一种新型冠状病毒N蛋白提取保存液及其制备方法和应用与流程

本发明属于体外诊断领域，涉及一种新型冠状病毒n蛋白提取保存液及其制备方法和应用。

背景技术：

为了满足疫情防控需要，提升便捷程度，提高检测准确度，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查，需要快速进行核酸、抗体和抗原的快速检测试剂的开发，同时为提高检测的准确性，样本提取的后处理及保存显得尤为重要。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种新型冠状病毒n蛋白提取保存液及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种新型冠状病毒n蛋白提取保存液，1l新型冠状病毒n蛋白提取保存液包括以下各组分：

余量为缓冲液。

在本发明的一个具体方案中，其中所述缓冲液选自tris-hcl缓冲液、pb缓冲液和巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种。

在本发明的一个具体方案中，其中所述缓冲溶液的浓度范围为0.005～0.1m。

在本发明的一个具体方案中，其中所述缓冲溶液的浓度范围为0.01～0.05m，通过该浓度的缓冲溶液处理后，大部分病毒细胞发生破裂，新冠病毒细胞内部n蛋白裸露程度增加。

在本发明的一个具体方案中，其中所述缓冲溶液的浓度为0.02m，通过该浓度的缓冲溶液处理后，病毒细胞发生破裂几乎全部破裂，新冠病毒细胞内部n蛋白裸露程度增加，提高检测结果的准确度。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种新型冠状病毒n蛋白提取保存液的制备方法，包括以下步骤：将配方量的酪蛋白、抗生素、牛血清白蛋白、乙基苯基聚乙二醇、抗红细胞单克隆抗体、生物防腐剂和缓冲液混合均匀，即得所述新型冠状病毒n蛋白提取保存液。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种新型冠状病毒n蛋白提取保存液的使用方法，包括以下步骤：在塑料软管、样品杯或试剂杯中加入0.2～2ml提取保存液，将采集的样本加入到上述提取保存液中，混合均匀后，将含有样本的提取保存液在2～8℃下保存或者直接取30～100μl用于免疫检测。

在本发明的一个具体方案中，其中所述样本选自鼻拭子、咽拭子、口腔拭子、唾液、痰液或肺泡灌洗液中的一种。

在本发明的一个具体方案中，其中所述免疫检测选自化学发光、酶联免疫、免疫层析、磁微粒化学发光、电化学免疫和质谱免疫中的一种。

本发明的有益效果为：

1、本发明所提供的新型冠状病毒提取保存液，其对鼻拭子、咽拭子、口腔拭子、肺泡灌洗液、痰液、唾液等不同样本具有较好的兼容性，为病毒样本提供了一个合适稳定的缓冲环境，利于样本检测和保存；并且样本加入该提取保存液中，无需将样本洗涤和重新提取，直接可用于检测。

2、本发明所提供的新型冠状病毒提取保存液，其能够降低检测过程中的非特异性吸附，进而提高检测灵敏度和特异性。

3、本发明所提供的新型冠状病毒提取保存液，其通过利用渗透压使新型冠状病毒细胞吸水肿胀破裂，以将新型冠状病毒n蛋白从细胞内充分暴露出来，进而可以通过检测个体样本中新型冠状病毒n蛋白的含量进行新型冠状病毒肺炎诊断，并能进一步提高检测结果的灵敏度和准确性。。

附图说明

图1为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析试纸条示意图；

图2a为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析检测卡中一种上盖的内部结构示意图；

图2b为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析检测卡中一种底槽的内部结构示意图；

其中，1-包被垫，2-标记物垫，3-吸水垫，4-质控线，5-检测线，6-标记物结合处，7-样品垫，8-上盖，9-底槽，10-加样孔，11-观察窗，12-试纸条放置区域，13-定位柱，14-定位孔，15-第一限定部，16-第二限定部，17-第三限定部。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。

实施例1新型冠状病毒n蛋白提取保存液的配制

几种1l新型冠状病毒n蛋白提取保存液的配制如表1所示。

牛血清白蛋白

表1

0.2mna2hpo4缓冲溶液和0.2mnah2po4缓冲溶液的配制如下表2所示。

表2

0.01mpb缓冲溶液的配制如下表3所示。

表3

0.02mpb缓冲溶液的配制如下表4所示。

表4

0.05mpb缓冲溶液的配制如下表5所示。

表5

0.1mpb缓冲溶液的配制如下下表6所示。

表6

0.15mpb缓冲溶液配制如下表7所示。

表7

实施例2新型冠状病毒n蛋白免疫层析检测试剂盒的制备

1)采用荧光微球标记另一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体

取0.5ml荧光微球加入1mg碳化二亚胺(edc)，1mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μl另一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mgbsa封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照12000r/min的转速离心20min，除去上清液。最后，用0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1ml，再加入1μl的proclin300在4℃下保存待用。

2)采用荧光微球标记兔igg多克隆抗体

取0.5ml荧光微球加入1mg碳化二亚胺(edc)，1mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μlmg羊兔igg多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mgbsa封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)将固体沉淀物复溶至1ml，再加入1μl的proclin300在4℃下保存待用。

3)包被垫的制备

将一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)稀释成1mg/ml，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(nc膜)上进行划膜。含有一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的作为检测线(t线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(c线)4，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫1。

4)标记物垫的制备

①将玻璃纤维素膜在0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中浸泡6h，然后在35℃下干燥8h，备用。

②将摩尔比为1:1的荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔igg标记的荧光乳胶微球混合均匀后，按照10μl/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫2。标记物垫2上包被有荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔igg的地方叫做标记物结合处6。

