塑果中剥取出种子，搓揉去除膜质翅，清洗消毒，备用；(2)将步骤(1)得到的闹羊花种子播种于固体培养基中，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养30～40d，种子萌发形成1～2cm的幼弱的小苗，取小苗备用；(3)将步骤(2)得到的小苗在超净工作台上转移到增殖培养基，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养45～60d，小苗长至2～3cm，并形成多个分枝，将形成的分枝从小苗上切下，重新接入新的增殖培养基，继续增殖培养，直到种苗量达到需求，便可进行壮苗生根培养；(4)将步骤(3)中得到闹羊花小苗转接到壮苗生根培养基中，在25～28℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下培养50～60d，苗长至4～5cm，根2～3根时可进行移栽；(5)将步骤(4)得到的成苗移至有外遮荫的大棚温室苗床上，温度控制在25～30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行驯化培养，驯化10d左右得到成苗，将苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，移栽入基质上。步骤(1)中，所述清洗消毒是指：用纱布袋包裹种子并扎好袋口，置于流水中冲洗10min，用去污剂清洗10min，再用流水冲洗20min，挤干水分带入超净工作台，在超净工作台上，酒精浸泡45～60s，消毒剂浸泡6～8min，无菌水冲洗5～7次。然后剪开纱布袋，用镊子夹出种子。其中，所述去污剂是指家用洗衣粉，所述酒精体积百分浓度为70％～75％，优选75％。所述消毒剂是指质量百分含量为0.1％～0.15％的氯化汞。步骤(2)中，所述的固体培养基组成为：萘乙酸(naa)0.1～0.5mg/l+土豆汁60～80g/l+蔗糖25～30g/l+琼脂6～8g/l+改良ms培养基+ph5..4～5.6。优选的，所述的固体培养基组成为：萘乙酸(naa)0.2mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l+改良ms培养基+ph5.4。步骤(3)中，所述的增殖培养基组成为：萘乙酸(naa)0.1～0.3mg/l+6苄氨基嘌呤(6～ba)0.5～1.0mg/l+玉米素(zt)0.1～0.5mg/l+土豆汁60～80g/l+蔗糖25～30g/l+琼脂6～8g/l+改良ms培养基+ph5.4～5.6。优选的，所述的继代增殖培养基组成为：萘乙酸(naa)0.2mg/l+6～苄氨基嘌呤(6～ba)0.8mg/l+玉米素(zt)0.3mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l+改良ms培养基+ph5.4。步骤(4)中，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸(naa)0～0.3mg/l+香蕉泥60～80g/l+蔗糖25～30g/l+white培养基+琼脂6～8g/l+ph5.4～5.6。优选的，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸(naa)0.2mg/l+香蕉泥80g/l+蔗糖25g/l+white培养基+琼脂8g/l+ph5.4。本申请中，所述改良ms培养基是指ms培养基中kno3含量调整为480mg/l，nh4no3含量调整为400mg/l。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)闹羊花种子较小，有膜状翅，采用搓揉的方法去除膜状翅，并用纱布袋包裹消毒，相比现有消毒方法，种子消毒更彻底，损失少，便于接种。(2)闹羊花种子消毒后，将种子播散到步骤(2)中的固体培养基中，采用改良ms并配以适当的激素和添加天然附加物土豆汁，与现有的种子萌发培养基相比，该方法种子萌发时间大大缩短至20～30d，并且萌发率高达90％以上，变异率小于1％，出芽整齐。(3)步骤(3)所述的继代增殖培养基中，采用改良ms并配以适当的激素和天然附加物，与传统的继代增殖培养基相比，该方法能更好更快的促进小苗的生长和分枝，增殖系数可达到4～5。(4)步骤(4)所述的壮苗生根培养基中，采用white培养基并配合适当的激素与天然附加物，与传统的壮苗生根培养基相比，该方法能更好促进小苗迅速生根且根较粗壮。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例1：一种高效繁殖闹羊花试管苗的方方法，该方法包括以下步骤：(1)从闹羊花塑果中剥取出种子，通用搓揉去除膜质翅，用纱布袋包裹种子并扎好袋口，置于流水中冲洗10min，用去污剂清洗10min，再用流水冲洗20min，挤干水分带入超净工作台，在超净工作台上，用75％酒精浸泡45～60s，0.1％升汞浸泡6～8min，无菌水冲洗5～7次。然后剪开纱布袋，用镊子夹出种子，备用。