5)免疫层析检测试剂盒的组装

首先在pvc板(图中未示出)上粘接包被垫1，然后在靠近包被垫1上的质控线4的一端搭接吸水垫3，在靠近包被垫1的检测线5的一端搭接标记物垫2及其连接的样品垫7，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1)，将试纸条放入卡壳中制备成新型冠状病毒n蛋白免疫层析检测试剂盒。

所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图2所示)可以包括：底槽12，其连接于所述pvc板；上盖8，其连接于所述底槽9，所述上盖8上设置有用于向所述样品垫7上加样的加样孔10；观察窗11，其设置于上盖8上，用于检测线5和质控线4的数据采集。

如图2b所示，所述底槽9包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔14，多个所述定位孔14之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部15以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部16；对称设置的所述第一限定部15与所述第二限定部16围设成试纸条放置区域12(虚线区域)，用于放置试纸条；

如图2a所示，所述上盖8包括：与多个所述定位孔14相配合的多个定位柱13，这样配合使用以将上盖8和底槽9固定在一起；所述上盖8还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部17。

所述包被垫1的上方设有用于数据采集的观察窗11，以露出全部所述检测线5和质控线4，用于收集其检测结果；且所述观察窗11开设于所述上盖8上与试纸条放置区域12的中部相对应的位置。所述上盖8在与所述样品垫7相对应的位置处开设有加样孔10，以用于样品垫7上滴加样本。所述检测线5距离加样孔15-25mm。

实施例3检测

收集13例确诊新型冠状病毒肺炎患者的咽拭子样本，分别用实施例1中制备的a、b、c、d、e5种新型冠状病毒n蛋白提取保存液处理样本，具体处理方式为：将采集咽拭子样本后的棉棒浸在提取保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧多次，使提取保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到提取保存液中)的液体即为待测样本。然后取60μl待测样本采用实施例2所述的新型冠状病毒n蛋白免疫层析试剂盒进行检测，将待测样本滴加到试剂盒加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本t/c值，通过与正常值范围判断阴阳性；或者当在紫外灯照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性，检测结果如下表8中所示。

表8

从表8中可以看出，13例新型冠状病毒阳性患者的咽拭子样本经提取保存液a处理后，其中11例检测为阳性，阳性检出率为84.6％；13例新型冠状病毒阳性患者的咽拭子样本经提取保存液b处理后，其中11例检测为阳性，阳性检出率为84.6％；13例新型冠状病毒阳性患者的咽拭子样本经提取保存液c处理后，其中9例检测为阳性，阳性检出率为69.2％；13例新型冠状病毒阳性患者的咽拭子样本经提取保存液d处理后，其中6例检测为阳性，阳性检出率为46.1％；13例新型冠状病毒阳性患者的咽拭子样本经提取保存液e处理后，其中1例检测为阳性，阳性检出率为7.6％。由此可以看出，通过逐渐降低缓冲液的摩尔浓度，使得检测的准确性逐渐提高。这是由于当新型冠状病毒细胞内渗透压大于外界环境时，缓冲溶液中的水会逐渐向细胞内部扩散，当超过细胞膜的最大承受能力时，会使细胞发生破裂，使得新型冠状病毒n蛋白从细胞内充分暴露出来，进而能够提高检测结果的准确性。从表8中测得t/c数据可以看出，当缓冲液浓度为0.15m时，t/c很低，说明此时病毒细胞内外渗透压相当，几乎不发生破裂；当缓冲液浓度为0.1m和0.05m时，t/c值逐渐增大，说明病毒细胞大部分发生破裂；当缓冲液浓度为0.02m和0.01m时，t/c值相当，说明病毒细胞已经完全破裂，新型冠状病毒n蛋白充分暴露出来，进而进一步提高检测结果的准确度准度。

实施例4

1、1l新型冠状病毒n蛋白提取保存液的配制如表9所示。

表9

2、收集9例确诊新型冠状病毒肺炎患者的鼻拭子样本，分别用实施例4步骤1中制备的提取保存液处理样本，具体处理方式为：将采集鼻拭子样本后的棉棒浸在提取保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧多次，使提取保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到提取保存液中)的液体即为待测样本。然后取60μl待测样本采用实施例2所述的新型冠状病毒n蛋白免疫层析试剂盒进行检测，将待测样本滴加到试剂盒加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本t/c值，通过与正常值范围判断阴阳性；或者当在紫外灯照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性，检测结果如下表10中所示。

表10

从表10的临床检测数据可以看出，9例新型冠状病毒阳性样本经样本提取液处理后5例检测为阳性，4例检测为阴性，阳性检出率为55％；9例新型冠状病毒阳性样本经0.05mpb缓冲溶液处理后3例检测为阳性，6例检测为阴性，阳性检出率为33％，表明经样本提取液处理后能够提高检测结果的准确性。

实施例5

1、1l新型冠状病毒n蛋白提取保存液的配制如表11所示。

表11

2、收集9例确诊新型冠状病毒肺炎患者的咽拭子样本，分别用实施例4步骤1中制备的提取保存液处理样本，具体处理方式为：将采集咽拭子样本后的棉棒浸在提取保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧多次，使提取保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到提取保存液中)的液体即为待测样本。然后取60μl待测样本采用实施例2所述的新型冠状病毒n蛋白免疫层析试剂盒进行检测，将待测样本滴加到试剂盒加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本t/c值，通过与正常值范围判断阴阳性；或者当在紫外灯照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性，检测结果如下表12中所示。

表12

从表12的临床检测数据可以看出，9例新型冠状病毒阳性样本经样本提取液处理后6例检测为阳性，3例检测为阴性，阳性检出率为67％；9例新型冠状病毒阳性样本经样本提取液处理后4例检测为阳性，5例检测为阴性，阳性检出率为44％，表明经样本提取液处理后能够提高检测结果的准确性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。