(2)将步骤(1)得到的闹羊花种子播种于固体培养基中，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养30～40d，种子萌发形成1～2cm的幼弱的小苗，取小苗备用；其中，所述的固体培养基组成为：萘乙酸(naa)0.2mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l+改良ms培养基+ph5.4；(3)将步骤(2)得到的小苗在超净工作台上转移到增殖培养基，在22～25℃、光照度500～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，培养45～60d，小苗长至2～3cm，并形成多个分枝，将形成的分枝从小苗上切下，重新接入新的增殖培养基，继续增殖培养，直到种苗量达到需求，便可进行壮苗生根培养，其中，所述的增殖培养基组成为：萘乙酸(naa)0.2mg/l+6苄氨基嘌呤(6～ba)0.8mg/l+玉米素(zt)0.3mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l+改良ms培养基+ph5.4；(4)将步骤(3)中得到闹羊花小苗转接到壮苗生根培养基中，在25～28℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下培养50～60d，苗长至4～5cm，根2～3根时可进行移栽，其中，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸(naa)0.2mg/l+香蕉泥80g/l+蔗糖25g/l+white培养基+琼脂8g/l+ph5.4；(5)将步骤(4)得到的成苗移至有外遮荫的大棚温室苗床上，温度控制在25～30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行驯化培养，驯化10d左右得到成苗，将苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，移栽入基质上。实施例2与实施例1基本相同，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中闹羊花种子萌发、小苗继代增殖、壮苗生根分别以表1、表2和表3中所列各因子及水平进行正交设计进行筛选，通过正交设计分析优选出最适培养基组合。表1、表2、表3说明如下：①本实例中均设计成固体培养基，每种配方中琼脂浓度均为8g/l，种子萌发和小苗增殖阶段蔗糖为30g/l，壮苗生根阶段蔗糖浓度为25g/l，培养环境为温度25℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间12h/d培养室内。②种子播种阶段主要观察种子萌发的快慢、长势、颜色(翠绿为佳)等指标判断配方是否合理；继代增殖阶段主要观察小苗分枝情况(越多越好)、玻璃化程度、种苗健壮程度等指标判断配方是否合理；壮苗生根培养阶段，主要通关观察苗的生长势、生根速度、玻璃化程度(越低越好)、颜色等指标来判断配方的好坏。通过观察和各项指标的测定，对各阶段各因素、水平组合给予附分，分值为0～10分。表1闹羊花种子萌发各因素、水平l934正交设计分析结果表2闹羊花增殖培养各因素、水平l1645正交设计分析结果表3闹羊花生根培养各因素、水平l934正交设计分析结果从表1中可以看出，基本培养基r值大于其他因子，说明基本培养基对闹羊花种子萌发的影响最大，综合分析，基础培养基因子k2>k3>k1，即改良ms优于wpm优于ms，因此在种子萌发阶段，最佳的基础培养基为ms，同理，在种子萌发阶段，最佳的naa水平为0.2mg/l，6～ba为0mg/l，土豆汁为80g/l，因此，闹羊花种子萌发的最优培养基组合为改良ms+naa0.2mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l，ph5.4；分析方法同上，从表2中可以看出，基本培养基和naa的r值略大于其他因子，但差异不大，说明在闹羊花增殖培养中各因子都对闹羊花增殖有影响，闹羊花增殖培养的最优培养基组合为改良ms培养基+naa0.2mg/l+6～ba0.8mg/l+zt0.3mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l，ph5.4；从表3中可以看出，基本培养基r值大于其他因子，说明基本培养基对闹羊花壮苗生根的影响最大，闹羊花壮苗生根的最适培养基为white培养基+naa0.2mg/l+香蕉泥80g/l+蔗糖25g/l+琼脂8g/l，ph5.4。实施例4为更好验证本配方的有益效果，将本配方与传统配方进行比较。(1)种子萌发，①为传统配方，配方为ms+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l，ph5.4，②为新配方，配方为改良ms+naa0.2mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖80g/l+琼脂8g/l，ph5.4，消毒后常规播种，以萌发率达60％所需的时间为平均萌发时间，60d后统计总萌发率。表4种子萌发新配方与传统配方对种子萌发的影响(2)小苗增殖，①为传统配方，配方为ms+naa0.1mg/l+6～ba1.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l，ph5.4，②为新配方，配方为改良ms培养基+naa0.2mg/l+6～ba0.8mg/l+zt0.3mg/l+土豆汁80g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l，ph5.4，将种子萌发获得的小苗转接到新的培养基，每瓶接种6株，60d后将小苗长出的分枝剪成带2个节的小段，重接接种新的培养基，每瓶接种6个茎段，统计增殖率。表5增殖阶段传统配方与新配方对小苗增殖的影响序号初始接种瓶数60d后增殖瓶数平均增殖率种苗生长情况15122.4苗高1～2cm，叶色淡绿，分枝较少25173.4苗高2～3cm，叶色浓绿，分枝较多(3)生根培养①为传统配方，配方为1/2ms+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l，ph5.4，②为新配方，配方为white培养基+naa0.2mg/l+香蕉泥80g/l+蔗糖25g/l+琼脂8g/l，ph5.4，将增殖后的小苗接入新的培养基，每瓶接种6株，每配方接种5瓶，50d后统计生根数及种苗生长情况。表6生根阶段传统培养基与新增养基对小苗生根壮苗的影响序号平均根系种苗生长情况11.8苗高2～3cm，叶色淡绿，根系较弱22.4苗高3～4cm，叶色浓绿，根系粗状当前第1页12